低压缺氧对兔动脉粥样硬化斑块中胶原含量的影响

论 � 著 低压缺氧对兔动脉粥样硬化斑块中胶原含量的影响 张司兰1 ,徐立群1 ,韩 � 威2 ,陈世伟1 ,谢 � 凤1 ( 1.重庆市璧山县人民医院心血管内科 � 402760; 2.成都医学院医学检验系实验中心,成都 � 610083) � � �摘要 � 目的 � 观察低压缺氧对兔动脉粥样硬化斑块胶原含量的影响, 并对其机制进行初步探讨。 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 � 日 本大耳兔随机分为常氧对照组和低压缺氧组两组,高胆固醇饮食 12 周建立兔动脉粥样硬化 ( ather osclero sis, AS)病 变模型后,取主动脉内膜组织分别采用Woessner 法、western blot 法和实时荧光定量逆转录聚合酶链反应( RT� PCR)法检测斑块组织中胶原含量、人核转录因子( NF��B)蛋白、肿瘤坏死因子 ( T NF��)、白细胞介素 6逆转核糖核 酸( IL�6 mRNA)表达。结果 � 低压缺氧能明显降低斑块中胶原蛋白含量, 提高 NF��B 蛋白、TNF��和 IL�6 mRNA 表达(P< 0. 05)。结论 � 低压缺氧能明显降低斑块中胶原蛋白含量, 其机制可能与促进炎性反应, 升高 NF��B 蛋 白、TNF��及 IL�6 mRNA 表达有关。 �关键词 � 动脉粥样硬化; � NF��B; � 肿瘤坏死因子��; � 白细胞介素�6 DOI: 10. 3969/ j. issn. 1672�9455. 2010. 20. 004 中图分类号: R543. 5 文献标志码: A 文章编号: 1672�9455( 2010) 20�2183�02 Effects of hypobaric hypoxia on content of collagen in rabbit atherosclerotic plaques� ZH AN G S i�lan1 , X U Li�qun1 , H AN Wei 2 , CH EN S hi�wei1 , X I E Feng 1 . 1. D epar tment of Card iology , Bishan Peop le! s H osp ital , B isan Chongqing 402760, China; 2. Exp er imental Center , dep ar tment of Medical Laborator y , Chengd u Med ical College, Chengd u, Sichuan 610083, China �Abstract � Objective� T o study the effects of hypobar ic hypox ia on collag en content in ather osclero tic plaques of rabbit models and to init ially investig ate its mechanism. Methods � Rabbit athero sclerot ic models w ere set up by high�cholester ol diet. T he contents o f NF��B and collag en in plaque w ere det ected by Western blot and w oessner met hod, respectively . Expression lev els of T NF��, IL�6 mRNA w ere determ ined w ith r ea l�time PCR.Results � In hy� pobar ic hypox ia gr oup, collag en in ather osclero tic plaques w as decr eased markedly, TNF��, IL�6 mRNA and NF��B protein found in athero sclero tic plaques w ere elevat ed. Conclusion � H ypobaric hypoxia could decr ease the co llagen cont ent in r abbit ather osclero tic plaques, w hich may be concerned with its pr omo ting inflammator y action. �Key words � athero sclerosis; � NF��B; � tumor necr osis factor��; � inter leukin 6 � � 心血管疾病的发生率和死亡率逐年递增, 是目前导致人类 死亡的第一大原因。动脉粥样硬化( athero sclerosis, AS)及其 并发症在其中占有重要地位, AS 斑块不稳定及其破裂是导致 心脑血管事件的重要原因,不稳定斑块破裂后产生的一系列并 发症,引起心、脑血管栓塞,严重威胁患者生命安全[ 1]。斑块中 的胶原含量与斑块的稳定性密切相关,胶原是纤维帽的主要成 分之一,胶原含量越少, 纤维帽越薄 , 斑块越容易破裂[ 2]。目 前,低压缺氧与动脉粥样硬化形成的相互作用机制尚不清楚, 有关低压缺氧对动脉粥样硬化斑块稳定性的影响研究甚少。 本试验拟选取日本大耳兔为主要研究对象, 探讨低压缺氧对 AS 斑块中胶原含量的影响, 从而揭示低压缺氧与 AS 斑块稳 定性的关系。 1 � 材料与方法 1. 1 � 动物 � 日本大耳兔( SPF 级) , 雄性, ( 2. 0∀ 0. 2) kg ,第三 军医大学实验动物中心提供,许可证号: SYXK(军) 2002�029。 1. 2 � 试剂 � 小鼠抗兔 NF��B、3�磷酸甘油醛脱氢酶( GAPDH ) 一抗(美国 Santa公司) ,山羊抗小鼠二抗、DAB试剂盒(北京中 杉金桥生物技术公司 ) ; T rizol ( 德国 Roche 公司) , RNasin ( Takar a公司) , 逆转录试剂盒、实时荧光定量聚合酶链反应 ( RT�PCR)试剂盒为上海东洋坊科技有限公司产品。 1. 3 � 仪器 � 紫外分光光度计(上海亚研公司) , M iniBIS Pro 凝 胶成像系统(美国 Labnet) , L ightCycler #型实时荧光定量基 因扩增系统(德国 Roche 公司)。 1. 4� 方法 1. 4. 1 � 实验分组 � 日本大耳兔 10 只随机分为常氧对照组和 低压缺氧组两组。( 1) 常氧对照组 5 只: 高胆固醇饲料(含 1% 胆固醇、8%猪油和 7. 5%蛋黄粉的粗颗粒饲料) 150 g/ d[ 3]喂养 12 周。( 2) 低压缺氧组 5 只: 高胆固醇饲料 150 g / d 喂养 12 周,低压缺氧试验: 参照 Fagan[ 4] 的方法加以改进制作常压低 氧动物舱,模拟常压低压、低氧。压缩空气与混合气体 ( 90% N2+ 10% O 2)在电磁阀控制下分别以 2 L / min的流速输入低 氧舱,间隔 30 s, 循环 1次/分,每天 8 h,其余时间置饲养笼, 室 温、空气、正常摄食、摄水。低压缺氧试验过程中舱内混合气体 浓度由测氧仪检测,并随机采样送气体成分分析。对照组每天 同时置相同规格有机玻璃舱内, 空气输入, 无缺氧。各组实验 结束当天取标本。 1. 4. 2 � RNA 的提取及荧光定量逆转录聚合酶链反应 � 从血 管内膜上刮取约 30 mg 粥样组织,置于研磨钵中, 加入液氮研 磨,匀浆移入 1. 5 mL EP 管中, 加入 1 mL T rizol, 用加样枪吹 打混匀,室温静置 5 min,加入 0. 2 mL 氯仿, 摇匀, 室温下静置 15 min, 4 ∃ 10 000 g 离心 15 min, 将上层水相转移至新的离 心管中,加入等体积的异丙醇,摇匀, 室温下静置 10 min 后, 4 ∃ 10 000 r 离心 10 min, 弃上清液, 75% 乙醇清洗 2 次, 将 RNA 沉淀晾干,用 20 L 无 RNA 酶去离子水溶解, - 70 ∃ 保 %2183%检验医学与临床 2010年 10月第 7卷第 20期 � Lab Med Clin, October 2010, V ol . 7, No. 20 存待用。逆转录按试剂盒说明书进行。荧光定量聚合酶链反 应参见试剂盒说明书: 1 L cDNA 样本作为 PCR扩增模板, 阴 性对照扩增模板为去离子水;扩增条件为 94 ∃ 预变性 5 min; 随后 94 ∃ 30 s,退火温度 30 s, 72 ∃ 20 s, 共 35 个循环; 最后 72 ∃ 延伸 10 min。采用 Pr imer premier 5. 0 软件设计引物(表 1) ,引物由上海生工合成。 表 1 � 引物序列 基因 长度( b p) 上游引物 下游引物 退火温度( ∃ ) T NF�� 152 CTGCT GCACTT CAGGGT GATC ACTT GCGGGT TT GCTACT ACG 62. 0 !�act in 144 AGATT ACT GCCCTGGCTCCT AG CAT CCGT ACT CCTGCT TGCT GAT 59. 0 IL�6 170 GAAGAAGCCACCCT CAAGCC AAGCAAGGACACCCGCACT C 62. 0 1. 4. 3 � Woessner 法测定羟脯氨酸 � 从血管内膜上刮取粥样 组织,标本脱水、脱脂、烘干、称重,加 100 倍于样本量的 6 mo l/ L盐酸在 110 ∃ 分解 24 h, 旋转蒸发器去除盐酸,双蒸水溶解 残留物,加氯胺 T 溶液室温静置 20 min,加过氯酸溶液室温静 置 5 min, 加对苯胺基苯甲醛溶液在 60∃ 温箱加热 20 min, 取 出冷却后,在波长 560 nm 处测定吸光值。通过羟脯氨酸标准 曲线计算出待测液内的羟脯氨酸浓度,以此推算组织总胶原蛋 白含量[5]。 1. 4. 4 � Western�blot 法 � 从血管内膜上刮取粥样组织, 分别 提取各组细胞总蛋白,测定蛋白质浓度(考马斯亮蓝 G�250 染 料法 ) , 并进行 SDS�PAGE 蛋白电泳、转膜、封闭。加入一抗 ( Ras P21 蛋白或 GAPDH 单克隆抗体稀释度分别为 1& 1 000 和 1& 500)、二抗,最后进行化学发光显色, 显色带经扫描仪扫 描后用 BandScan 5. 0 软件进行灰度值半定量分析。以 GAP� DH 作内参照, R as P21 蛋白与 GAPDH 片段的条带光密度 ( IOD)比值为相对值分别进行比较。 1. 4. 5 � 统计学方法 � 所有数据以 x ∀ s 表示, 应用 SPSS 10. 0 专业统计学软件对数据进行统计学处理, 统计学方法采用 t 检 验,当 P < 0. 05 时认为有统计学意义。 2 � 结 � � 果 2. 1 � 低压缺氧对斑块中胶原含量的影响 � 本实验采用 Woessner 方法测定斑块中羟脯氨酸的含量, 从而推算出胶原 含量。结果常氧对照组胶原蛋白含量( 14. 58 ∀ 3. 15) mg / g , 低 压缺氧组( 10. 87 ∀ 1. 82) mg/ g, 两组比较,差异有统计学意义 ( P< 0. 05)。显示低压缺氧后明显降低了斑块中的胶原蛋白 含量,降低率为 25. 45% (P < 0. 05)。 2. 2 � 低压缺氧对斑块中 IL�6、T NF��mRNA 表达的影响 � 本 实验采用 RT� PCR分别检测了常氧对照组和低压缺氧组斑块 中 IL�6、TNF��mRNA的表达。结果如表 3所示 ,表明低压缺 氧后明显升高了斑块中 IL�6、TNF�� mRNA 的表达,分别升高 了 30. 43%、45. 16% ,差异有统计学意义(P< 0. 05)。 表 2 � 低压缺氧对斑块中 IL�6、T NF��mRNA � � 表达的影响( x ∀ s, n= 5) 组别 IL�6/!�act in T NF�a/!�act in 常氧对照组 0. 092 ∀ 0. 016 0. 031 ∀ 0. 005 低压缺氧组 0. 12 ∀ 0. 023* 0. 045 ∀ 0. 007* � � 注:与常氧对照组比较, * : P < 0. 05。 2. 3 � 低压缺氧对斑块中 NF��B 蛋白表达的影响 � 本实验采 用Western blot 法检测常氧对照组和低压缺氧组斑块中 NF� �B的表达。结果分别为常氧对照组: x ∀ s= 0. 045 ∀ 0. 008, 低 于缺氧组: x ∀ s= 0. 057 ∀ 0. 011。低压缺氧后, 明显升高了斑 块中 NF��B 的表达, 升高了 26. 67% 差异有统计学意义( P < 0. 05)。 3� 讨 � � 论 AS 不稳定斑块破裂后产生的一系列并发症, 引起心、脑血 管栓塞,严重威胁患者生命安全[ 6]。目前对斑块稳定性的研究 也越来越受到重视,但现有的研究绝大部分局限于对尸检标本 的研究,通过建立动物模型对此进行研究较少。兔是 AS 的易 感动物,采用高脂饲料喂养后一般8~ 12 周即可获得在腹主动 脉等大血管发生 AS 的动物模型。为此, 本研究选择兔作为低 压缺氧干预促进 AS 形成[7]的造模动物。胶原是纤维帽的主 要成分之一,纤维帽对斑块起保护作用,纤维帽越厚, 斑块越稳 定。破裂的 AS 斑块的纤维帽通常胶原含量较低, 能合成胶原 平滑肌细胞的数目也较少[ 8]。本实验研究发现, 低压缺氧会使 兔 AS 斑块中的胶原含量下降, 说明低压缺氧可以降低 AS 斑 块的稳定性。AS 斑块的稳定性除与血液流变学的改变有关 外,还与斑块内的成分密切相关, 斑块内的炎性反应因子可以 刺激平滑肌细胞、内皮细胞等产生基质金属蛋白酶, 有效降解 胶原和纤维帽内其他细胞外基质, 使纤维帽变薄, 纤维帽的不 断变薄将最终导致粥样斑块的破裂[ 9]。本研究发现, 低压缺氧 会升高兔 AS 斑块中的炎性反应因子 T NF��、IL�6 水平,其降 低斑块中胶原含量的机制可能与升高斑块中的炎性反应因子 水平有关。 参考文献 [ 1] Wong TY , K lein R, Amirul�Islam FM , et al. Three�yea r incidence and cumulative prevalence o f retinopathy : the athero sclerosis r isk in communities study [ J] . Am J Oph� thalmo l, 2007, 143( 6) : 970�976. [ 2] O rbe J, Fernandez L , Rodriguez JA , et al. Dif fer ent ex� pression o f M MPs/ T IMP�1 in human at her osclero tic le� sions. Relation to plaque features and vascula r bed[ J] . Athero sclero sis, 2003, 170( 2) : 269�276. [ 3] 袁志兵, 李晓辉,李淑惠, 等. 三七总皂苷改善兔动脉粥样 硬化斑块稳定性的机制探讨 [ J] . 中草药, 2006, 37( 5) : 741�743. [ 4] Fagan KA. Selected contribution: pulmonary hypertension in mice follow ing intermittent hypox ia [ J] . J Appl Physi� ol, 2001, 90( 6) : 2502�2507. [ 5] 永井裕, 藤本大三郎. 刘平. 胶原蛋白实验方法 [ M ] . 上 海: 上海中医学院出版社, 1992: 51. [ 6] 袁小媚, 马庆华.卡托普利和缬沙坦对大鼠心肌梗死后胶 原网络重塑的干预研究 [ J] . 重庆医学, 2006, 35( 15) : 1375�1377. � � � � � � � � � � � � (下转第 2186 页) %2184% 检验医学与临床 2010年 10月第 7卷第 20期 � Lab Med C lin, October 2010, Vol. 7, No. 20 远,特别是需要输液治疗而又不愿意住院的患者,每天到医院 完成治疗执行力度较差,特别是在患者病情有所缓解后因为工 作关系更难执行; ( 3)对于年长的患者,子女从父母的健康考虑 而不支持参加试验; ( 4)周围人群对临床试验的认识不够及大 众媒体的传播等。 3. 1. 3 � 药物因素 � 药物效果不明显, 不良反应的出现是受试 者脱落的重要原因[1]。另外,用药的方式如静脉用药需频繁返 院及疗程太长也是引起受试者脱落的重要原因。 3. 1. 4 � 研究者的工作态度 � 研究者缺乏严谨的科学态度, 在 患者入组前的解释不够, 健康教育做得不好, 对试验的重视不 够以及其他医护人员对待受试者态度恶劣或者冷漠, 易导致受 试病例的脱落。即使态度好,却不能解答受试者提出的各种问 题,或者解答问题不清楚, 也会动摇受试者的依从性[ 3]。 3. 2 � 减少受试者脱落的措施 3. 2. 1 � 合理宣传有关临床试验用药的相关知识 � 通过媒体使 更多的人了解临床试验,参与临床试验。加大临床药理基地的 严格审查,以达到科学的严谨性, 让患者感到安心。 3. 2. 2 � 做好受试者的筛查 � 研究者在为患者介绍试验的相关 内容时,要充分观察患者的反应, 初步评价患者的个人因素及 环境因素,尽可能选择依从性好的患者, 减少入组后的脱落, 以 利于提高工作效率。具体措施: ( 1)了解患者的基本信息,如职 业、学历、经济状况、居住地址等; ( 2)了解受试者既往用药史, 详尽地告知试验内容、疗程、用药 方案 气瓶 现场处置方案 .pdf气瓶 现场处置方案 .doc见习基地管理方案.doc关于群访事件的化解方案建筑工地扬尘治理专项方案下载 、参与试验的受益与风 险; ( 3)子女已经成年的患者,最好了解子女对父母参与临床用 药试验的态度,做好解释工作, 希望得到家人的支持,避免因子 女的反对而退出试验; ( 4)患者仔细阅读知情同意书后在无疑 问的情况下签字。 3. 2. 3 � 加强受试者依从性教育 � 研究者要采取多种方式对受 试者进行系统教育,让他们了解试验的目的和意义, 让受试者 了解按时、按量、按疗程用药有利于疾病的康复,定期随访有利 于掌握药物的不良反应,并让受试者知道药物临床研究始终是 将患者的安全和利益放在第 1 位,需要他们的配合。同时要交 代不遵医嘱可能会导致的后果。 3. 2. 4 � 改善相关环境 � 针对不愿住院而又需每天治疗的患 者,提供患者休息的场所, 在不违背试验方案的前提下,根据患 者情况合理安排治疗时间。因生活工作关系而不能及时随访 者,必要时上门服务留取标本。 3. 2. 5 � 出现不良反应的处理 � 任何药物都有不良反应, 因个 体差异少数病例会出现一些不良反应。在患者入组前研究者 要详细告知受试者用药过程中有可能出现的不良反应, 生活、 工作中应采取的注意事项,以及出现不良反应时的处理。切忌 签知情同意书时夸大药物疗效, 不交代药物可能出现的不良反 应。受试者在用药过程中若出现不良反应 , 研究者要正确面 对,积极处理, 仔细观察, 评价与药物的相关性, 根据受试者的 反应调整用药方案,避免因轻微的、正常的不良反应而随意停 药造成受试病例脱落。 3. 2. 6 � 加强研究人员的 培训 焊锡培训资料ppt免费下载焊接培训教程 ppt 下载特设培训下载班长管理培训下载培训时间表下载 � 严格遵循医学伦理道德,研究 人员对该临床试验要有充分的认识,熟悉整个试验方案,能正 确合理地解答患者的疑问,同时要求研究人员要与受试者建立 良好的医患关系,留取对方电话号码, 要关心受试者, 密切观察 受试者用药后的反应和疗效。在医生、护士和受试者之间形成 一个良性的信息反馈体系, 使受试者在试验过程中感到安全、 放心和被重视[4�5]。及时通知受试者随访, 并告知受试者用药 后疾病恢复情况, 若治疗效果欠佳, 应告知受试者需进一步检 查和治疗。作为一名研究者,要严格遵守医德医风, 尊重受试 者的人格和隐私权。 总之,要减少药物临床试验受试脱落病例, 首先要对受试 者的个人因素及环境因素作出良好的评价, 建立良好的医患关 系,研究者要本着对患者负责、对科研负责的科学态度密切观 察药物反应及疗效进行药物临床试验。只有这样, 受试者脱落 比例才会减低,才可以节约时间、经费,缩小试验规模。 参考文献 [ 1] 张君, 李国信, 张锡玮. 谈新药临床试验中受试者和研究 者依从性问题[ J] .辽宁中医杂志, 2005, 32( 8) : 854�855. [ 2] 卢根娣, 张鹭鹭. 药物临床试验中受试者的依从性管理 [ J] .解放军医院管理杂志 , 2008, 15( 3) : 293�294. [ 3] 汪朝晖, 杨忠奇,杜彦萍, 等. 谈药物临床试验中研究者依 从性的管理[ J] , 江西中医学院学报, 2009, 21( 1) : 20�22. [ 4] Chao D, Foy CG , Farmer D. Exer cise adherence among o l� der adults: challenges and st rateg ies[ J] . Contr ol Clin T ri� als, 2000, 21( 5) : 212�217. [ 5] 江俊珊, 曾星, 赖伟玲. 对接受 ∋期临床试验受试者的管 理体会[ J] .中国新药与临床杂志, 2007, 5( 19) : 132�134. (收稿日期: 2010�05�28) (上接第 2184页) [ 7] 严俊, 高钰琪,张恒, 等.低氧促进大鼠心脏成纤维细胞胶 原蛋白合成[ J] .第三军医大学学报, 2005, 31( 19) : 1918� 1920. [ 8] Cheung N, Bluemke DA , K lein R , et al. Retinal ar terio lar narr ow ing and left v entr icular remodeling : the multi�eth� nic st udy o f athero sclero sis[ J] . J Am Coll Cardiol, 2007, 50( 1) : 48�55. [ 9] V iles�Gonzalez JF, Fuster V, Badimon JJ. L inks between inflammation and thrombogenicity in athero sclerosis[ J] . Curr Mol Med, 2006, 6( 5) : 489�499. (收稿日期: 2010�09�27) %2186% 检验医学与临床 2010年 10月第 7卷第 20期 � Lab Med C lin, October 2010, Vol. 7, No. 20