移植周围神经对大鼠受损视网膜节细胞的影响

移植周围神经对大鼠受损视网膜节细胞的影响 移植周围神经对大鼠受损视网膜节细胞的 影响 第2j卷第4期 1994年10月 解剖 ACTAANATOMICASINICA V0】.25,No.4 Oct.1994 7斗一钉占,傩锨移植周围神经对大鼠 专受损视网膜节细胞的影响 雷季良王淑玲于恩华——————一 ——————一 (北京医科大学解剖学系.北京l...83);2r.厂 A擅要用成年雄性W/star大鼠切断一侧视神经后.随即将自体坐骨神经段,视神经段或挤压 后的坐骨神经段植入眼球玻璃体内,植入的神经段长2mm.术后动物分别存活2,4或8周将动 物麻醉处死后,取同侧视阿膜制备切片,Nissl染色.观察视网膜节细胞(RGC)的变化,井用计算 机图像分析仪测量RGC胞体截面积结果 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 明,植入坐骨神经段各组 RGC大多数存活,并出现 巨大的节细胞存活2周时,RGC胞体截面积均值比正常组大;4周时胞体进一步增大;8周时则 有所下降.在同一存活期内,增加移植神经段数目或植入存活1周的挤压坐骨神经.RGC胞体截 面积增大更明显;超过50m的巨大节细胞细胞数在本组的构成比也增大. 关键调中枢神经系再生视网膜节细胞坐骨神经移植大鼠 中枢神经系的再生已成为当前神经科学研究的一个重要课题【1一,并取得了相当明显的进 展,对以往中枢神经元不能再生的传统见解有了新的认识.一些实验表明[2,不是中枢神经元 本身没有再生能力.而是由于它们所在环境不适合再生.有研究报道0周围神经的Schwann 细胞可释放某些化学物质,如神经生长因子(NGF)等.它能促进培养的鸡胚神经节细胞的生 长.近年有学者报道[4].切断金黄地鼠视神经后在玻璃体内移植周围神经,可见存活的节细 胞.有些胞体可增大,突起可出芽生长.这使中枢神经系再生的研究又有了新的进展.为进一 步了解视网膜节细胞(RGC)在深浅方位上的形态变化.本实验采用视网膜全层切片,Nissl染 色法,显示再生的RGC的形态,并应用计算机图像分析仪测量RGC胞体的截面积.以探讨 再生RGC胞体形态与移植周围神经段及其影响因素的关系. 材料和方法 实验用成年雄性W~tar大鼠45只,体重1O5,125g.戊巴比妥钠腹腔麻醉下(40mg/kg 体重),在右眼球后方2mill处切断视神经(ON),同时取自体周围神经段(PN)2mm(本实验 用坐骨神经).在颞侧角膜缘用注射针穿刺眼球壁,将神经段移植到眼球玻璃体内,术后动物 存活数周.按动物的存活时间不同分为:2周组,4周组和8周组.每组又根据移植神经段的 数目和方法的不同,分为以下几组. 2周组 PN组:植入1段坐骨神经;II组:在同一部位植入2段坐骨神经}II.组:从角膜颞侧 和鼻侧各植入1段坐骨神经;C组:仅切断ON;N组:正常对照. 4周组 PN.组:植入1段坐骨神经}CPN组:先将活体坐骨神经暴露,随后用手术镊挤压3次, 术后动物存活1周再取坐骨神经被挤压处的远端作为移植物;OPN组:同一孔洞内同时植入 良等.移植周围神经对大鼠 1段自体左眼视神经和1段坐骨神经fFPN组:取自体坐骨神经段经冰冻一解冻处理,反复3 次后再植入;ON组:仅植入1段自体左眼视神经;C组:仅切断ON. 8周组 PN组:仅植入1段坐骨神经;C组:仅切断ON. 每组5只动物(PN,II,II,PN,CPN,OPN,FPN,ON,PN8组),动物的对侧眼(/E 侧)为对照组(N组和3个C组). 各组动物按不同存活时间取眼球,立即浸入2多聚甲醛液中,将视网膜完整剥离,入 4Z多聚甲醛固定,脱水,石蜡包埋,沿视轴擞连续切片(厚10脚),Nissl染色,明视野观察. 对植入坐骨神经的各组,每组取1例随机选取视野,用计算机图像分析仪(IBAS-20O0)测量 能见胞核的节细胞胞体截面积,然后将各组的数据进行统计学分析. 结果 1.在移植物PN的作用下受损RGC胞体增大 移植PN各组(2周组:PN,II,II2f4周组:PN,CPN,OPNf8周组:PN8)视网膜节 细胞层均可见到胞体增大的RGC,核清晰,细胞排列整齐.增大的 RGC胞体呈圆形或椭圆 形,椭圆形RGC的长径与节细胞层排列方向一致(图1,7).RGC胞体的大小相差较大,各 组之间差别更明显,胞体截面积为8.4,215.8m,以存活4周各组增大最明显,并可见一 些巨大的RGC(截面积在50m和100m以上,图4,6).各组还见到大,中,小型RGC (大型:3o以上;中型;1o,3Ovm;小型:10m以下).未移植PN的存活2,4周的C 组,以及4周的FPN和ON组则均未见RGC胞体增大绝大部分细胞出现明显溃变,细胞边 界不清,与相邻RGC连在一起,胞质淡染,呈溶解状(图8)8周的C组仅见少数存活的小型 RGC.正常对照的N组RGC在节细胞层排列整齐,胞膜和胞核均清楚可见,胞体呈圆形,其 大小为7.9,44.1m(图9). 2.移植PN后受损RGC胞体截面积随存活时间的延长而变化 用计算机图像分析仪对移植物相同,存活时间不同的PN.,PN和PNs3组RGC的胞体 进行测量,对胞体截面积大于5Om.(正常对照N组均小于5Om)的327,328和366个 RGC进行统计,胞体截面积均数PN2组为75.3--+_16.0;PN.组为93.7 土33.8m;PN日 组为81.2土19.6mr],以存活4周的最大t检验证明3组之间差别有显着性(P<0.01) 另外,3.组胞体截面积在100m以上的RGC分别占本组所测细胞数的7.6,34.6 和17.5,变化趋势与细胞截面积的变化趋势相似,经检验3组之间差别均有显着性(P< 0.01) 3.增加移植PN数目时受损RGC胞体截面积增加 在存活时间均为2周的同样条件下,从PNII和II3组分别选取1倒,在视网膜颞侧 半切片中,每隔20片抽取1片,每片取1个视野测量节细胞截面积.每组所见的全部RGC分 别为134,101和152个.统计比较可见,PN,II和II3组RGC胞体平均截面积分别为31.9 ?21.0m,37.1土22.1m和35.1土22.7vm,数值均明显超过正常对照N组的17.6土 8.4m,3组均与N组有高度显着性差异(P<0.01)?].3组之间也有一定差别,即II1>II >PN组;II与PN2组差别有显着性(P<0.05)}II组则介于?1与PN组之间,与这两组 均无显着性差异. 解剖25卷 由以上结果可见,3组最大细胞的截面积虽然都在120m以下,但各组大于50m.的 RGC占所测细胞数的构成比却有所不同,PN,II和IIz3组分别为16.4,25.7和 2O.4,PN.与II组相比有高度显着性差异(P<0.01);而IIz与另两组则无显着性差异.另 外,3组大干100/zm的细胞数均占本组所测细胞数的2以下,3组之间无显着性差异. 4.在移植预先损伤的PN后和移植反复球冻-解冻的PN后受损RGC胞体截面积增减情况 CPN组RGC胞体截面积比PN组明显增加;而FPN组RGC则全面溃变,未见有增大 的RGC,与C组近似.对CPN和PN.组所测截面积在30/zm以上的518和458个RGC进行 统计比较,两组胞体平均截面积为109.5?37.3/zm和84.3土36.8,有高度显着性差异 (P<O.01)];两组截面积在50以上的RGC占本组所测细胞数的构成比分别为98.O 和82.5;截面积在100m.以上则占52和28.6,经”检验均有显着性差异(P< 0.01). 5.视神经移植段做为PN的辅助移植物时PN对受损RGC的作用 同时植入PN和ON的存活4周的OPN组,截面积在30m.以上的大型RGC胞体平均 截面积为1】0.6土40.5m.,比PN组的84.3土36.8/zm大得多,两者有显着性差别(P< 0.01).而仅植入视神经的ON组,则RGC呈溃变状态,与C组结果相似. 讨论 本实验通过移植坐骨神经段改变了受损RGC的生存环境,使它们能继续生存.大多数 RGC至少可生存8周以上,这再一次证明只要改善受损RGC的生存环境,它们就有可能存 活和再生.本研究所见与已有的研究结果一致_’2.有研究证明受损RGC在植入的周围神经 作用下,可呈现胞体增大,同时突起呈现萌芽和生长状态].本研究只观察了胞体增大这一形 态特点来研究移植物对受损RGC的影响,但是否胞体增大就意味着神经纤维再生,本文未 做观察.’ 存活的RGC胞体大小和截面积在5O/zm.以上的RGC构成比在存活8周内,呈现由小 到大并再变小的变化趋势,这与Cho_’用镀银法在金黄地鼠视网膜铺片上对RGC的观察结果 相似.但他们的结果表明:动物存活2,4和8周时,胞体面积分别为339.O土9.4/zm,585.0 土l5.2/zm和490.O土17.8/zm,以4周时最大,8周时变小.它们所见的节细胞面积比本研 究的大得多,这除了可能与实验动物不同有关外,主要是制片方法不同,Cho采用的是视网 膜铺片,而本实验采用的是视网膜切片.已知胚胎发育时期RGC存在着胞体由小增大再变小 的现象口].本实验在移植PN作用下,受损的RGC也有同样的变化,看来RGC在再生过程中 似乎重复着个体发生的变化.我们曾在实验过程中移植1段PN后隔4周再植入1段PN,以 观察能否加强PN的作用.但存活8周后RGC胞体也较小,与植入1段PN的无显着性差异. 因此推测,RGC的再生不仅与移植PN及其产生的某些因子有关}也或许与胶质细胞产生的 神经生长抑制因子的抑制作用有关[1.另外,RGC也存在着与靶细胞建立联系而恢复功能的 过程.无靶的RGC将萎缩以至死亡【1,本实验所见胞体变小是否与这方面的因素有关,尚 待研究. 周围神经存在着中枢神经不具有的Schwann细胞,这种细胞可分泌多种神经诱向因子, 如神经生长因子(NGF),已为许多学者所关注【1.并推测这是PN起作用的关键.本研究中 存活2周的RGC胞体截面积II>II>PN组.II组植入的两段坐骨神经距离很近,所释放 4期雷季良等.移植周围神经对大鼠受损视阿膜节细胞的影响?377? 的活性物质集中在植入点周围.II组虽然也植入两段坐骨神经,但两者相距较远,释放的活 性物质较分散.PN组由于只植入1段神经,其数目少于其他两组,产生的活性物质则也少. 因此,神经的移植数目将对RGC形态在一定程度上产生影响,同时与两段PN移植点距离也 有一定关系存活4周的CPN组是把移植的坐骨神经预先挤压存活1周后,再将其远端做为 移植物进行移植的,这样移植的神经正处于损伤后的修复期,其内的Schwann细胞分裂增 殖.FPN组移植的神经先经反复冻融处理后再植入,这样可使神经中的Schwann细胞全部死 亡,但其基膜的层粘连蛋白仍存在].本实验中CPN组的RGC胞体平 均截面积超过PN组, 而FPN组则与不做移植的C组相似.由此可见,移植的神经中如仅有基膜的层粘连蛋白存 在,而没有Schwann细胞及其活性物质的存在,则受损的RGC不能再生. 本实验存活2周的各组都有74,83的RGC截面积在50m下,这些细胞与增大 的RGC所处的环境是相同的,但对植入神经的反应却相差很大,这种差别可能与RGC分为 ,和等类型有关.各型RGC对神经产生的活性物质(如NGF)的接受能力有差异,可 能与它们的受体类型和数目的不同有关0,但对某种因子受体的定量研究,尚待进行. 本实验中同时移植坐骨神经和视神经的OPN组,对RGC的影响则比仅移植PN的增 强,与植入挤压的坐骨神经的CPN组结果近似.但只移植视神经则对RGC不起作用.因此可 见,视神经本身虽不能对RGC直接起作用,但它可间接对移植的坐骨神经起一定的促进作 用,这或许是因为使RGC受体对某种因子的结合力得到了加强之故. 收穑1994-o5修回1994-06 本文图1,9见插图第9页 图版说明 图i,9为视阿膜顾侧半切片光镜下图像,箭头示大鼠视网膜节细胞tN为内棱层,商染色×8O 图1切断枧神经植八1段坐骨神经存活2周组(PN2组)图2切断视神经同一部位内植八2段坐骨神经存活2周 组(1h组) 图3切断挺神经在不同部位各植八1段坐骨神经存活2周组(117组)图4切断视神经植八1段坐骨神经存活4周 组(P组) 图5切断枧神经植八挤压后的坐骨神经存活4周组(CPN组)图6切断挺神经植八1段坐骨神经同时植八1段视 神经存活4同组(OPN组) 图7切断视神经植八1段坐骨神经存活8周组(PNB组)图8切断视神经存活2周组(c组) 图9正常视网膜(N组) 参考文献 [1]TaaMML,HarveyAR,SoKF.Regenerationmtinataxonsingrabsofperiph eraland~emralu8tmsue】ntheadult 阳t.Neur0sciLeft,1990,117(1.2)I14 [2:s0KF,AguayoA1.Lengthyregrowthofcutfromganglion?n8aherperip~,rraltratmp~mtatinnintotheretina ofadultrat.BrainRes.1985.328(2)}349 [3]RardsonPM,EhendalT.Nervegrowthactivitiesinratperiphera[neneBrainR?,1982,246(1)57 ofaxon-likepr :43ChoEYP,SoKF.Characterizationofthesproutingrespo— ocessesfrom~tina[ganglioncellsafterax~omy inadulthmstAmode[u~ingintravitrea[impiantadonofperiphrralnel~re.Th?ls,UniversityoII-IongKong,1990 [5]雷季良,王赦玲,于思华.大鼠坐骨神经移植段对受损的桓网膜节 细胞影响的形志学研究——存活时间因素的影响.神 经解剖学杂志,1993,9(2)’217 [6]雷季良,王般玲,于思华.大鼠坐骨神经移植段对受损的视网膜节 细胞影响的形态学研究.神经解剖学杂志.1993,9(1) I23 [7]雷季良,王彀玲,于恩华.对大鼠受损视隔膜节细胞形态影响因素 的研究.神经解剖学杂志,1993.9(2)t213 ?378解剖25卷 :8]肖悦梅,苏国辉.皮体盘黄地鼠神经节细胞轴突在外周神经移植到 棍网膜后的再生.解剖,1987t18(2),1n :9]LauKC,SoKF,TayD.Posma~a[developmentoftypeImtlnatganglioncellsin[xaiDste~s:Aluciferyellowstudy.JComp Neurol,1992,315(4)J375 [1O]SchwabME.RegenerationoflesionedCNSaxonsbyneutralisationofne ~it~growthinhibitors{Ashortreview.ParapL~一 gm,1991,2g(2)I294 [11]LundRD,HankinMHtBehonAJ,et.Conditionsforoptic? 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KEYWORDSCNSregeneration;Retinalganglioncell(RGC);Sciaticnervetransplants; Rat