不同培养条件对红曲霉产桔霉素影响的研究

研究与探讨 Vo 1 ．23，No。1 0，2002 红 曲霉产糟霉索影响的帝宄 (江西一OAI联合研究院，南昌330047) 许 杨 李燕萍 赖卫华 熊勇华 摘 要 用 16株红曲霉分别接种酵母浸膏蔗糖培养基 (YSM)和 土豆葡萄糖培养基 (PDM)，并采 用高效液相 色谱 法 (HPLC) 检测 工程第三方检测合同工程防雷检测合同植筋拉拔检测方案传感器技术课后答案检测机构通用要求培训 了培养基中桔霉素的含量，以观察不同培养 条件对红曲霉产桔霉素的影响。结果发现 ，红 曲霉于 YSM 中27℃静置培养 14d时，有 13株产桔霉素，其含量 为 2~192mg／L不等 ：而在 PDM 中 35℃振 荡培 养 8d时， 只有4株产桔霉素，其含量在 3~2lmg／L之间；在两种培 养条件下均产桔霉素的有4株，且均为安卡红曲霉。 关奠词 桔霉素 红曲霉 高效液相色谱 Abstract The two submerged cultures of 16 MonaSCUS strains were determined for the presence of citrinin by high peflormance Iiquid chromatography In 1 3 out of the 1 6 strains cultured in yeast extract and sucrose medium． citrinin detected ranges fr0m 2 to 192 mg／L In 4 out of the 16 strains cultured ln potato dextrose medium citrinin detected ranges fr0m 3 to 21 mg／L Citrinin has been detected in these two cultures of 4 Monascus strains The production of citrinin is related to culture media and culture conditions I y words Citrinin； Monascus； high pedormance liquid chromatog raphy 中图分类 号 ：TS201．3 文献标 识码 ：A 文 章 编 号 ：lo02一o306(2o02)10—0033—03 近 年 来 ，在 同 归 自然 思 潮 的 影 响 下 ，红 曲 产 品 在 西 方 世 界 已 引 起 了 注 意 ，特 别 是 可 以 用 天 然 红 曲 色 素 部分 代 替西 方 肉制 品工 业 中的 发 色剂 一亚 硝 酸盐 ，由 此 可 能带来 的 巨大 应用 前景 为世 人所 关 注⋯。同时 ，经 研 究证 实 ，红 曲霉 发 酵过 程 中产 生 的多种 次 级 代谢 产 物 具 有 重 要 的 生 理 活 性 [21：Monacolin类 化 合 物 是 胆 固 醇 合成 关键 酶 HMG—CoA还 原 酶 的抑制 剂 ，对 该 酶 有 较强 的竞 争抑 制 作用 ，从 而降低 胆 固醇 的合 成翻； 一氨 基 丁酸 和 乙酰 胆 碱具 有控 制 血 压 的 功 效 ；麦 角 固醇 经 紫外 线 照射 后 逐 步 转 化 为 V ，可 防 治幼 儿 的佝 偻 病 ，对 促 进 孕 妇 和 老 年 人 的 钙 磷 吸 收 有 明 显 作 用 ；他 汀 类 化 合 物 具 有 抗 骨 质 疏 松 的 功 效 ， 而 且 是 目前 唯 收稿 日期：2oo2—06一l0 作者 简介 ：许杨 (1951一)，女 ，教授 ，研 究方向 ：食品 生物技 术。 一 发 现 的 、通 过 增 强 骨 细 胞 中 骨 形 成 蛋 白 基 因 的 表 达 来 增 加 骨 骼 密 度 的 一 类 物 质 161，可 以 逆 转 骨 质 疏 松 的进 程 捌。所 有 这 一切 ，使 得 古 老 的红 曲霉再 次 焕 发 出 勃 勃 生 机 。 然 而 ， 法 国 学 者 Blanc于 l995年 首 次 在 红 曲 霉 的培 养 物 中检 测 出 了一 种 对 人 畜 有 害 的 真菌 毒 素一 桔霉 素[91。桔 霉 素 最早 是 1931年从 桔 青 霉 的培 养 物 中 分 离 得 到 的 ， 其 分 子 式 为 C。，H。 O ， 分 子 量 为 250．25，纯 品 桔霉 素 为 黄 色 、无味 的晶 体 。它 的熔点 为 l70～l73℃ ，部 分 溶 解 于 水 中 ，完 全 溶 解 于 丙 酮 、苯 、 氯 仿 、甲醇 等有 机溶 剂 中l】0J 经 口灌 喂 桔霉 素 ，大 鼠 、 小 鼠 和 豚 鼠 的 LD 分 别 为 50、ll2和 43m kg。桔 霉 素 主 要 作 用 的 靶 器 官 是 。肾脏 ，它 不 仅 可 以 致 畸 、导 致 肿 瘤 【 】，而 且 可 以 诱 发 突 变 I“I。 本 研 究 用 l6株 红 曲 霉 分 别 接 种 酵 母 浸 膏 蔗 糖 液 体 培 养 基 (YSM ) 和 土 豆 葡 萄 糖 液 体 培 养 基 (PDM)，并 采 用 高效 液 相 色 谱 法 (HPLC)检 测 了其 中 桔 霉 素 的 含 量 ， 以 观 察 不 同 培 养 条 件 对 红 曲 霉 产 桔 霉 素 的 影 响 。 1 材料与方法 1．1 实验材料 桔 霉 素 标 品 (美 国 Sigma公 司 ) lmg 桔 霉 素 标 准 品 溶 于 甲 醇 并 定 容 至 lOml，4℃ 冰 箱 避 光 保 存 ； AS3．4384 (橙 色 红 曲 霉 ，MonascUS aurantiacUS)、 AS3．976 (变 红 红 曲 霉 ， Serorubescens)、AS3．978 (锈 色 红 曲 霉 ， rubiginosUS)、IFF105007(红 色 红 曲 霉 ， ruber)、IFF105012，IFF1050l3，IFF105022， IFF10503 l， IFF105032，IFF105033 (安 卡 红 曲 霉 ， anka) 以 上 菌种 来 自中科 院微 生 物 所 和轻 工 业 发 酵 研 究 所 ；FJSH 、FJH 、SCSH、SCH 、ZKYSH 、ZKYH 以上 菌 种 由南 昌大 学食 品科 学 与 工程 系微 生 物 教 研 室 提 供 ，按 《真 菌 鉴 定 手 册 》和 《常 见 与 常 用 真 菌 》中 的 方 法 鉴 定 到 属 ； 甲醇 、磷 酸 分 析 纯 ；乙腈 色 谱 纯 ；双蒸 水 。 1．2 HPLC测定条件 维普资讯 http://www.cqvip.com 液 相 色 谱 仪 ：Syknm S7121 Reagent Organizer， Syknm S1 121 Solvent Delivery System ．Syknm S51 1 1 injektor Valve Bracket(大 连 依 利 特 )；Fluorescence Detector Model 420 (美 国 W aters公 司 )(激 发 波 长 ： 313nm，发 射 波 ~ ：495 nm)；色 谱 柱 ：A11sphere ODS一2 (颗粒 大小 ：5 ，柱 长 ：250mm，内 径 ：46mm)，流 动 相 ： 乙腈 ：甲醇：水 (20：50：30)，用 磷 酸 调 pH 为 2．5， 经 0．45I~m 微 滤 膜 过 滤 ，超 声 波 脱 气 。 1．3 产桔青霉素的培养 1．3．1 培 养 基 的 制 备 1．3．1．1 酵 母 浸 膏 蔗糖 培 养基 酵 母 浸 膏 40g，蔗 糖 160g，加 水 至 1000ml，250ml三 角 瓶 中 分 装 100ml， 于 121．3oC灭 菌 20min。 1．3．1．2 土 豆 葡萄 糖 培 养基 200g土 豆 去皮 ，切 块 ， 加 水 煮 沸 30min，纱 布 过 滤 ，滤 液 中 加 入 20g葡 萄 糖 ， 溶 化 后 加 水 至 lO00ml，250ml三 角 瓶 中 分 装 75ml，于 121-3℃灭 菌 20min。 1．3．2 培 养 方 法 将 红 曲霉 菌 种 接 种 到酵 母 浸 膏 蔗 糖 培 养 基 中 ，27℃ 静 置 培 养 14d。将 红 曲 霉 菌 种 接 种 到 土 豆 葡 萄 糖 培 养 基 中 ，35℃ ，150 r／min振 荡 培 养 8d。 1．4 桔青霉素的提取 将 红 曲 霉 培 养 物 用 滤 纸 过 滤 ，取 一 定 量 滤 液 ，与 等 体 积 甲醇 剧 烈 混合 lOmin，15000r／min离 心 15min， 取 上 清 液进 行 HPLC分析 。 1．5 回收率的测定 空 白 培 养 基 中 加 入 一 定 浓 度 标 准 样 品 后 ，按 照 1．4方 法进 行 操作 ，从 而得 出 回 收率 。 1．6 标准 曲线的绘制 将 标 准 样 品 稀 释 成 不 同 浓 度 后 进 样 ，根 据 进 样 量 和 峰 面 积 绘 制 标 准 曲 线 。 2 结果与讨论 2．1 标准 曲线 将 标 准 样 品 稀 释 成 不 同 浓 度 (1、2．5、5、10、25、 研究与探讨 图 1 桔霉素标准曲线 50、125、250 g／m1)进 样 ，每 次 进 样 101~1，根 据 标 品 浓 度 和 峰 面积 求 回归 ；b-程 和相 关 系 数 ，得 标 准 曲线 方 程 ：Y=(2．657e+3)X+(一5654．815)(R=0．9998)，其 中 x 为 浓 度 ，Y 为 峰 面 积 ，R 为 相 关 系 数 。 2．2 分析结果与方法的精密度和准确度 对 空 白培养 基 进行 测 定 ，未 检 出桔 霉素 。空 白培 养 基 中 加 入 4x10 mg／ml标 样 ， 然 后 用 本 试 验 方 法 经处 理 、测定 ，所 得 结果 见 表 1。五次 测定 的桔霉 素 平 均 含 量 为 3．916x10 mg／ml，标 准 偏 差 为 0．012x10-3， 变 异 系数 为 0．3％，平 均 回收 率 为 97．9％。由回 收率 与 其 分 析 结 果 的变 异 系 数 说 明 方法 的准 确 度 、精 密 度 均 较 好 。 2．3 各红 曲霉菌株在 YSM 和 PDM 中产毒状 况分 析 将 所 有 的 红 曲霉 菌 种 分 别 接 种 于 YSM 和 PDM 中 ，在 1．3．2中的条 件下 培 养 ，将 红 曲霉 的培 养 液过 滤 ，采 用 甲醇 提取 桔 霉素 ，高 速 离心 除 去变 性 蛋 白 ，取 上清 液 201xl，用 HPLC分 析培 养 液 中的桔 霉素 含量 。 由表 2可 知 ，16株 红 曲 霉 酵 母 浸 膏 蔗糖 培 养 液 中 有 13株 样 品 检 测 出 桔 霉 素 ，含 量 为 2～192 mg／L， 其 中菌 株 AS3．4384的培 养 液 中桔 霉 素 的含量 最 高 。 在 红 曲 霉 菌 株 IFF105012、IFF105013、 IFF105031、IFF105032的 土 豆 葡 萄 糖 培 养 液 中 检 测 出 表 1 空白培养基添加桔霉素的测定结果 表 2 2 sp# 在酵母蔗糖液体培养基(YS)和土豆葡萄糖液体培养基(PD)中的产毒状况 注：a培养条件与时间：酵母浸膏蔗糖液体培养基，27℃，静置，14d；b培养条件与时间：土豆葡萄糖液体培养基，35℃，15Of／rain，8d。 维普资讯 http://www.cqvip.com 研究与探讨 了桔 霉 素 ，含 量 为 3～21 mg／L，其 它 菌株 的培 养 液 中 未 检 出 桔 霉 素 。 在 以上 两 种 培 养液 中均 检 测 出桔 霉 素 的红 曲霉 菌 株 有 IFF105012、IFF105013、IFF105031、IFF105032。 结果 表 明 ，红 曲霉 产 桔 霉 素不 仅 与 菌 株 有关 ，且 与培 养 条 件 有 关 。 次 级 代谢 产 物 的合成 可 以 因培 养 条件 的改 变 而 改变 ，也 只 因 菌 株不 同 而异 【l2l，故 桔 霉 素 的合 成 在 上 述 两 种 培 养条 件 及 不 同 的 菌 株 中表 现 出 很 大 差 异 。 当在 酵 母 浸 膏 蔗 糖 液 体 培 养基 中 27oC静 置 培 养 14d 时 ，有 13株 产 桔 霉 素 。 在 所 有 的 产 毒 菌 株 中 ，除 AS3．4384是 橙 色 红 曲 霉 外 ，其 它 标 准 菌 株 均 是 安 卡 红 曲霉 ，野 生菌 株全 都 产 桔霉 素 。这些 安 卡红 曲霉 主 要 用 于食 品工 业 及红 曲色 素 的 生产 。野 生 菌 株 是从 红 曲米 中分 离 出来 的 ，也可 用 于生 产红 曲色 素 。而在 土 豆葡 萄糖 液 体 培养 基 (35oC，150r／min培 养 8d)中 ， 只有 四株 安 卡红 曲霉 产 桔霉 素 。显 然 ，酵母 浸 膏 蔗糖 液 体 培 养基有 利 于桔 霉 素 的产生 。 由于桔霉 素 与脂 肪 酸代 谢有 关 l，而 酵母 浸 膏 的 营 养 丰 富 ，含 有 多 种有 利 于 微 生物 分 泌 代 谢 产 物 的 因 子 ，可 能有 利 于 桔 霉 素 的分 泌 ，也 可 能 刺 激 红 曲霉 中国粮油学：J=E))2003年 ◆ 《中国粮油学报》是中国粮油学会主办的学术性刊物，已 纳入全国食 品工业类 中文核心期 刊，属全 国重点期刊之 一， 并为美国《化学文摘》收录。《中国粮油学报》主要登载谷物、 油脂化 学方面的学术论文；报道优质粮油 品质 资源选育 、贮 藏 、加 工利用 以及 品质检测 方面 的研 究成果 ，它对指导粮 油 学科 的发展 ，提 高粮 油资源 的深度开发 利用水 平 ，具有 实用 价值。 《中国粮油学报》是国内外公开发行的一级刊物，国内统 一 刊号 ；CN11—2864／TS，国 际标 准连 续 出版 刊 号 ：ISSN 1003—0174。双 月刊 ，逢 双月 出版 ，胶版 印刷 ，大 16开 ，64 页，每期 定价 1O元 ，全年定 价 6O元 (含 邮费)。 自 1996年 以来 ，每年还 出版一期英 文增 刊 ，国 内订 户优 惠 1O元(含 邮 费)。全套共计 7O元 。 订 阅可通过 邮局或银行 汇款。 地址：北京市宣武区报国寺 1号《中国粮油学报》编辑部 邮政编政 ：100053 帐户 ：中国粮油学会 ，开户银行 ：北京市商业银行 报国寺 支行 ，帐号：201050385—70 电话 ：010-63038765 传真 ：010-63049529 Vo1．23，No．1 0，2002 产生 桔 霉 素 ，还 可 能 促 进 桔 青 霉 素 合成 酶 的活 性 而 加 速桔 霉 素 的合 成 。 参考文献 1 Johanna F．G．Jurgen．D，Lothar．L．Fleischwirtsch，1991，71(10)： 1 l84～l186 2 路秀玲，赵树欣，宫慧梅．食品科技，2001(1)：43～46 3 Eva S．Istvan．Science．2o01．292：1 160～1 164 4 陈彦霖．食品工业月刊(台)，2000，32(12)：54-59 5 毛宁．营养学报，1999，21(3)：358～361 6 G．Mandy et al— science，1999．286：1946～1949 7 Gretchen Voge1． ．science。1999．286：1825～1826 8 Dan Ferber．．science．20O0 288：2297～2298 9 P．J．Blanc，J．P．Laussac，J．I_e．Bar et a1．Food Microbiology， 1995，27：201～213 10 H．K．Frank．．Z Emahrungswiss，1992。31：164 ～177 1 l Monica S．V．Roe1．F．M．Johanna．F．G— Mutation Research． 1999，444：7～16 l2 李季伦，张伟心，杨启瑞，等．微 生物生理学(第 1版)．北京： 北京农业 大学出版，1993 维普资讯 http://www.cqvip.com