发红霉素酵工艺优化

_ 研发聚焦 中国科技成果＼20o7年＼第13期＼编辑＼章廉＼E--mail：zhl@rata． g．cn 摘 要：对红霉素发酵工艺进行了优化研究。在选用廉 价的A粉和B粉代替原发酵培养基中的淀粉及部分葡萄糖和 豆饼粉，确定了最佳发酵培养基配方的基础上，考察 了发酵 温度、pH、接种量、种龄和溶解氧等因素对红霉素发酵的影 响，确定了最佳发酵工艺。经10吨发酵罐连续6批验证，平 均发酵单位提高1 5．9％，产品质量全部合格，原 材料 关于××同志的政审材料调查表环保先进个人材料国家普通话测试材料农民专业合作社注销四查四问剖析材料 消耗成 本可降低 26％，具有较高的经济效益和社会效益。 关键词 ：红霉素；发酵工艺；优化 红霉素 (ErythromTcin)是大环内酯类抗生素，抗菌谱 与青霉素G相似，临床上常用于对青霉素过敏的患者。近年 来由于红霉素及其衍生物的广泛使用，导致红霉素的需求量 大幅增加。我国虽然从上世纪 60年代开始红霉素工业化生 产，但发酵水平不高，与发达国家相比差距较大，生产利润 很低。为了降低生产成本，我们选用廉价的A粉和B粉作为 培养基的碳源、氮源，代替原工艺中的淀粉及部分葡萄糖和 豆饼粉，收到良好的效果【1】。 本研究在选用廉价的A粉和B粉代替原发酵培养基中的 淀粉及部分葡萄糖和豆饼粉，确定了最佳发酵培养基配方的 基础上，在摇瓶和3L自动发酵罐上考察了发酵温度、pH 接 种量、种龄和溶解氧等因素对红霉素发酵水平的影响，确定 了最佳发酵工艺，经10吨发酵罐连续试生产 6批验证，平均 发酵水平提高1 5．9％，产品质量全部合格，原材料消耗成本 可降低20％以上，具有较高的经济效益和社会效益。 1材料与方法 1．1菌种 红霉素链霉菌P-0437(StreptomToes erythreus)，本 实验室选育菌株。 1．2培养基 (％) 种子培养基 淀粉3．5、葡萄瞎3．0、豆饼粉3．0、 H4)29 ．5、 CaCO3 1．0、KH2PO40．05、MgSO4·7H2O0．025。 发酵培养基 A粉 3．0、B粉 4．5、豆饼粉 1．5、葡萄糖 1．2、(NH4)2sO40．15、CaCO30．6、豆油等。 1．3实验方法 1．3．1摇瓶培养 种子培养 冷冻管取红霉紊菌种接种于母斜面，35"C培 养7d，转种于子斜面，35"C继续培养7d后接种于一级种子瓶， 33"C、22Or／rein培养48～56h，转入二级种子瓶，33℃、220r／ rain继续培养26-30h。 发酵培养 将上培养好的二级种子接种于发酵瓶，29℃～ 31℃、220r／rain培养160h。摇瓶装液量为50m1／250m1，每 组结果均为 5只摇瓶的平均效价。 1．3．2 3L发酵罐培养 种子培养 同上的种子培养。 发酵培养 将上培养好的二级种子接种于 3L自动发酵 罐，控制发酵温度、pH、接种量、搅拌速度和溶解氧等条件， 1本研究得到河南省2005年科技攻关计划项目 (项目名称：红霉素发酵工艺优化研究及工业化生产应用，项目煽号 0524270055)资助。 2张金国，男，52岁，教授，研究方向：生物技术、微生物发酵制药。 维普资讯 http://www.cqvip.com 培养 160h。 1．4分析测定方法 (1)发酵液效价测定12]； (2)pH测定：用pH电极在线测定 ； (3)溶解氧测定：用溶氧电极在线测定 ； (4)菌丝浓度：用体积法，取发酵液10rrd 于离心沉淀管中，在30(X)r／min下离心 10min， 计算菌丝体百分比 (、r／ )。 (5)红霉素成品检验13]。 2 结果与讨论 2．1发酵条件优化 作为考察因素，分别将发酵基础条件改变 其中一种参数，其它条件不变。通过定时取样 分析，检测该条件下发酵液中菌丝浓度、红霉 素效价等参数。 2．1．1温度对红霉素发酵的影响 研发聚焦 ＼中国科技成果＼2007年＼第l13期 期缩短，发酵后期效价甚至下降。29"C对红霉素发酵最有利。 2．1．2 pH对红霉素发酵的影响 由不同的初始pH (6．6、6．9、7．2)对红霉素发酵的影 响试验结果见图2。 拿 暑 发酵时阚 - aI) 发群时阚 Th-∞ —．_．I揣 + I默 Ie'‘ ．--．4,-I私 + I，’‘ 18％ 圈 3 接种量对红霉素发酵的影响 在3升发酵罐中研究了温度 (27"C、29"C、31℃)对红 霉素发酵的影响，结果见图 1。 结果 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 明，三种不同的初始pH对菌体生长影响不大， 而对红霉素合成的影响较大，pH7．2时效价最低，pH6．9 时最好。 2．1．3 接种量对红霉素发酵的影响 接种量 (12％ 、15％ 、18％)对红 发群_t闻 西_Q1) 发群_t闻 奄一 Q1) -◆． ℃ —·一 ℃ —’-3I℃ -◆． ℃ —·一 ℃ ‘—一 3I℃ 圈1 温度对红霉素发酵的影响 从图1可知随着温度的升高，菌体生长速度加快，菌丝 浓度增加迅速，但温度过高菌体衰老自溶也快，红霉素分泌 40 5． 蕾 113 I，5 I∞ 霉素发酵的影响试验结果见图3。 从图3可见随着接种量增大，菌丝浓 度明显增加，18％接种量碳源和氮源的消 耗过快，菌体老化自溶也快，红霉素效价 前期增加较多，后期增加较缓；12％接种 量使菌种迟滞期延长，也影响了红霉素效 价；15％接种量在前期、中期效价虽然比 18％接种量低，但在1 12h后增长幅度加 快，发酵结束时效价最高，说明 15％接种 量最佳。 2．1．4 种龄对红霉素发酵的影响 种龄 (28h、32h、36h)对红霉素发酵的影响试验结果 见下页图4。 发I~l'gl oI) ~：lll,l'gl恤 oI) ●一 ‘五 —-一 ‘， 7．2 ●一 ‘‘ —-一 ‘， 7．2 圈2 pH对红霉素发酵的影响 从图4可见随着种龄增大，前期菌丝 浓度增加明显 ，效价也增加较多，但到 后期菌体老化 自溶也快 ，红霉素效价不 再增加；而 28h菌龄的种子虽然对发酵 过程中菌丝浓度影响不大，但红霉素效 价明显高于后二者，表明最佳种龄为 28h。 2．1．5溶解氧对红霉素发酵的影响 在3L发酵罐中，在通气量1：1vvm、 O O O O O O O 撕 棚雪茎撕棚o O O O O O O O O m 埘i耋 o ∞ jl 曲 却 璩 O 基^ l 量lqS。著 孳冀膏 鼍I嗣一 ∞ ∞ 曲 雒 罅 O 基^ 暑 薯曼吾口I星 薯 璐嗣■ 维普资讯 http://www.cqvip.com 圈 幕 V o 38 研发聚焦 中国科技成果＼2oo?年＼第13期＼ 发一对闽 拍_ QI) + + 卫h 3融 辜 鬈 掣 发一对闽 -QI) + + 卫h 3融 图4 种龄对红霉素发酵的影响 图5a溶解氧变化曲线 m O m 0 罩蛳o V m 0 薹：： G 0 O Io l5 墨 ∞ 墨 DO f’‘) 图5b溶解氧对红霉素发酵的影响 搅拌220／min、培养温度29℃条件下，红霉素发酵过程中溶 氧 (DO)变化见图5a。 从图5a可见，在红霉素发酵过程中，当培养至40～60h 时，发酵液中的溶氧量 (DO)达到最低值，表明在40～60h 时间段中菌体大量繁殖，耗氧量大幅增加。通过改变通气量、 调节搅拌转速控制该段时间的溶氧水平进行红霉素发酵，以 研究溶氧对红霉素发酵的影响，结果见图5b。从图5b可知， 当溶氧低于25％时，对红霉素生物合成有明显地抑制作用， 溶氧越低，发酵效价也就越低；当溶氧高于25％时，对红霉 素生物合成基本没有影响，表明只需将溶氧控制在 25％以 表 1 10t发酵罐试验结果 上，即可满足对红霉素生物合成的需要。 2．2 10吨发酵罐试验 控制发酵培养基初始pH6．9、接种量15％，控制发酵前 期温度31℃～32℃、40h后29℃，控制搅拌180～240r／min、 通气量1：0．8～1．5v／v／rain，使发酵过程中溶氧保持在25％ 以上，并于培养 36h后开始补加A粉和 B粉，在 10吨发酵 罐上连续试生产 6批 ，结果见表 1。 发酵罐批量试验结果表明，采用A粉和B 粉替代或部分替代原工艺中的淀粉及部分葡萄 糖和豆饼粉，用于红霉素发酵是可行的，通过 工艺优化，平均发酵单位达 6819．3u／m1，比 同期生产平均水平5882u／皿提高了1 5．9％，产 品质量全部合格，原材料消耗成本可降低 26％，具有较高的经济效益和社会效益。 在试验过程中，菌丝形态和主要生化指标 与原工艺相比均无明显差异，仅观察到使用A 粉和B粉的罐批，在发酵前期产生的泡沫较多， 适当控制搅拌和通气量可解决；在发酵后期很 少出现稀化，放罐时发酵液粘度明显增大，对 发酵单位提高、稳定和对发酵液的预处理非常 有利，其原因有待于进一步探讨。-_ 参考文献 【1】张金国，刘翔．红霉素发酵培养基优化 研究【J】．中国抗生素杂志，2006，31(7)：406- 407，416 【2】陈钧鸣，徐玲娣．抗生素工业分析【M】．北京 ：中国医 药科技出版社，1991：267 【3】国家药典委员会．中华人民共和国药典【S】． 二部 ． 北京 ：化学工业出版社，2000：262 【4】孙荣恒，伊亨云 ，刘群荪．数理统计【M】．重庆：重庆大 学出版社，2000：144 【5】俞俊棠，唐孝宣．生物工艺学 ( 上册 三年级上册必备古诗语文八年级上册教案下载人教社三年级上册数学 pdf四年级上册口算下载三年级数学教材上册pdf )【M】上海：华东 理工大学出版社 ，1991：107 O O O O O O O O 砷 啪 m枷m 抛 m 萼^ v 主 ∞ 秘 曲 秘 ∞ m O ^ 量 量ll I星 薯 爨嗣一 ∞ 伯 ∞ ∞ 们 ∞ 0 维普资讯 http://www.cqvip.com