抗性筛选浓度

抗性筛选浓度 细胞筛选 一 嘌呤霉素 (一) 确定最优筛选浓度 当用于筛选特定细胞的嘌呤霉素合适浓度未知时，需进行滴定，或制定针对那种细胞的嘌呤霉素杀菌曲线。一般而言，嘌呤霉素浓度范围在2-10微克/毫升时是足以杀灭大多数未转染的哺乳动物细胞系。 1. 培养待转染(而不是转染后)的细胞。(筛选的目的是杀灭未转染的细胞) 2. 取对数生长期的细胞(一般在铺满培养器皿底部的70%~80%时)，用新鲜无抗无血清的培养基制成1.5×105 个/ml 的细胞悬液。 3. 向96孔培养板中加细胞悬液，每孔100微升(使每孔细胞数在1.5×104个)，然后向每孔加新鲜无抗无血 清的培养基适量，培养箱中静置培养过夜。(这样做是为了保证在固定细胞密度下确定最佳G418药物筛选浓度。) 4. 第二天用嘌呤霉素浓度分别为0, 2, 4, 6, 8, 10微克/毫升的新鲜无抗无血清培养基溶液替换各孔中的旧的培 养基。(每个浓度可用两个复孔，相当于每个浓度测定三次)。(注意:对于多数细胞种类而言，过量的嘌呤霉素能引起许多非必需的表型的反应。) 5. 每日检查细胞活力，根据细胞活力，每三天( 即每隔两天)更换含嘌呤霉素的新鲜无抗无血清培养基溶液一 次。如细胞生长过快，可以缩短换液时间(每隔一天)。 6. 在正常的实验操作规程时 ，一种细胞最优筛选浓度的确立时间随细胞的生长率和一般生存时间而定，大 概需3到14天。在所需时间之后，嘌呤霉素的导致所有细胞死亡的最小浓度就是应该用于该细胞和该实验的浓度。最优浓度为在3-5天内杀死所有细胞的浓度。 (二) 转染细胞 1. 第一天:在60mm培养皿内种植细胞，细胞密度为能使第二天细胞融合能达到70%-80%的密度，CO2孵箱 过夜培养。 μg/ml。将已2. 第二天:准备3ml无抗生素无血清培养基，加入Polybrene使其终浓度为8经制备的病毒颗粒 0.5 ml加至上述培养基，轻吹混匀。去除60mm培养皿内的旧的培养基，加入含病毒培养基。(Polybrene能够增加病毒感染的效率，然而，有时候Polybrene对细胞有毒性。这时，可以用Protamine Sulfate代替Polybrene) (三) 筛选细胞 1. 病毒感染后24小时，可以换用含最优浓度puromycin的培养基。 2. 如果病毒对细胞有毒性，可以减少感染时间至4-6小时，然后换用新鲜培养基，24-48小时后换加含最优 浓度puromycin的培养基。最好设立一个对照皿，不加病毒液，加入Ploybrene，观察Polybrene是否对细胞有毒性;如果Polybrene没有毒性，还可以加入puromycin，作为puromycin是否有效的对照。 3. 以后每隔一天换用新鲜含puromycin的无抗生素无血清培养基，以替换含大量死细胞的培养基。直到抗性 群落能被识别出(一般是在筛选后10到12天)。 4. 待抗性细胞长满以后，细胞转入10cm培养皿，同时，留一部分细胞在原来的60mm平皿内。 5. 60mm平皿内细胞长满后，收获细胞，在蛋白或mRNA水平鉴定基因敲低效率。6. 10cm培养皿内的细胞待长满后传代，首先每种稳定细胞系冻存4-5支细胞，待基因敲低鉴定清楚后，解冻冻存细胞，进行表型观察分析。通常情况下，由于慢病毒为复制缺陷型病毒，受感染的细胞不能产生新的病毒，因此从加入病毒颗粒开始，经过5-6次换液后，培养基内已不存在病毒颗粒，可以移至普通细胞培养室内培养研究。 二 G418 (一) 确定最优筛选浓度 由于每种细胞对G418的敏感性不同，而且不同的厂家生产的相同浓度的G418的活性不尽相同，所以在筛选之前，一定要确定G418的最佳筛选浓度。 1. G418的配制: 取1g G418溶于1ml 1mol/L的HEPES液，加蒸馏水定容至10ml(使G418终浓度为 0.1g/ml ,HEPES终浓度为100mmol/L)，过滤消毒，4度保存。 HEPES的化学全称为羟乙基呱嗪乙硫磺酸(N’-a-hydroxythylpiperazine-N’- ethanesulfanic acid )，分子量238.31，是一种氢离子缓冲剂，能较长时间的控制溶液的pH处于恒定的范围，而对细胞无毒性作用。 1mol/L HEPES的简单配置:HEPES 23(83g，溶解于80ml的双蒸水中，用10mol/L的NaOH调节pH至7.2-7.4，定容至100ml，0.22um小滤器过滤。HEPES使用终浓度为10-50mmol/L。 2. 制备筛选培养基:在100ug/ml,1000ug/ml范围内按0ug/ml 、100ug/ml、200ug/ml、300ug/ml、400ug/ml， 500ug/ml、600ug/ml、700ug/ml、800ug/ml，900ug/ml、1000ug/ml浓度用无抗无血清培养基稀释G418制成筛选培养基。心得:由于特性明确的细胞系G418的最佳用量还是比较稳定的，所以有时候不需要在这么大范围内进行筛选。比如说你要转染NIH3T3细胞 ，现在我告诉你我测试过NIH3T3细胞对G418的敏感性，我用的筛选浓度是200 ug/ml。这时你就可以做150ug/ml、200ug/ml、 300ug/ml三个浓度进行筛选。 3. 培养待转染(而不是转染后)的细胞。(筛选的目的是杀灭未转染的细胞) 4. 取对数生长期的细胞(一般在铺满培养器皿底部的70%~80%时)，用新鲜无抗无血清的培养基制成1×104 个/ml 的细胞悬液。 ×103个)，然后向 5. 向96孔培养板中加细胞悬液，每孔100微升(使每孔细胞数在1 每孔加新鲜无抗无血清 的培养基适量，培养箱中静置培养。(这样做是为了保证在固定细胞密度下确定最佳G418药物筛选浓度。) 汇合度:实际上就是指细胞占培养表面的比例，如果细胞铺满了整个容器，我们就认为它们100%汇合，也就是汇合度100%。汇合度对G418筛选结果的影响很大，一般筛选时汇合度不宜超过50% ～ 6. 培养6小时左右开始加药。加筛选培养基筛选: 吸除培养孔中培养基，PBS洗涤一次，每孔中加入不同浓 度的筛选培养基适量。 7. 换液: 每日检查细胞活力，根据细胞活力和培养基的颜色，每三天( 即每隔两天)更换筛选培养基一次。 如细胞生长过快，可以缩短换液时间(每隔一天)。有死细胞勤换液，可以减少对存活细胞的影响。 8. 确定最佳筛选浓度:在正常的实验操作规程时 ，一种细胞最优筛选浓度的确立时间随细胞的生长率和一 般生存时间而定，在筛选10,14天内能够杀死所有细胞的最小G418浓度即为最佳筛选浓度。 在第一轮就筛选出最佳G418浓度的可能性不大，最有可能的是出现这种情况:用某一浓度G418的量在筛选14天后还不能杀死细胞，而用下一个梯度的 G418的量在10天前就看不到活细胞了。假如是400ug/ml不能杀死细胞，而800ug/ml在第5天就把所有细胞都杀死了，则可以再用500ug/ml、600ug/ml、700ug/ml进一步筛选，以确定最佳筛选浓度。 (二) 转染细胞 1. 第一天:在60mm培养皿内种植细胞，细胞密度为能使第二天细胞融合能达到70%-80%的密度，CO2孵箱 过夜培养。 2. 第二天:准备3ml无抗生素无血清培养基，加入Polybrene，终浓度为8μg/ml。将已经制备的病毒颗粒0.5 ml加至上述培养基，轻吹混匀。去除60mm培养皿内的旧的培养基，加入含病毒培养基。(Polybrene能够增加病毒感染的效率，然而，有时候Polybrene对细胞 有毒性。这时，可以用Protamine Sulfate代替Polybrene) 3. 转染后培养24小时或者更长，到细胞增长接近70,汇合时按1:4密度传代，继续培养，待细胞密度增至 50,,70,汇合时开始筛选。 (三) 筛选细胞 1. 加G418:去掉培养液，PBS洗一次，加入按最佳筛选浓度配制好的G418筛选培养基(无抗无血清)( 实 际应用时可以比最佳筛选浓度高一级别)。 2. 换液:根据培养基的颜色和细胞生长情况，每3~5天更换一次筛选培养基。当有大量细胞死亡时，可以把 G418浓度减半维持筛选。 筛选10,14天后，可见有抗性的克隆出现，停药用完全培养基培养。 3. 待其逐渐增大后，挑出单克隆:制备细胞悬液，细胞计数，用培养基稀释细胞到1个/10ul。在96孔板中 加入培养基150ul/孔，再加入细胞悬液10ul/孔。待其逐渐增大后转入到48孔中增殖。 4. 单克隆鉴定:细胞大量扩增后，提取总RNA，做RT-PCR检测目的基因是否存在。 典型贴壁细胞平板密度 作用机制: 嘌呤霉素(Puromycin)是由白黑链霉菌(Streptomyces alboniger)发酵代谢产生的一种氨基糖苷 类抗生素，通过抑制蛋白质合成而杀死革兰氏阳性菌，各种动物和昆虫细胞。某种特殊情况下有 效作用大肠杆菌。嘌呤霉素作为氨酰-tRNA分子3’末端的类似物，能够与核糖体的A位点结合并 掺入到延伸的肽链中。但是嘌呤霉素同A位点结合后，不会参与随后的任何反应，从而导致蛋白 质合成的提前终止并释放出C-末端含有嘌呤霉素的不成熟多肽。 抗性基因: 对嘌呤霉素的抗性取决于编码嘌呤霉素N-乙酰转移酶(PAC)的 Pac基因，遗传 工程 路基工程安全技术交底工程项目施工成本控制工程量增项单年度零星工程技术标正投影法基本原理 研究使用的Pac 基因分离自嘌呤霉素产生菌Streptomyces alboniger。 最普遍应用: 1)嘌呤霉素如今普遍应用于筛选和维持培养含Pac基因的哺乳动物稳定转染细胞。嘌呤霉素在细 胞稳转株筛选中的普遍应用与慢病毒载体的特性有关，现在商业化的慢病毒载体多数都携带pac 基因。 2)在某些特定情况下，嘌呤霉素亦可以用来筛选转化携带pac基因质粒的大肠杆菌菌株。 化学特性: 化学名称:3 (a -Amino-p-methoxyhydro cinnamamido)- 3–deoxy- N,N–dimethyladenosine?2HCl CAS No.:58-58.2， 分子式:C H N O .2HCl， 分子量:544.43 g/mol 222975 纯度:,98%(HPLC),易溶于水5-50mg/mL，-20度保存。 应用浓度: 哺乳动物细胞的推荐使用浓度为1-10 μg/mL，最佳浓度需要杀灭曲线来确定。 LB琼脂培养基筛选稳定转化pac基因的大肠杆菌，使用浓度为125μg/mL。使用嘌呤霉素筛选大肠杆菌稳转株需要精确的pH值调节，而且受宿主细胞本身的影响。 使用步骤:(哺乳动物细胞筛选) ?嘌呤霉素杀灭曲线的确定(shRNA稳定转染细胞株，仅作参考) 为了筛选到稳定表达待研究shRNA的细胞株，确定杀死未转染/转导细胞的最低浓度嘌呤霉素至关重要。所以初次做实验的客户一定要建立适合自己体系的杀死曲线(kill curve) 。 4(1)24孔板内以5~8 x 10 cells/孔的密度铺板，铺足够量的孔以进行后续的梯度实验。细胞孵育过夜; (2)准备筛选培养基-含不同浓度嘌呤霉素的新鲜培养基(如0-15μg/mL，至少5个梯度); (3)细胞孵育过夜后加入筛选培养基，孵育细胞; (4)约2-3天更换新鲜的筛选培养基; (5)每日监测细胞观察存活细胞比例。嘌呤霉素的最佳作用时间一般在1-4天之间。 (6)最小的抗生素使用浓度就是指从抗生素筛选开始1-4天内杀死所用细胞的最低筛选浓度。 ?嘌呤霉素筛选稳定转染细胞 4(1)day 0:24孔板内以5~8 x 10 cells/孔的密度铺板，孵育过夜; (2)制备筛选培养基:含有最佳筛选浓度嘌呤霉素(由杀灭曲线确定)的新鲜培养基; (3)day 1:筛选第一天，去除旧的培养基，加入一定量MOI的病毒颗粒;(加入无血清培养基的总量必须充分覆盖住细胞。) (4)病毒转导后约6-8h，再添加1ml完全培养基(血清和双抗，如果已经使用双抗。)到细胞内，然后孵育过夜; (5)病毒转导后48h，使用嘌呤霉素筛选培养基替换旧的完全培养基。孵育。 (6)约每2-3天替换新鲜配制的筛选培养基; (7)每天检测细胞并观察活细胞生长比例，以及turboGFP表达的水平及所占比例。在某一个时间点几乎所用存活细胞都可以表达TurboGFP。嘌呤霉素最佳的作用时间在3-10天之间。 注:病毒的MOI越高，每个细胞含有的shRNA拷贝和嘌呤霉素耐性基因越多。在做嘌呤霉素筛选时，需记住越高MOI,含越多pac拷贝的细胞能耐受更高的嘌呤霉素浓度。调整嘌呤霉素的浓度去筛选预定量的转导细胞，但是嘌呤霉素的量不能低于杀死曲线建立的最低浓度。 储存方法和稳定性: 嘌呤霉素稳定性高，可以常温运输，收到产品后4?存放; 嘌呤霉素在室温条件下可存放3个月，4?条件下保质期一年。为了达到最理想的稳定状态和最长的保质期，最好存放于-20?C，保质期为2年。 应用文献: 1.为了说明Parp1基因和ADP核糖多聚体位于Dnmt1启动子上和说明Parp1能够保护自己的非甲基化状态，向培养基中加入2μg/mL的嘌呤霉素筛选稳转株，质粒为 pBabe-puro(Addgene公司); 2.为了研究生化信号通路能够在嘈杂的分子环境下传递信息，采用6ug/mL的puromycin进行细胞筛选。 3.为了研究IRP2(离子调控蛋白2)特定的73个氨基酸插入与该蛋白致瘤特性的关系，采用2µg/ml 的嘌呤霉素筛选稳定转染的人H1299肺癌细胞系。 4.为了证实在p53缺失的细胞中，被O-GlcNAc修饰的IKKβ的催化活性有所增强，使用了1μg/ml的嘌呤霉素来筛选感染腺病毒(载体为pBabe HA-IKKβ wild type)的细胞。 5.为研究跨膜交互作用在KAI1/CD82介导的对癌症侵入和转移的抑制作用中所发挥的角色，使用2μg/ml的嘌呤霉素用于筛选稳定的Du145-sh2和-sh3转导子，并用1μg/ml的嘌呤霉素维持培养 (pSIREN-RetroQ 逆转录病毒转染)。 6.为了研究Per1在调节肝脏对四氯二苯并-p-二恶英反应中的作用，使用了4μg/ml的嘌呤霉素筛选稳定感染腺病毒的 Hepa1c1c7细胞，腺病毒载体为 pSilencer 5.1-U6 Retro Vector (Applied Biosystems/Ambion)。 7.为了证实蛋白激酶PKR可以诱导细胞凋亡和抑制缺乏C蛋白的麻疹病毒亚型的生长，使用 1μg/ml 嘌呤霉素来筛选稳定转染的HeLa细胞，载体为 pSUPER.retro.puro Vector。 教你如何用WORD文档 (2012-06-27 192246)转载? 标签: 杂谈 1. 问:WORD 里边怎样设置每页不同的页眉,如何使不同的章节显示的页眉不同, 答:分节，每节可以设置不同的页眉。文件――页面设置――版式――页眉和页脚――首页 不同。 2. 问:请问word 中怎样让每一章用不同的页眉,怎么我现在只能用一个页眉，一改就全部改了, 答:在插入分隔符里，选插入分节符，可以选连续的那个，然后下一页改页眉前，按一下“同前”钮，再做的改动就不影响前面的了。简言之，分节符使得它们独立了。这个工具栏上的“同前”按钮就显示在工具栏上，不过是图标的形式，把光标移到上面就显示出”同前“两个字来。 3. 问:如何合并两个WORD 文档，不同的页眉需要先写两个文件，然后合并，如何做, 答:页眉设置中，选择奇偶页不同与前不同等选项。 4. 问:WORD 编辑页眉设置，如何实现奇偶页不同 比如:单页浙江大学学位论文，这一个容易设;双页:(每章标题)，这一个有什么技巧啊, 答:插入节分隔符，与前节设置相同去掉，再设置奇偶页不同。 5. 问:怎样使WORD 文档只有第一页没有页眉，页脚, 答:页面设置,页眉和页脚，选首页不同，然后选中首页页眉中的小箭头，格式,边框和底纹，选择无，这个只要在“视图”――“页眉页脚”，其中的页面设置里，不要整个文档，就可以看到一个“同前”的标志，不选，前后的设置情况就不同了。 6. 问:如何从第三页起设置页眉, 答:在第二页末插入分节符，在第三页的页眉格式中去掉同前节，如果第一、二页还有页眉，把它设置成正文就可以了 ?在新建文档中，菜单―视图―页脚―插入页码―页码格式―起始页码为0，确定;?菜单―文件―页面设置―版式―首页不同，确定;?将光标放到第一页末，菜单―文件―页面设置―版式―首页不同―应用于插入点之后，确定。第2 步与第三步差别在于第2 步应用于整篇文档，第3 步应用于插入点之后。这样，做两次首页不同以后，页码从第三页开始从1 编号，完成。 7. 问:WORD 页眉自动出现一根直线，请问怎么处理, 答:格式从“页眉”改为“清除格式”，就在“格式”快捷工具栏最左边;选中页眉文字和箭头，格式,边框和底纹,设置选无。 8. 问:页眉一般是---------，上面写上题目或者其它，想做的是把这根线变为双线，WORD 中修改页眉的那根线怎么改成双线的 答:按以下步骤操作去做: ?选中页眉的文字，包括最后面的箭头?格式,边框和底纹?选线性为双线的?在预览里， 点击左下小方块，预览的图形会出现双线?确定?上面和下面自己可以设置，点击在预览周围的四个小方块，页眉线就可以在不同的位置。 9. 问:Word 中的脚注如何删除,把正文相应的符号删除，内容可以删除，但最后那个格式还在，应该怎么办, 答:步骤如下:1、切换到普通视图，菜单中“视图”――“脚注”，这时最下方出现了尾注的编辑栏。2、在尾注的下拉菜单中选择“尾注分隔符”，这时那条短横线出现了，选中它，删除。3、再在下拉菜单中选择“尾注延续分隔符”，这是那条长横线出现了，选中它，删除。4、切换回到页面视图。尾注和脚注应该都是一样的。 10. 问:Word 里面有没有自动断词得功能常常有得单词太长了，如果能设置下自动断词就好了 答:在工具―语言―断字―自动断字，勾上，word 还是很强大的。 11. 问:如何将word 文档里的繁体字改为简化字, 答:工具―语言―中文简繁转换。 12. 问:怎样微调WORD 表格线,WORD 表格上下竖线不能对齐，用鼠标拖动其中一条线，可是一拖就跑老远，想微调表格竖线让上下对齐，请问该怎么办, 答:选定上下两个单元格，然后指定其宽度就可以对齐了，再怎么拉都行pressAlt，打开绘图，其中有个调整坐标线，单击，将其中水平间距与垂直间距都调到最小值即可。打开绘图，然后在左下脚的绘图网格里设置，把水平和垂直间距设置得最小。 13. 问:怎样微调word 表格线,我的word 表格上下竖线不能对齐，用鼠标拖动其中一条线，可是一拖就跑老远，我想微调表格竖线让上下对齐，请问该怎么办, 答:可以如下操作:?按住ctl 键还是shift，你have a try?double click the line, try it )?打开绘图，设置一下网格(在左下角)。使水平和垂直都为最小，试一把～,?press Alt 14. 问:怎么把word 文档里已经有的分页符去掉, 答:先在工具―― 选项―― 视图―― 格式标记，选中全部，然后就能够看到分页符，delete 就ok了。 15. 问:Word 中下标的大小可以改的吗 答:格式―字体 16. 问:Word 里怎么自动生成目录啊 答:用“格式样式和格式”编辑文章中的小标题，然后插入-索引和目录 17. 问:Word 的文档结构图能否整个复制 论文要写目录了，不想再照着文档结构图输入一遍，有办法复制粘贴过来吗, 答:可以自动生成的，插入索引目录。 18. 问:做目录的时候有什么办法时右边的页码对齐,比如:1.1 标题..........11.2 标题...............2 答:画表格，然后把页码都放到一个格子里靠右或居中，然后让表格的线条消隐就可以了，打印出来就很整齐。 19. 问:怎样在word 中将所有大写字母转为小写,比如一句全大写的转为全小写的答:格式-更改大小写-小写 20. 问:在存盘的时候，出现了问题，症状如下:磁盘已满或打开文件过多，不能保存，另开新窗口重存也不管用。如何解决, 答:把word 文档全选，然后复制，然后关掉word，电脑提示你粘贴板上有东西，要不要用于别的程序，选是，然后，再重 新打开word，然后粘贴，然后，保存。 21. 问:WORD 中的表格一复制粘贴到 ppt 关于艾滋病ppt课件精益管理ppt下载地图下载ppt可编辑假如ppt教学课件下载triz基础知识ppt 中就散掉了，怎么把WORD 里面的表格原样粘贴到PPT 中, 答:1)比较好的方法是:先把表格单独存为一WORD 文件，然后插入,,对象，选由文件创建，然后选中上面的WORD 文件，确定;2)还可以先把表格copy 到excel 中，然后copy 到PPT 中，这个也是比较好的办法;3)可以先做成文本框，再粘贴过去;4)复制粘贴，但是在PPT 中不能粘在文本框里面;5)拷屏，做成图片，再弄到PPT 里面。 22. 问:有没有办法将PPT 的文字拷入WORD 里面, 答:另存就可以了。只要以.rtf 格式另存即可 23. 问:word 中图片的分栏如何处理,假如有:1 2 图3 4 这样的结构，我想实现:1 3 图(要横跨两栏)2 4 但是，试了半天总是:1 2 图3 4 怎么办呀,help～ 答:设置图片格式――版式――高级――文字环绕――环绕方式选上下型――图片位置――对齐方式选居中――度量依据选页面，要先改文字环绕，然后才能改图片位置 24. 问:用word 写东西时字距老是变动，有时候自动隔得很开，有时候进入下一行的时侯， 上一行的字距又自动变大了，这是为什么,怎么纠正啊, 答:是因为自动对齐的功能，格式――段落――对齐方式可以选。还有允许断字的功能如果check 上，就不会出现你说的情况了。 25. 问:在使用WORD 的样式之后，如标题1、标题2 之类的，在这些样式前面总会出现一个黑黑的方块，虽然打印的时候看不到，但看着总是不舒服，有没有办法让它不要显示呢, 答:“视图”,,“显示段落标志”，把前面的勾去掉。其实这个很有用，可以便于知道哪个是标题段落 26. 问:文章第一页下面要写作者联系方式等。通常格式是一条短划线，下面是联系方式，基金支持等。这样的格式怎么做出来,就是注明页脚吗, 答:插入――脚注和尾注 27. 问:文字双栏，而有一张图片特别大，想通栏显示，应该怎么操作, 答:可以选择的内容，按双栏排。选择其他内容，按单栏排。 28. 问:Word 里面如何不显示回车换行符, 答:把视图-显示段落标记的勾去掉或工具-选项-视图-段落标记 29. 问:有没有方法把WORD 里的软回车一下子替换掉,识别出来的文字全带着软回车，能把他们一次全删掉吗,, 答:查找，替换，按CTRL+H;软回车好象是^l，在特殊字符里有 30. 问:在WORD 里的框框里怎么打勾, 答:画个文本框，文本框里写一个钩，然后拖过去;或者先在WORD 里插入符号“?”，然后选中“?”，到-》格式-》中文版式-》带圈字符-》选“?” 31. 问:还是不行，这样拷过去的框框字体是windings 的，而原来的是宋体的，两者有很大的区别。 答:根据模板新建专业型传真，里面有框，双击后打勾，copy 就ok 32. 问:Word 中怎么在一个英文字母上打对号, 答:透明方式插入图片对象，内容是一个? 33. 问:WORD 里怎么显示修订文档的状态,文档修订后，改后标记很多，但是在菜单里没有“显示修订最终状态”等，怎么调出来, 答:工具,自定义,命令,类别(工具),命令(修订),把“修订”等拖到工具栏上 34. 问:怎样把许多分开的word 文档合并成一个文档。我的论文是按照章节分开写的，但现在图书馆要提交电子版的学位论文，是一个文档的，我找了很多选项但好象不能合并，选择插入文件功能，可以加入内容，但文档中的页眉却插不进去，有谁有高见, 答:acrobat6 可以直接把多个文档打印成一个pdf 文档。可以提交pdf 格式的论文，先一个一个word 文档转换为pdf 格式的，然后在pdf 文档菜单的文件菜单中，选上作为pdf 格式打开，追加上就可。 35. 问:Word 里面要写方程式怎么办啊, 答:插入,对象,公式编辑器equation，如果没有公式编辑器Equation，要自己从光盘中安装，或者安装Mathtype 公式编辑器按右键把它拖出来,,插入,,命令,,自定义,,工具应该是倒过来 36. 问:想在WORD 里面表示矩阵，怎样才能画出那个很大的矩阵括号, 答:装公式编辑器mathtype 好了~:) 37. 问:Word 的公式编辑器怎么安装, 答:工具,自定义,插入,公式编辑器，把它拖到工具条上即可;或者安装OFFICE 后，再次安装，选增加功能吧，会有提示的 38. 问:Word2000 下调用公式编辑器的快捷键 答:点击菜单[工具]-[自定义]，点击对话框下方[键盘]，在[类别]里选择[插入]，在命令里选择[InsertEquation]，指定你的快捷方式 39. 问:WORD 中出现公式的行往往要比只有文字的行来得宽，如何把这些行改的跟只有文字的行一样宽, 答:段落行距设为固定值即可。这样会有一个问题，比如设置为18 磅，有些公式符号(特别是有下标的)不能全部显示打印稿可以显示。怎么解决这个问题,这个如何解决还需要考虑。 40. 问:我的文档就是公式多，应该怎么办, 答:公式多的时候，最好的消除这个问题的办法就是每打几个公式就要存盘，如果连续打太多，就会出现这个问题。出现问题的时候:?选中所有内容，ctrl，C?把WORD 所有文档关闭。 ?最关键:出现一条信息，务必选择“是”?重新打开WORD 编辑器，?ctrl，V，粘贴?ctrl，S，存盘 41. 问:怎样在word 里面的公式编辑器中输入空格, 答:ctrl+shift+space 42. 问:如何使word 中公式全都小一号,一个一个选实在麻烦 答:在Mathtype公式编辑器中:首先，在Mathtype 中的菜单Size 中选define,定义所需的字号大小;再次，在Mathtype 中的菜单preferences 中的equation preference 的save to file 存贮所定义的字号文件;返回word 中:在Mathtype菜单中选Format equation1)在MathType preference file 中，选你刚才所定义的文件;2)在Range 中，选Whole document。最后，选OK，即OK了。 43. 问:如何将WORD 中的公式编缉拉到外面 答:工具,自定义,命令,插入,右边找公式编辑器，往上脱 44. 问:怎样可以去掉word 里面公式，或是图片上方总是出现的灰色的横条啊,以前没有的，不知道怎么跑出来了，看着怪晕糊的。。。。。 答:工具,选项-视图-域底纹，选不显示，或选取时显示，就可以了 45. 问:整个论文用一个WORD 文档，太大，不好编辑，一个地方有增删，后面那么长一个文档版面分布会变得乱七八糟，特别是图表之类的东东。想让每章的偶数页自动显示自己的章号和题目，WORD 里这个能够自动实现吗, 答:不要整个论文放一个WORD 文档，一章一个，然后每章就可以奇偶分开处理了 46. 问:论文按照章节写的，想把它们合并成一个文件，并保持原有的文件格式。采用了在文件末尾插入分节符的方法，但插入后有些文件的部分格式发生了变化，请问如何解决, 答:用主控文档的方法比较好，在大纲模式里设置的;采取插入文件的方式，格式有些变化 47. 问:WORD 里边怎么样显示行号, 答:在页面设置那里，板式选项，最下面有个行号选项 48. 问:Word 里面怎么插入半个空格, 答:先在word 的工具栏上，点中双箭头那个纽，就可以看到原先看不到的空格，然后再编辑一下这个空格的大小，比如小五或小四什么的。 49. 问:只要一回车，或是改变光标位置的任何操作，都会使上一行的)变成,，有人遇到过这个问题么, 答:是不是设置了自动替换啊，符号里的自动替换看看吧～ 50. 问:WORD 有没有可以按单词的首字母进行排序,就是从A-Z 进行排 答:表格中的内容可以按照拼音排序，弄到excel 里，排序，再回来 51. 问:怎么在word 里面打R^2 答:先打R2，然后用鼠标选中2,同时按Ctrl，“shift”和+ 52. 问:Word 中发现空格都是小圆点，是怎么回事情,每输入一个空格就出现一个小圆点，怎么把它消除掉啊,这个空格会打印出来吗, 答:不会打印出来，如果想不显示:工具,选项,视图格式标记中前面的勾去掉即可 53. 问:word 如何使两个表格能排在一起,我做的表格每一个都比较小，但是表格数比较多，我想两个表格排成一行，请问该怎么做, 答:试试在局部分栏，每个分栏中一个表格。 54. 问:为什么换机器打开WORD 文档排版变了,在一台机器上排好板的WORD 文档换在另一台机器打开就变了,页码都不对了，怪哉。 答:是默认的页面设置不一样吧，或者版本不同 55. 问:Word 里面插入表格的问题，同一表格前后两行被分在了不同的页上，想他们在同一页怎么做, 答:转换成图文框可能更容易排版一点，或者加个文本框 56. 问:怎么在word 里画坐标图在word 里有了坐标图，文字却加不加去怎么办 答:作图时直接将文字加上去;word 中的绘图工具条，文字环绕里面寻找合适的 方案 气瓶 现场处置方案 .pdf气瓶 现场处置方案 .doc见习基地管理方案.doc关于群访事件的化解方案建筑工地扬尘治理专项方案下载 ，把图放在文字的底层 57. 问:WORD 文件有密码，怎么办呢, 答:找破解软件，比如advanced_office_2000_password_recovery_pro_v1.03，但不一定好用。 58. 问:怎么给word 文档加密, 答:打开文档，另存为―工具―常规选项―打开、修改权限密码，保存 59. 问:Word 文件怎么转化为postscript 文件, 答:先转化为pdf，然后打印到文件，通过distiller 生成ps。 60. 问:Word 无法识别origin 中的汉字怎么办,用origin 做的图形中有汉字，copy 到word 中就成了问号，因此我不得不先用export 把图形变为jpg 文件才能解决这个问题，有没有方便的解决办法, 答:ORIGIN 里面的字体改成宋体或者仿宋 61. 问:请教怎么把Origin 中的图表拷贝到Word, 答:点origin 的Edit 菜单里的copy page 到word 里粘贴就行了 62. 问:把origin 的图复制粘贴到word，总有一大块的空白，这个空白有什么工具可以去掉吗,还有就是用word 自带的图表工具画图时，也是有一大块空白去不掉，这个可以解决吗, 答:右键选择图片工具栏，点裁减 63. 问:插入的图片为什么老是处于页面的顶端，想拖下来放到其他地方，却又自动跑到顶端去，就是拖不下来，请问该如何处理 答:改变图片的属性，就可以了。 64. 问:如何保证一幅图像固定在某一段的后面，另一段的前面，而不会因为前面段落的删减而位置改变, 答:右键点击图片,设置对象格式―版式―嵌入型 65. 问:如何把在WORD 里面图形工具画的图转化为jpg, 答:另存为html 格式，然后在html 文件对应的文件夹里找 66. 问:请问什么格式的图片插入word 最清晰,手头持有png 和tif 格式，复制粘贴到word 中模糊一片，请问转换成什么图片格式用于word 最清晰,什么方法(插入图片来自文件还是直接复制粘贴)对清晰度有否影响, 答:emf，eps 等矢量图最清晰，不会因为缩放损失分辨率，而jpeg，bmp 等点阵图就不行了。 67. 问:在WORD 中如何让图片的左、上、下边都是文本, 答:在分栏的数量为1的情况下实现。图片选中后右键，设置图片格式--版式-四周型就可以了 68. 问:jpg 文件插入word 文件以后怎么让文件变小,jpg 格式图片插到word文件以后文件变的巨大，有什么方法可以让它小一点,最好能一张软盘放的下。 答:两个方法:?用photoshop 改变图片的分辨率，当然要看得清楚，然后插入word?word 有强大的压缩功能，把文档另存为比如:temp.doc，看看是不是小了很多。 69. 问:Matlab 仿真图片大家一般怎么弄到word 里面的相对横轴和纵轴修改一下的说 答:一般都是在Matlab 里面把所有的直接修改好了，然后再保存的时候用jpg 格式，在word 中间导入就好了 70. 问:如何向WORD 中的图片添加文本,想在图片上输入一些说明文字 答:插入文本框，将版式设成“悬浮”在WORD 的绘图工具里面有个自选图形，找到你要的括号，直接在页面上画就可以了。可以移动，大小也可以改。然后把他挪到文字边上，即可。一个小窍门就是用CTRL+箭头可以进行微调。如果你觉得经常需要对这些文字编辑，怕图形错位的话，可以将需要的文字打在一个文本框里，记得将文本框设置成透明无色的(这样就看不见文本框了)，然后将文本框和你的括号(或其他符号)组合成一个图形，就万无一失了 71. 问:AUTOCAD 的图拷贝到WORD 下如何处理 答:有几种办法:一是可以在WORD 中进行CAD 编辑的方法:将CAD 的背景设为白色，然后将CAD 窗口缩小，到你想复制的图形的大小，正好可以容纳就可以了，否则WORD 里面有很大的空白，然后，拷贝，选中所有的图形中的线条，右键。到WORD 中粘贴。二是，先转为wmf 文件，具体先将窗口缩小，如上，然后，按emport，选中线条，存储。WORD 中，插入，图形，来自, 文件，找到文件就可以插入了。 72. 问:文章用WORD 打开时，原有的公式全是红叉，以及WORD 中图变成red cross(红叉)怎么办, 答:基本上没有办法挽救回来了，只能重新插一遍图。据微软的技术支持所说，红叉是由于资源不够引起的。也就是说，如果你所编辑的文档过大，可能因为资源问题导致图片无法调入，从而显示红叉。可是实际情况是，有时候所编辑的文档并不大，可是还是出现红叉。这就可能是因为你设置了快速保存，在选项菜单中可以找到。这是由WORD 的文档结构所决定的。当你设置为快速保存时，每次保存的时候只是把你改动过的部分添加到文档尾部，并不重写文档本身，以达到快速的目的。所以，你会看到一个本来并不长的文档的实际大小可能有好几兆。当取消了快速保存后，文档长度将大大减小。还有一个减小红叉出现可能性的办法是把图片的属性中的浮动去掉。这样可能在编辑的时候有一定的困难，但是对于避免红叉的出现确实很灵。再说一句，一旦红叉出现了，应该是没有办法恢复的，只有再重新贴图。 73. 问:如果Word 突然定在那里了怎么办, 答:重新打开会回复，或者在word自身的templates 里面找到近期文件，重写的不用太多。 74. 问:如何解决word 说磁盘已满不让保存的问题, 答:有时候，当要保存一个文件时，Word 会弹出一个对话框说是磁盘空间已满，无法保存文件，可实际上磁盘上空间还很大。这是非常令人恼火的一件事情。这一信息最常见的原因是Temp 文件夹已经达到了一个文件夹中可以包含的最多文件数的上限。这时的解决方法很简单:在【资源管理器】中右击安装有Windows 系统的磁盘，在出现的快捷菜单中单击【属性】，将出现【属性】对话框，从【常规】选项卡中选择【磁盘清理】按钮，此时将出现【磁盘清理】对话框。执行磁盘清理完毕以后，Windows 会弹出一个新的对话框。在【要删除的文件】框中选中【临时文件】选项，然后选择【确定】。Windows 将删除临时文件。要人工删除临时文件，进入临时文件夹，删除任何旧的临时文件(临时文件以波浪号开始，以(tmp 扩展名结束)，返回Word，再次试着保存文件。如果此时还不能正确保存文档，可以采取以下的方法，步骤如下:(l)按Ctrl，A 选定整个文档。(2)按Ctrl，C 将整个文档复制到内存中。(3)关闭Word 程序。此时系统会提示:您将大量文本放在了'剪贴板'中，是否希望在退出Word 后这些文本仍可用于其他程序,。(4)选择【是】按钮。(5)重新打开Word 程序。(6)按Ctrl，V，将复制下来的文本粘贴到新文件中。注意:在删除临时文件时，可能会出现一个对话框，提示不能删除正在使用的文件。这是因为Windows 运行的时候，需要不断地用到一些临时文件。因而，在人工删除临时文件时，试着在开始时只删除几个文件，然后对桌面上的回收站进行清空。否则可能无法删除所有选择的文件。