人脐带间充质干细胞提取及其向神经上皮样细胞分化的研究

人脐带间充质干细胞提取及其向神经上皮样细胞分化的研究 人脐带间充质干细胞提取及其向神经上皮样细胞分化 的研究 第二军医大学 硕士学位MATCH_ word word文档格式规范word作业纸小票打印word模板word简历模板免费word简历 _1714677471305_1 人脐带间充质干细胞提取及其向神经上皮样细胞分化的研究 姓名:李长青 申请学位级别:硕士 专业:神经病学 指导教师:戚晓昆 2011-05缩略简称 简写 英文全称 中文名称 MSCs mesenchymal stem cells 间充质干细胞 human umbilical cord mesenchymal HUMSCs 人脐带间充质干细胞 stem cells ESC embryonic stem cell 胚胎干细胞 ASC adult stem cell 成体干细胞 iPS induced pluripotent stem cell 诱导性多能干细胞 WJ wharton’s jelly 华尔通胶 IGF-1 insulin-like growth factor-1 胰岛素样生长因子 碱性成纤维细胞生长 bFGF basic fibroblast growth factor 因子 EGF epidermal growth factor 表皮生长因子 PE phycoerythrin 藻红蛋白 FITC fluorescein isothiocyanate 异硫氰酸荧光素 MBP myelin basic protein 髓鞘碱性蛋白 GFAP glial fibrillary acidic protein 星型胶质细胞 PBS phosphate-buffered saline 磷酸盐缓冲液 DMEM dulbecco's modified essential medium 昀低必需培养基 FBS fetal bovine serum 胎牛血清独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工 作。除了文中特别加以标注和致谢的地方外,论文中不包含其他人已经 发表或撰写过的研究成果。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡 献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。本人承担本声明的法律责 任。 学位论文作者签名:日期: 年 月 日学位论文版权使用授权声明 本人完全了解第二军医大学有关保留、使用学位论文的规定,第二 军医大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子 版,允许论文被查阅和借阅。本人授权第二军医大学可以将学位论文全 文或部分内容编入《中国学位论文全文数据库》、《中国优秀博硕士学位 论文全文数据库》等数据库进行检索。可以采用影印、缩印或扫描等复 制手段保存、汇编学位论文。 (保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名:导师签名: 日期: 年月日 日期: 年月日 人脐带间充质干细胞提取及其向神经上皮样细胞分化的研究 第一部分 人脐带间充质干细胞分离、培养及 鉴定 摘 要 研究背景和目的:间充质干细胞Mesenchymal Stem cells, MSCs具有干细胞的基 本特征,即长期的自我更新、向多种组织或细胞分化的能力,是干细胞研究的热点之 一。MSCs 存在于体内多种组织,包括骨髓、脂肪组织和外周血。MSCs 相对于传统 的神经干、胚胎干细胞及造血干细胞等有很多优点,如易于获得、更易培养和扩增、 自体移植而少有排斥、体外培养较少产生基因变异。目前,骨髓是 MSCs 的重要来源。 但随着研究的不断深入,发现其来源相对贫乏。本实验研究的是一种新的 MSCs,即 人脐带间充质干细胞human umbilical cord mesenchymal stem cells, HUMSCs。通过从 脐带中成功提取出 HUMSCs,并研究其生物特性,为后期 HUMSCs 的定向分化 奠定 基础。 研究方法:无菌条件下收集剖宫产新生儿脐带,无菌盐水将脐带清洗后,用组织 剪将脐带组织剪碎成2~4cm长度大小,清洗脐带血,人工剥离脐带片段上的动静脉血 管,剪碎脐带,加入胶原酶?消化,细胞筛过滤,收集滤液,离心,用DMEM/F12 完全培养液重悬分离所得细胞,接种细胞培养瓶中。待细胞达到融合状态时,进行消 化传代和扩增培养。在倒置显微镜下观察形态学的变化,通过生长曲线的描绘观察其 增殖能力,流式细胞仪对其免疫表型进行检测。 结果:组织消化第2天,可见少量形态各异的细胞贴壁,细胞形态较小,未见明 显的细胞核,大部分未消化的组织块悬浮于培养液表面。随着时间延长,贴壁的细胞 越来越多。4天后,可见部分贴壁细胞呈扁平状或长梭形,并有两个突起,约8天后, 贴壁细胞明显增多,可见典型的长梭形成纤维样细胞,并呈漩涡状生长,至14天左右 时达到80%融合。经过传代培养,可得到逐渐纯化的HUMSCs,同时,细胞形态无明 显变化,性质稳定,至少能传代20代以上。对原代及第3、7、14代HUMSCs的增殖能 力检测,通过生长曲线描绘,发现第3、7、14代HUMSCs生长曲线有共同的特性,14 代以内的细胞生长曲线无明显差别,增殖能力大致相似。同时分别对第3、7、10代 HUMSCs进行流式细胞学检测。结果显示这三代细胞免疫表型均无明显差异,CD29、 CD73、CD105均呈阳性表达,阳性率分别为99.2%、99.5%、98.9%,而CD34、CD45 及HLA-DR均表达率分别为0.1%、0.5%、0.2%。 结论:脐带是分娩后的弃物,来源丰富,取材方便,不存在伦理道德问题。通过 - 1 - 第二军医大学硕士学位论文 酶消化法可以从脐带中获得HUMSCs,该细胞是一种成纤维样细胞,具有较强的增殖 能力,免疫表型检测显示其表达整合素受体、基质细胞及间充质干细胞标志,而造血 干细胞标志及MHC- ?类抗原均呈极低表达。说明HUMSCs属于间充质干细胞,而且 免疫原性低。因此,HUMSCs作为一种新型间充质干细胞,具有干细胞的特性,是组 织工程研究中理想的种子细胞来源。 关键词:间充质干细胞,脐带,人脐带间充质干细胞,成纤维样细胞- 2 - 人脐 带间充质干细胞提取及其向神经上皮样细胞分化的研究 Part 1 The isolation , culture and identification of human umbilical cord mesenchymal stem cells in vitro Abstract Background and Purpose: The basic characteristics of mesenchymal stem cells MSCs was self-renewal and the multiple differentiative potentials, which is a "hot spot" on the study of stem cells. MSCs can be found in various locations in the body, including bone marrow, adipose tissue, and peripheral blood. Compared with tranditional neural stem cells, embryonic stem cells and haematopoietic stem cells, MSCs have more advantagesMSCs was available in body tissue and easy to culture and to proliferate. MSCs had hardly rejection when transplanting and had lesser genovariation when culturing in vitroAt prensent, the main source of MSCs is bone marrow. However, With the development of MSCs, it was found that the source of bone mesenchymal stem cells is rare. This study is designed to explore HUMSCs, which is a new kind of MSCs. The successful isolation of HUMSCs from umbilical card tissue and study on its biological characteristics will lay the foundation of directional diffrentiation of HUMSCsMethods: The umbilical cords from full term section patients were collected in sterile condition immediately upon delivery and were washed with sterile saline. The umbilical cords was cut into pieces of 2~4cm. Blood clot in umbilical cords were rinsed out and veins and arteries were removed. Tissue fagments were trypsinized by collagenase ?and centrifugate. Then pellets were resuspended in DMEM/F12 medium including fetal bovine serum and penicillin in culture flask. Once adherent cells reached approximately 80~90% confluence, they were re-fed and passaged. We obsevred the cells’ morphological changes under inverted phase contrast microscope and their photos were takenImmunofluorescence and flow cytometry were employed to identify the phenotype of those cells, and the ability of proliferation was observed by means of growth curveResults: Adherent cells could be found after incubation in 24 hours in vitro,which were small and have no evident nucleus with different appearance in morphology, and most undigestive tissue suspended on culture medium. As time went on, adherent cells - 3 - 第二军医大学硕士学位论文 were constantly increasing. After 4 days, some adherent cells took on bipolar, flat or long-shuttle shape. Eight days later, the increasing adherent cells looked likes fibroblast cells and grew in whirlpool way. Those cells reached 80% confluence in about 14 daysThe passaged cells were gradually purified, and maintained their biological characteristic after at least 20 passages in vitro. It could be found from the growth curve of P3 and P7 and P14 of HUMSCs that their ability of proliferation of had no difference. The phenotype analysis showed that the expressions of CD29, CD73 and CD105 were positive in HUMSCs, and their rates were 99.2%, 99.5% and 98.9% respectively. In contrast,They expressed low level of CD34, CD45 and HLA-DR, and the positive rates were 0.1%, 0.5% and 0.2% respectively. Futhermore, the phenotype analysis showed no significant dieffrence between P3,P7and P10 of HUMSCsConclusions: The umbilical cords tissue is disposal after delivery, which is rich, convient to obtain and eliminate the ethical or social concerns. HUMSCs could be harvested by collagenase digesting method to umbilical cords, which had a fibroblast-like appearance and strong ability of proliferation. Surface phenotype analysis indicated that HUMSCs are new member of MSCs family and immunogenicity is low. Therefore, HUMSCs might be an ideal and potential source of cells for tissue engineering KEY WORDS:mesenchymal stem cells, umbilical cords, human umbilical cord mesenchymal stem cells, fibroblast-like cells- 4 - 人脐带间充质干 细胞提取及其向神经上皮样细胞分化的研究 一、前言 干细胞stem cell是具有高度自我更新self-renewal和多向分化潜能 multi-lineage differentiation的细胞群,即干细胞可以通过特异的分裂方式维持自身数量的恒定及其 生物学特性,同时又可进一步分化为各种组织细胞,在一定程度上,修复组织损失和 弥补组织功能。在个体生长发育过程中,有两类干细胞:胚胎干细胞embryonic stem cell, ESC和成体干细胞adult stem cell, ASC。 ESC是一类从早期胚胎内细胞团或原始生殖细胞分离和克隆出的细胞。从受精卵 [1] 分裂后形成的子代细胞,直到胚泡内的内细胞群,均具有 ESC的特性 。理论上 ESC 可以分化成内中外胚层的细胞或组织,又被称为全能干细胞pluripotent stem cell。因 此,无论在体内还是体外环境,ESC均能在体外被诱导分化为包括生殖细胞在内的几 乎所有的细胞类型。正是由于这种多向分化的能力,ESC 在应用于移植时,可能分化 成不需要的细胞或组织器官,甚至形成肿瘤,所以其移植治疗的安全性需要充分评估。 同时,经典的 ESC是从囊胚的内细胞团中分离出的,这就决定在提取过程中 必须破 坏胚囊。因此,在应用 ESC时必然涉及社会伦理问题。随着对干细胞研究的深入, 人们发现另外一种从人体正常的体细胞直接转化为诱导性多能干细胞induced pluripotent stem cell, iPS,他们具有类似 ESC的功能,能发育成任何器官或组织,而 且 iPS不需要人类卵子,这就避开了 ESC研究所面临的伦理和法律等诸多障碍。但 iPS需要借助病毒载体导入基因,因此,存在编程效率低及诱发癌症等问题,同时, [2-4] 亦不能回避多能干细胞可能会被用作生殖性克隆的问题 。 ASC是在胎儿、儿童、成人组织中存在的多能干细胞的统称,可以从不同组织 和器官中分离获得,如神经干细胞、间充质干细胞、生殖干细胞、表皮干细胞、肝脏 干细胞等,这些分布在各个器官组织的干细胞不仅具有增殖分化为所在器官组织中的 细胞的潜能,而且在特定条件下这些干细胞甚至具有跨胚层分化的潜能,如骨髓来源 的干细胞在特定环境中可向肝脏、胰腺、肌肉及神经细胞分化,肌肉、神经 干细胞也 可向造血干细胞分化等,即干细胞的“可塑性”。由于其获取相对容易,致瘤性风险相 [1,5-6] 对低,伦理学争议较少,因此,这为干细胞的研究与应用提供了新思路 。 间充质干细胞MSCs是来源于中胚层的 ASC。广泛存在于全身结缔组织和器官 [7] 间质中,以骨髓组织中含量昀为丰富,也可从胎儿脐血中分离得到 ,还存在于脐带、 [8-10] 胎盘、羊水、脐静脉内皮下层、外周血及肝脏、脂肪、肌肉、皮肤等多种组织中 。 早在 1876年,德国病理学家 Cohnheim就提出骨髓内可能存在非造血组织干细胞。 随着对其研究的深入,逐渐发现在体外不同的条件下培养,MSCs 可分化为中胚层、 [11-12] 外胚层、神经外胚层及内胚层细胞 。当然,MSCs 不仅能够向多种组织和细胞分 - 5 - 第二军医大学硕士学位论文 化,而且易于分离、培养、扩增,易于外源基因的导入和表达,在体外长期培 养的过 程中始终保持多向分化的潜能,遗传背景相当稳定。同时,由于 MSCs低表达 MHC- ?, 不表达 MHC- ?、CD40、CD80 及 CD86,这就决定了 MSCs 低免疫原的特性。另外, MSCs 能够与免疫系统相互作用,抑制 T细胞、B细胞和 NK细胞的功能,影响树突 状细胞的活性。因此,MSCs 是很好的细胞移植治疗和组织工程研究的种子细胞,可 [13-17] 用于组织的修复及治疗间充质组织遗传缺陷性疾病,具有广阔的临床应用前景 。 目前研究昀多的 MSCs 主要是人骨髓来源的间充质干细胞bone marrow?derived mesenchymal stem cell, BMSC,但由于其取材困难、供体有限、存在病毒污染的危险、 随着年龄的增长,其多向分化的能力、增殖能力均下降,因此限制了其临床应用与推 广。本研究探讨一种新型 MSCs,即从脐带分离而来的人脐带间充质干细胞 HUMSCs,研究其生物特性、表型,建立稳定的体外培养系,为今后临床应用提供 更理想的种子细胞。 二、材料与方法 一 标本来源 脐带:取自本院妇产科舍弃新鲜的脐带组织。 二 主要仪器 台式离心机 德国 Eppendorf公司 超净工作台 江苏苏净集团安泰公司 倒置显微镜 日本 Olympus公司 CO 孵箱美国 Thermo Forma公司 2 恒温循环水浴箱瑞典 Bromma 公司 离心机 德国 Hereaus公司 流式细胞仪 BectonDickinsion公司 低温冰箱Thermo Forma 公司一次性塑料培养瓶、吸管、离心管 Corning 公司 电动移液枪 Dalong公司 0.22μm针头滤器 Millipore 公司 EP管Corning公司 冷冻管 Corning公司 50ml 注射器淄博市博山美术琉璃厂制 - 6 - 人脐带间充质干细胞提取及其向神经上皮样细胞分化的研究 组织剪 上海医菱医疗器械有限公司 24、6孔培养板 Corning公司 玻璃平皿淄博市博山美术琉璃厂制 三 主要试剂 胶原酶?Sigma公司 DMEM/F12 Thermo公司 胰蛋白酶-EDTASolarbio公司 胎牛血清Invitrogen公司 CD73- PEeBioscience公司 CD34- PEeBioscience公司 CD105- PE eBioscience公司 HLA-DRHLA-II - PE eBioscience公司 IgG - PE eBioscience公司 CD29- FITC eBioscience公司 CD45- FITC eBioscience公司 IgG- FITCeBioscience公司 青霉素华北制药有限公司 台盼蓝染液 Invitrogen公司 四 主要溶液配制 1、 培养基 250ml DMEM/F12加入27ml胎牛血清及25mg青霉素,过滤除菌。 2、 0.2%胶原酶 ? 0.1g胶原酶?加入50m1DMEM/F12,过滤除菌,分装后,-20?保存。 五 细胞培养 无菌盐水将脐带清洗后,用组织剪将脐带组织剪碎成 2~4cm长度大小,清洗脐 带血,人工剥离脐带片段上的动静脉血管,剪碎,加入胶原酶?消化,时间约 45-60 分钟。细胞筛过滤,去除未消化的组织,收集滤液;1000r/min,离心 5 min,用 PBS 洗涤两次。用 DMEM/F12 完全培养液含 10%胎牛血清、100μg/ml 青霉素重悬分离 2 所得细胞,吹打均匀,接种于 T-75cm 型细胞培养瓶中,置于 37?C,5%CO ,饱和 2 湿度的细胞培养箱中培养。每 4~5d后全量换液,弃去未贴壁细胞,至单层贴壁细胞 - 7 - 第二军医大学硕士学位论文 融合,以后每 3~4d半量换液。观察细胞贴壁生长至 80%~90%汇合时,以胰蛋白酶 -EDTA消化,按 1:2~1:3比例传代培养。 六 细胞形态学观察 培养过程中每天倒置显微镜下连续观察细胞形态特征及生长状态,并随机选若干 视野照相, 记录 混凝土 养护记录下载土方回填监理旁站记录免费下载集备记录下载集备记录下载集备记录下载 实验结果。 七 细胞增殖能力 4 将培养的原代及第 3、7、14代 HUMSCs,接种于 24孔培养板中,1×10 /孔,培 养液同上。第 2天起每天取 3孔进行细胞计数,计算平均值,细胞到达平台期即停止 观察。Excel 统计分析生长曲线。 八 细胞免疫表型检测 取第 3代、第 7代、第 10代 HUMSCs,去掉培养液,用 PBS 洗 2 遍,再用 0.25% 6 胰蛋白酶消化,1500r/min,离心 10min,PBS 洗涤后制成浓度为 3.0×10 /ml 的单细 胞悬液。藻红蛋白phycoerythrin,PE鼠抗人单克隆抗体 CD73、CD34、CD105、 HLA-DRHLA-II,异硫氰酸荧光素Fluorescein isothiocyanate,FITC标记的鼠抗人 CD29、CD45 标记 HUMSCs。分别以相应抗鼠 IgG-PE 和 IgG-FITC作为同型对照。 室温孵育 20min,1500r/min,离心 10min,PBS充分洗涤后立即送检。用流式细胞仪 分析结果。 三、结果 一 HUMSCs的分离、培养、传代及形态学观察 组织消化第 2天,倒置显微镜下观察可见少量形态各异的细胞贴壁,细胞形态较 小,未见明显的细胞核,大部分未消化的组织块悬浮于培养液表面。随着时间的逐渐 延长,贴壁的细胞越来越多。4天之后,可见部分贴壁细胞呈扁平状或长梭形,并有 两个突起,但数量相对仍然较少,仍可见悬浮的细胞和组织块,此时全量换液。约 8 天后,贴壁细胞明显增多,形态较典型,折光度好,多呈长梭形的成纤维样细胞,中 间可见明显的圆形细胞核及核仁,悬浮细胞仍然可见,此后每 3天半量或全量换液, 贴壁细胞增殖能力旺盛并形成多个集落,形态均呈典型的长梭形样,并呈漩涡状生长 图 1,至 14天左右时达到 80%融合。按 1:3的比例传代,传代后可得到逐渐纯化的 HUMSCs,同时,细胞形态无明显变化,性质稳定。至少能传代 20代以上。 - 8 - 人脐带间充质干细胞提取及其向神经上皮样细胞分化的研究图 1 显示第 3代 HUMSCs 呈长梭形,两个突起,呈旋涡状生长×40 二 增殖能力结果 取原代培养及第 3、7、14代 HUMSCs 生长曲线显示:原代 HUMSCs 培养生 长 曲线显示图 2,细胞在接种后的 1~5d为生长的滞留期,扩增不明显,6~10d后细胞 进入对数生长期,细胞在这期间增殖活跃,生长迅速,持续 5天左右,14~15天后, 进入平台期,细胞扩增速度缓慢。第 3、7、14代 HUMSCs 培养滞留期 1~2天,2d 后进入对数生长期,对数增长期持续 4~5天,6~7天后铺满瓶底,进入平台期,生长 停止图 3。从生长曲线不难发现:第 3、7、14代 HUMSCs 生长曲线有共同的特性, 14代以内的干细胞生长曲线无明显差别,增殖能力大致相似。 原代HUMSCs生长曲线40 3530 2520 原代15 1050 12345678 9 516培养天数d 图 2 原代细胞生长曲线 - 9 - 4 细胞数 1×10 /ml第二军医大学硕士学位论文 HUMSCs生长曲线 60 5040 P3P7 30P14 20100 12 34 5 6 7 8 9 10培养天数d 图 3 第 3、7、14代细胞生长曲线 三 免疫表型结果 分别对第 3代、第 7代、第 10代 HUMSCs 进行流式细胞学检测。结果显示 CD29、 CD73、CD105 均呈阳性表达,阳性率分别为 99.2%、99.5%、98.9%,而 CD34、CD45 及 HLA-DR均表达率分别为 0.1%、0.5%、0.2% 图 4。同时,这三代免疫表型均无 明显差异。CD29属于整合素家族, CD105 是基质细胞标志物,CD34和 CD45 为造 血干细胞阳性标记,CD73 是间质干细胞标志物,HLA-DR为主要组织相容性复合体 - ?MHC- ? 类分子。因此,可见 HUMSC 基本不表达造血干细胞标记物及 MHC- ? 类抗,而间充质干细胞特异性标志强阳性表达,这与骨髓、脐血等其它组织来 源的 MSC流式检测结果大致一致。同时也表明 HUMSCs 属于间充质干细胞。 CD105 CD29 CD73 CD34 CD45 HLA-DR- 10 - 4 细胞数1×10 /ml人脐带间充质干细胞提取及其向神经上皮样细胞分化的研究 图4 第3代HUMSCs细胞表面分子标志CD105,HLA-DR,CD34,CD45,CD29, CD73检测结果 四、讨论 MSCs 是一种多能干细胞,它具有向多种中胚层来源的组织细胞分化的能力,包 括骨骼肌细胞、软骨细胞、成骨细胞、成纤维细胞、心肌细胞、胰岛细胞、内皮细胞 及脂肪细胞等。在一定的条件下,MSCs 还能向神经外胚层来源的神经细胞,胶质细 [14,18-20] 胞等分化 。同时 MSCs 的分化能力较强,不存在免疫排斥,可取自自体、易于 转染外源基因等优势使其成为组织工程中理想的种子细胞来源,可以在很多 组织损伤 修复中发挥作用,在心血管和神经系统等疾病的细胞核基因治疗研究中显示出良好的 [11-14] 前景 。 脐带是分娩后的废物,源自胚外中胚层,是胎儿时期连接母体和婴儿的组织,其 外层为羊膜,内层为分化的粘液性结缔组织。结缔组织内包括闭锁的卵黄囊、尿囊、 2条动脉和 1条静脉。脐血管周围是由凝胶状结缔组织包绕,被称之为华尔通胶 [21] wharton’s jelly, WJ。华尔通胶是由成纤维样间质细胞、胶原纤维及蛋白聚糖组成 。 从华尔通胶分离得到的基质细胞即为人脐带间充质干细胞。早在 1991年, McElreavey 等人首次报道,从 WJ 中分离并培养得到一种成纤维样细胞,并具有间充质干细胞的 特性。随后,Sarugaser等研究发现人脐带血管外周大约 3mm的 WJ 区域富含祖细胞, 他们将这个区域的细胞称为人脐带血管外周细胞,并发现培养后的人脐带血管外周细 胞具有较高的成纤维样集落形成能力,骨诱导后可快速增殖分化形成骨结节。后来相 [22-24] 继有更多研究者也报道从 WJ 中分离得到 MSCs 。 目前获取HUMSCs的方法包括酶消化法和植块法。本实验选择的是酶消化法对脐 带进行分离、培养,所获得的HUMSCs具有与既往报道的脐带来源的MSCs相似的性 质,包括细胞形态、免疫表型、增殖能力、细胞周期状态等。 本实验所获得的HUMSCs增殖能力强,原代培养14天可达到80%融合,传代后可 逐渐获得纯化的HUMSCs。同时,至少能传代20代以上,细胞形态性质稳定。在形态 上,类似成纤维细胞,呈梭形、扁平状,细胞折光度好,核仁明显。贴壁后的细胞呈 漩涡状生长,传代后形态无明显变化。同样,Lu发现HUMSCs在P1代贴壁细胞的平 [22] 均倍增时间约为24 h。传代培养30代以上细胞生长方式及形态均不变,传代稳定 。 Karahuseyinoglu等发现在培养HUMSCs前7天细胞生长处于滞迟期,7天后细胞呈指数 增殖。同时细胞倍增时间随着细胞传代数的增加逐渐缩短,细胞有丝分裂的时间也随 [24] 着细胞传代数增加而缩短 。因此,我们的结果为丰富的MSCs来源提供了有效的途 - 11 - 第二军医大学硕士学位论文 径。 目前尚未明确MSCs的特异性抗原标志,通常以细胞形态,流式结果,多向分化 潜能作为判断 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 。因此,对HUMSCs进一步行流式细胞学检测发现,与骨髓间充质 干细胞相似,HUMSCs极低表达造血干细胞标记CD34和CD45及MHC- ?类抗原,而 整合素受体CD29、基质细胞标记CD105、间质干细胞标志CD73表达率均在98%以上。 说明脐带WJ中含有能稳定增殖的干细胞,细胞高表达MSCs相关的标记,不表达或低 表达造血细胞和与移植排斥相关的细胞标记,提示HUMSCs属于间充质干细胞,而且 免疫原性低。这跟以前的研究类似:有学者亦发现HUMSCs不表达MHC - ?类抗原, [22] 不表达或低表达T细胞共刺激分子B7-1、B7-2、CD40 或CD40L 。在混合淋巴细胞 [23] 检测中HUMSCs呈免疫抑制,抑制T细胞的增殖 ,均提示HUMSCs是一种免疫缺陷 细胞,异体移植时不会发生免疫排斥反应。 [25-27] HUMSCs 相对于其他 MSCs 的优点在于 ,首先,脐带来源丰富,取材方便。 易于收集、保存。脐带为分娩后的弃物,正常分娩的健康产妇,在知情同意的基础上, 都能提供脐带。与其他来源的 MSCs 相比,供着安全无痛苦。同时不同于胚胎干细胞, 没有伦理道德限制;其次,脐带中 HUMSCs 含量丰富,不受年龄影响,获得的细胞 4 5 比较原始,增殖能力强。MSCs 的主要来源是骨髓,但骨髓 MSCs 含量低,10 ~10 个骨髓单个核细胞含一个 MSC。有研究显示, 骨髓 MSCs 数量在新生儿昀高,随后 [22] 在一生中逐渐减少,到 80岁将减少一半 。因此,HUMSCs 相对于骨髓 MSCs 更容 易获得;另外,HUMSCs 病毒传染风险低、污染机会少。 本实验通过酶消化法获得了脐带来源的 HUMSCs,方法简单,效率高,传代后 细胞系稳定,为 MSCs 增添了新的成员,为进一步在组织工程中的应用奠定 了基础。 参 考 文 献 [1] Bjornson CR, Rietze RL, Reynolods BA, et al.Turning brain into blood: a hematopoietic fate adopted by adult neural stem cells in vivo. 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