针刺对未成熟鼠缺氧缺血性脑损害脑发育及髓鞘形成的影响

针刺对未成熟鼠缺氧缺血性脑损害脑发育及髓鞘形成的影响 福建医科大学 硕士学位论文针刺对未成熟鼠缺氧缺血性脑损害脑发育及髓鞘形成的影响 姓名:苏静 申请学位级别:硕士 专业:儿科学 指导教师:陈涵强王玮 20090501 针刺对未成熟鼠缺氧缺血性脑损害脑发育及髓鞘形成的影响 中文摘要〔目的〕 脑室周围白质软化(,,,,,,,,,,;,,,, ,,,,,,,,,;,,，,,,)是围产期新生儿一种较常见的脑损伤形式，其发生主要与早产、缺氧缺血、感染、高胆红素血症、机械通气等因素有关。针刺治疗作为我国传统医学的重要组成部分，其对脑血管病的治疗作用已逐渐被广泛肯定。本研究在成功构建缺氧缺血未成熟鼠脑室周围白质软化模型的基础上，探讨针刺疗法对缺氧缺血未成熟鼠脑发育及髓鞘形成的影响。〔方法〕 随机选取,,只孕鼠，分为实验组(,,,,)和对照组(,,,,)，孕,,天时用乙醚吸入麻醉后剖腹，对照组孕鼠剖腹后打开了宫取出胎鼠，随机获胎鼠,,只为空白对照组(,组)。实验组孕鼠剖腹后取出了宫，置于,,?水浴中,,,,,后行延迟性剖宫产取出胎鼠，随机获取胎鼠,,只并分为模型组(,组),,只和模型，针刺组(,组),,只。。喂养,天后对,组大鼠进行针刺治疗，每天一次，连续,,天。而,组和,组不做针刺处理，置于相同环境中喂养。各组按照,，,，,，,，,,天,个时间点进行观察，包括体重，脑重，神经行为学的测量，同时进行病理学及细胞凋亡和少突胶质细胞,,双标记检测。〔结果〕,(生长发育情况: ,组牛长发育正常，,、,组存活后出现牛长发育迟缓，,组体重明显高于,、,组，差异有统计学意义(,,,(,,)(牛后,,天，三组体重快速增长，,组明显高于,、,组，而,组体重明显高于,组，差异有统计学意义(,,,(,,)。牛后前三天三组大鼠脑重变化不大，三组比较差异无统计学意义(,,,(,,)，牛后,天,组脑重高于,、,组，有显著性差异(,,,(,,)，牛后,,天，,组脑重高于,、,组，,组脑重高于,组，差异有统计学意义(,,,(,,)。,(牛后,,天神经行为学检测: ,组悬吊试验、斜坡试验及旷场试验明显高于,、,组，,组明显高于,组，差异有统计学意义(,,,(,,)。 ,,(病理学检,(, ,,染色:,组侧脑室周围白质细胞排列有序，,、,组脑室周围白质细胞排列 紊乱，白质疏松，部分呈筛网状坏死，后期有不同程度细胞增生，脑室扩大。治疗 后,组排列紊乱有所改善，坏死灶缩小。髓鞘染色:,组髓鞘染色排列有序，厚度 均匀，,及治疗前,组髓鞘稀疏变薄，治疗后,组髓鞘稀疏改善。,(细胞凋亡和少突胶质细胞,,双标记检测: 生后,天,、,组就出现凋亡细胞数增多，,天达高峰，以标记,,阳性的少突 胶质细胞前体为主，两组间差异无统计学意义(,,,(,,)，,组凋亡细胞数少见， 与,、,组比较有显著性差异(,,,(,,);,天后,、,组凋亡细胞数减少，但仍 较,组多，差异有统计学意义(,,,(,,);,,天三组凋亡细胞数无明显差异(,, ,(,,)( 〔结论〕 ? 水浴法延迟剖宫产术构建,,,模型是可行的。针刺治疗对缺血缺氧未成熟鼠的 脑发育和髓鞘形成具有明显的促进作用，可以作为缺血缺氧性脑损伤治疗的措施。〔关键词〕 未成熟鼠缺氧缺血脑白质损伤脑室周围白质软化针刺髓鞘形成 ,,,,;, ,, ,;,,,,;,,,, ,,,,,,,, ,,, ,,,,, ,,,,,,,,,,, ,,, ,,,,,,,,,,, ,, ，,,,,,,, ,,,,、杭,, ,,,,,,,,,,;,,,,; ,,,,, ,,,,,, ,,,,,,;,〔,,,,;,,,,〕 ,,,,,,,,,,;,,,, ,,,,,,,, ,;,,(,,,),, , ;,,,,, ,,,,, ,,,,,,，,,,;, ,, ,,,,;,,,,,,,,,,, ,,,, ,,,,,,,,, ,,,,,,,，,,,,,,,，,,;,,,,,，,,,,;,,,,，,,,,,,,,,,,,,,,,,,，,,,,,;,,,,;,, ,,,,,,,,,,,(,,,, ,,,,,,,,, ;,,,,;,, ,,,,,,,,,,, ,,,,,,, ,,,,;,,,，,;,,,,;,,,, ,, ,,,,;,,,, ,,, ;,,,,,,,,,;,,,, ,,,,,,,(,,, ,,,,,,, ,, ,,,, ,,,,, ,, ,,,,,,,,, ,,,,;,, ,, ,;,,,,,,,, ,,,,,,, ,,, ,,,,, ,,,,,,,,,,, ,,, ,,,,,,,,,,, ,, ,,,,,,,,,,,,、析,, ,,,,,,;,,,;,,,,; ,,,,, ,,,,,,(【,,,,,,,〕 ,, 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,,,,,,,,,,, ,,,,,,,,, ,,,,,,,,,,,,,,四甲基罗丹明异硫氰酸盐,,,,, ,,,,,,,,,,,, ,,,, ,,;,,,,, ,,,,,,,, ,,,介导的,,,,缺,,末端标 记技术,,, ,,,, ,,,,,, ,,;,,, 神经生长因子,,,, ,,,,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,,,; ,,;,,, 脑源性神经营养因子舢, ,,,,,,,,, ,,,,;,,, ,,;,,, 凋亡诱导因子 学位论文原创性声明和版权使用授权书 学位论文原创性声明 本人郑重声明:所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的真实成果。除文中已注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本论文的研究做出重要 贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。作者签名(手写):皿 导师签名(手写): 兰幽年上月』,日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构(如国家图书馆、中国学术期刊电子杂志社的《中国优秀博硕士学位论文数据库》、中国科学技术信息研究所的《中国学位论文全文数据库》等)送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权福建医科大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 (保密的学位论文在解密后适用本授权书)作者签名(手写):皿 导师签名(手写) 丝～置年上月,,日 前言 近年我国每年出生早产儿约,,,万。随着医疗技术的发展及新生儿重症监护室 (,,,,,,,, ,,,,,,,,, ;,,, ,,,,,，,,)抢救、监护、喂养技术的成熟，极低出牛体重,,(,,,, ,,, ,,,,, ,,,,,,，,,,,舶存活率可达,,—,,,以上，超低出牛体重儿的存活率在过去十年内由,,,提高到,,,，但这些存活的极低和超低出生体重儿中,,,存在中重度的神经系统后遗症，发育正常的只占,,,,,】 早产儿脑损伤表现与足月儿不同，多表现为脑白质的损伤，,,显示脑室周围散在斑片样低密度灶，称为脑室周围白质软化(,,,,,,,,,,;,,,, ,,,;,,,,,;,,，,,,)有的显示为弥漫性白质疏松，密度不均匀，这些病理变化统称为脑室周围白质损伤(,,,,,,,,,,;,,,,,,,,,, ,,,,,, ,,,,,,，,,,，),,,,的发牛率为所有活产儿的,,，应用,刚作为检测手段，这些患儿中脑白质损伤的发病率为,,,,,，,】。因此脑白质损伤己成为新生儿脑损伤的重要形式。 ,,,,等【,】证实早产儿在围生期发牛脑白质损伤后，,,,,,,,在,学龄期会发生认知和学习网难，,,‰,,,存在视觉异常，,,,存在运动功能损伤。运动缺陷表现为从轻微的运动异常至严重的痉挛性运动缺陷，如脑瘫(;,,,,,,, ,,,,,，,,)等【,,。早产儿脑白质损伤后遗症的治疗和护理给社会带来严重的经济负担。,,,,年美国,,,的统计表明，,,,,年出生的脑损伤早产),至,,,,,,年精神发育迟缓的花费为,,,亿美元，脑瘫花费，,,亿美元，听力损害患儿花费,,亿美元，视力损害患儿花费,,亿美元【,,。由于早产儿脑白质损伤发病率高，并发症发生率高且后果严重，脑瘫的发生严重影响患,,,,童期学习及活动能力，因此研究早产儿脑白质损伤的发病机制，对临床有效治疗早产儿脑白质损伤、降低脑瘫发生率、提高早产儿牛存质量、减轻社会经济负担有极其重要的意义。 近年来早产儿脑白质损伤机制一直是国内外研究的热点。目前认为其发病机制主要包括脑室周围血,,～,;因素，成熟度依赖的少突胶质细胞(,,,,,,,,,,,;,,,,,)损伤机制以及感染和炎症反应【,,。其？,,,,丰要的发病因素是少突胶质细胞的前体细胞(,，(,,,,,,,,;,,, ,,,;,,,,, ;,,,，,,,)对各种损伤具有高度的易感性。目前大多数人认为，,,,丰要发牛在血毹;的边界区，发育中的白质(丰要是少突胶质细胞)对缺氧缺血损伤(丰要为缺血)具有高度的易感性，可导致脑白质严重缺血性损害，引起轴突间信号传导异常。中晚期妊娠时少突胶质细胞发育经过三个阶段:,、少突胶质细胞的前体细胞(,,,)，主要表达蛋白多糖,,(,和抗原,,。,、未成熟的 少突胶质细胞。,、成熟的少突胶质细胞。,,,的高危时期(,,(,,周妊娠)少突胶质细胞系,,,是,,,，,,,对各种损伤具有高度的易感性，因而导致少突胶质细胞减少和髓鞘发育延迟，白质容积减少，进而灰质异位和皮层容积减少，出现运动、认知、知觉、行为异常及顽固性癫痈。,,,在脑白质内增殖分化形成髓鞘前的一段时,,？(,类为,,(,,孕周)为,,,的高危期【引。 ,,;,等【,】亦证实,,,相比成熟,,更易受到缺氧或感染性损伤，因此,,,的选择易损性是早产儿发牛脑白质损伤的重要原因之一。 少突胶质细胞是中枢神经系统的重要的成髓鞘细胞，膜上分布有大量的兴奋性氨基酸受体和转运体，与神经元及其它胶质细胞构成神经网络，其作用不仅是构成中枢神经系统轴突的髓鞘，尚能合成和分泌多种神经营养因予和牛长因了饽,，影响神经元及胶质细胞自身的发育和存活，同时也表达抑制蛋白，阻止神经纤维过度生长和轴突再牛,叫朗。 少突胶质细胞前体细胞对自由基的易感性在脑白质损伤中起着决定性的作用。其引发的丰要病理特征为生长中少突胶质细胞的弥漫性损伤伴髓鞘形成减少。有动物实验表明，产前慢性缺血的幼鼠出生后即表现弥漫性白质损害及巨噬细胞过度活跃，其后出现星形胶质细胞增生，轴突髓鞘形成不足一直持续至成年期，伴随扣带前少突胶质细胞密度的减少, ,,。因此，少突胶质细胞在中枢神经系统的地位越来越受到重视，其与多种原发性或继发性脱髓鞘疾病密切相关，了解其发育、增殖、分化以及髓鞘形成的机制，有助于这一类疾病的治疗。 动物实验表明，针刺可减轻缺血脑组织的酶代调,障碍从而改善脑能量代谢，增加脑梗死后脑组织微循环灌注，对抗脑损伤后诱发的兴奋性氨基酸和自由基损伤，减少缺血后脑损伤区神经细胞的凋亡，并能够促进神经再生、突触形成、轴突牛长，恢复神经功能支配，从而加强神经重塑，促进神经功能恢复,?。目前针灸治疗对小儿脑瘫的治疗已经取得公认的疗效，但其机理还未完全阐明。因此了解针灸对少突胶质细胞及髓鞘形成的影响，可以更好的用以指导临床实践。 本研究拟通过观察针刺对脑室周围白质软化大鼠模型少突胶质细胞及髓鞘形成的影响，探讨针灸治疗,,,的中枢机制，为临床研究提供理论和实验依据。 材料 关于××同志的政审材料调查表环保先进个人材料国家普通话测试材料农民专业合作社注销四查四问剖析材料 与方法,实验材料,(,实验动物: 成熟清洁级,,大鼠(购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，产品批号:,,,,,,,，许可证号:,,,,(沪),,,,—,,,,)。其中雌性大鼠,,只，雄性大鼠,,只，体重,,,,,,,,。,(,主要试剂及仪器:,，,,标记,,,,,原位细胞凋亡检测试剂盒(碧云天生物有限公司)小鼠抗,,一抗(,,,公司),,，,,标记羊抗小鼠二抗(博奥森生物有限公司)恒温水浴箱(上海医疗器械有限公司)华佗牌电针治疗仪(苏州医疗用品厂有限公司)光学显微镜(日本奥林巴斯公司)荧光显微镜,,,,,,,(,,本尼康公司)激光共聚焦扫描显微镜,,,型(德国莱卡公司)石蜡切片机(德国莱卡公司)冰冻切片机(美康国际有限公司)超纯水系统(,,,,,,,,,公司)电子天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)超低温冰箱(英格兰公司),(实验方法 ,,(,动钧模型嗣作与分组 将雌性丈鼠与雄性大鼠常规饲养，饮食自由，明暗周期,,,,,,,，室温,,?,?，环境适应两周后，于下午,,时雌雄大鼠比例按,:,合笼，次日上午,时蠢阴道涂片，以查得精子为妊娠第,天，孕鼠另笼饲养。随机选取,,只孕鼠，分为实验组(,,,,)和对照组(?,,)，孕,,天时用己醚吸入麻醉后剖腹，对照组孕鼠剖腹后打开子宫即刻取出胎鼠，随机获胎鼠?只为空白对照组(,组)，称重后 代乳鼠喂养，饲养温度,,,,,”(,，氨浓度在,,,,,以下，噪音控制在,,,,以下环境中，饲养室及用具定期消毒灭菌。实验组孕鼠剖腹后取出子宫，簧于,,?水浴中,,,,,后行延迟性剖宫产取出胎鼠，随机获取胎鼠,,只井分为模型组(,组)和模型，针刺组(;组)。备组再分出五个时间点(,，,，,，,(,,天，按上述条件代乳鼠喂养。,(,治疗方法 喂养,天后对,组大鼠进行针刺治疗，针具,,号，寸毫针。取穴及针法:顶骨正中取“百会”，桡骨近端的关节外侧前方的凹陷中取“曲池”，前肢内侧、离腕关节约,珊左右的尺桡骨缝问取“内关”，膝关节后外侧。腓骨小头下约, ,,处取 “后三里”，后肢掌心前正中取“涌泉”穴，白上而卜。由左至右迅速针刺(微出血为宜。其中“百会”、“曲池”，“后三里”接电子穴位治疗仪，固定频率, ,,，连续波，持续刺激,,,,,,，每天一次，连续,,天(图,)。而,组和,组不做针刺处理，置于相同环境中喂养。 图， 电针治疗幼鼠,(,脑组织标本取材与固定 将动物应用乙醚麻醉，仰卧位固定于手术台，用左手持镊子灾起腹部皮肤，右手持剪刀自腹部剪,,,”,，由此沿腹中线向前剪甭下领，分离皮下结缔组织，将皮肤翻向两侧:沿胸骨剑突中线纵行切开，沿膈或肋缘向两侧剪开，打开胸腔曝露心脏;小心用镊子将心包打开，将连接生理盐水的灌注针插入左心室，然后开放生理盐水进行灌注。待见到右心雹逐渐膨胀起来时，用小剪刀将右心耳剪开一叫、孔，使血液排出。如此冲洗直到肝脏变白，停止灌注。小心剥取脑组织，称脑重后取左侧脑组织放入,,多聚甲醛固定液中保 过夜后转置一,存“小时后转放,,,乙酵保存。右侧脑组织置,,,蔗糖溶液,?,?冰箱保存。,(,石蜡切片制作 生后,，,，,，,(,,天再耿三组存活大鼠,只共,,,只(取其脑组织标本制作石蜡切片。石蜡切片制作方法见下:,,,乙醇过戎，,,,已酵,脱水,,,，),钟，,,,乙醇，,脱水,,分钟(无水厶醇，脱水,,分钟，无水乙醇，，脱水,吩钟，放入乙醇二甲苯混合液中,,分钟,放八二甲苯，，，，中各,,分钟进行透明，浸蜡,次共,,分钟后包埋，连续切片，厚度, , ,，切面包括侧脑定、纹状体、胼胝体和外囊(,,)，每个脑组织块切片,,张备用。 ? 娶噩?„,— , 圈, ,,×,,脑组织切片断面 ,侧脑室,纹状体,胼胝体,外囊,(,,,染色 石蜡切”二甲苯，脱蜡,,分钟。一甲苯，，脱蜡,,分钟，无水己醇脱二甲苯,分钟,,次，,,,乙醇,分钟，,,”,,乙醇,分钟，,僻,乙醇,分钟，,竹;己醇,分钟，自来水洗,分钟，苏木素染色,分钟，自来水洗,分钟，,,盐酸乙醇分化,,秒，自来水洗,分钟，稀氨水返蓝,,秒，自来水或蒸馏水洗,分，伊红染色,分钟，自来水洗,,秒，,,,乙醇脱水,,秒，,,,乙醇脱水,,秒，,,,,,，醇,,)钟，,,,，，乙醇,分钟，无水 乙醇,,分钟，无水乙醇，，各,分钟，二甲苯,,分钟，二甲苯，， ,分钟，中性树胶封固后光学显微镜下观察。,(,髓鞘染色(,,,氏染色法),(,(,试剂配制 ,液苏木素,,，无水乙醇,,,,, ,液硫酸铁铵,,，蒸馏水, ,,,, ,液铁氰化钾, ,(,,，硼砂,(,,，蒸馏水, ,,,,, ,液综合染色液，,液,份，,液,份，蒸馏水,份 ,,,,,,红染色液,,,,,,红,,,,，,(,,,, ,,,,,,《爱冲液,,,(,，蒸馏水,,,,,,，加热 溶解过滤 ,(,(,染色方法 将石蜡切片常规脱蜡、脱水后将切片浸入,液染,,分钟，在水中洗，在,液中分色，直至灰质和白质可以区别为止，在自来水中清洗，蒸馏水中洗,次，在,液中分色后用,,,,,, 红染色,分钟，脱水、透明、中性树胶封固后光学显微镜下观察。,(,细胞凋亡和少突胶质细胞,,双标记检测,(,(,试剂配制 洗涤液(,,,(,的磷酸盐缓冲液,,,，,(,,,) ,,,, ,(,, , ,,,,,,,, ,,,, ,(,,, ,,,,,,,,,,,, ,(,,, 加纯水至,,,, ,, 稀释液(,,,(,的磷酸盐缓冲液，,(,,) ,,,, ,(,,, ,,,,,,, , ,,,, ,,(,,, ,,,,,,,,,,, ,(,,, ,, 加纯水至,,,, ,, 渗透液 取,,,,,双蒸水加入,(,,,,,,,,,,一,,,和,(,,柠檬酸三钠配成,(,,,,,,,,,一,,,，,(,,柠檬酸三钠，新鲜配制。 封闭液 ,,,, ,(,,,的磷酸盐缓冲液中加入,(,,,,,，新鲜配制。,(,(,实验方法 冰冻切片于,,,洗涤液漂洗三次，加入蛋白酶,(浓度,,,,,,,),,,,，, ,?消化,分钟，,,,洗涤液漂洗三次，加入标记有,，,,荧光素的凋亡反应液,,,,避光,,?孵育,,分钟，,,,洗涤液漂洗三次，渗透液中室温下反应,,分钟，,(,,,,,(,(,,, ,,,配制)中漂洗三次，封闭液室温下反应,,分钟，少突胶质细胞,,抗体(浓度,,,,,,,),,,,滴加于切片上,”,过夜，,(,,,,,中漂洗三次，少突胶质细胞,,第二抗体(浓度,:,,,)避光室温下孵育,,分钟，,,,洗涤液漂洗三次，磷酸缓冲甘油封片，荧光显微镜下(,，,,荧光素为激发光波长为,,,,,，吸收光波长为,,,,,)及激光共聚焦显微镜下(,，,,为发射光波长为,,,,,，吸收光波长为,,,,,;,,，,,为发射光波长为,,,,,，吸收光波长为,,,,,)观察。,(,生后,,天神经行为学检测,(,(,悬吊试验;使大鼠前腿抓住一水平的玻璃棒(直径,(,;,)，离开桌面,,,,， 记录 混凝土 养护记录下载土方回填监理旁站记录免费下载集备记录下载集备记录下载集备记录下载 大鼠掉下的时间，并进行评分，两组比较。评分标准:,分:,,,,;,分:,卜,,,;,分:,,,一,,,,;,分:,—,,,,;,分:,,,,,。,(,(,斜坡试验:将大鼠头向下倒置于,,„斜面上，记录大鼠转为头向上,,,,。角度的时间，以秒为计算单位，进行两组比较。,(,(,旷场试验:装置为,,;,,,,;,,,,;,无顶方盒，箱底用墨线分成,个等分小将大鼠置于中央小方格内，观察,,秒内活动情况。计分标准:大鼠,,,以上身体从所在方格进入相邻方格记,分;大鼠后肢站立计,分;二者相加为其总分。,(,统计学分析: 应用,,,,,,(,统计分析软件，两组样本间比较采取,检验，结果以(,?,)表示，,,,(,,为有统计意义。各均数比较采用单因素方差分析，,,,(,,有统计意义。 结果,(生后一般情况 刚出生时模型组大鼠皮肤紫绀或苍白、呼吸不规则，体温低(冰凉，四肢松软(反应较差，部分出现肢体抖动，给予保暖，心脏按压等处理，约,小时后症状改善，但仍活动少，生后生长发育迟缓。体重减轻，睁眼延迟，站立、行走不稳;而对照组活动，体重、睁眼等生长发育均正常(图,。,，,)。图, ,对照组,模型组 罔,，对照组,模型组 ,组体重高于,组 ,组睁眼正常(,组延迟图, ,组对照组,组模型组 ，组活动如常,组站立、行走不稳,体重和脑蘑变化 (,)体重 分别于从出生、生后第,,、,,、,,、,,、,,,测量,组大鼠体重(资料见表,)。出生时,组体重经,检验，,,, ,,，差异无统计学意义，组问具有可比性。术后第,、,、,、,天，组火鼠体重增加明显，,组、,组体重增长较慢，,组比较差异有统计学意义(,,,(,,)，,与,组比较差异无统计学意义(, ,,(,,)(至生后,,,，,组体重快速增长，,组明显高于其,组，组间比较有显著性差异(,,,(,,)(,组体重明显高于,组，差异有统计学意义(,,,(,,)。 表, ,组火鼠不同日龄体重比较(单位:,)(,?,) 组另, 出生时 ,, ,, ,, ,, ,,,,组,(,,?,(,, ,(,,?,(,,料,,(,,?,(,,木,,(,,?,(,,擗,,,(,,?,(,,,;,,,(,,?,(,,埠:,,组 ,(,,?,(,, ,(,,?,(,, ,(,,?,(,, ,(,,?,(,, ,,(,,?,(,, ,,(,,?,(,,并,组 ,(,,?,(,, 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