神经生长因子脂质体大鼠鼻腔给药的药效学研究
谢英,杜熠,耿兴超,侯新朴。(北京大学药学院药剂系,北京100083)
摘要:目的对神经生长因子(nervegrowthfactor,NGF)和NGF脂质体(NGF-SsL)鼻腔给药的药效学进行研究,并与NGF静脉给
药相比较。
方法
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鹅膏蕈氨酸(ibotenicacid,IBO)大鼠Meynert核注射制造阿尔茨海默氏病(alzheimer’Sdisease,AD)模型,以生
理盐水Meynert核注射作为假手术对照组,通过水迷宫试验,跳台实验和乙酰胆碱酯酶(AchE)组织化学染色来评价AD模型。
并应用此模型采用同样方法研究NGF静脉给药,NGF和NGF-SSL鼻腔给药后的药效。结果AD模型经鉴定能够应用于药效
研究。NGF鼻腔给药药效优于NGF静脉注射,NGF经脂质体包载后药效进一步提高。NGF-SSL鼻腔给药后能明显保护胆碱能
神经元免受损伤,动物游泳时间缩短,跳台潜伏期延长,AchE染色积分光密度接近正常大鼠。结论鼻腔给药能够实现药物
给药途径上的脑靶向,药物经脂质体包载后能明显增加其脑摄入,提高药效。
关键词:神经生长因子;脂质体;鼻腔给药;药效
中图分类号:R969.4 文献标识码:A 文章编号:1001—2494(2005)10—0742—05
StudyontrealmentofADbyNGFliposomesvianasaladministration
XIEYing,DUYi,GENGXing-chao,HOUXin—pu+(DepartmentofPharm,叫,SchoolofPharmaceuticalSciences,PekingUniversity,
8e访愕100083,Ch/nal
ABSTRACI":OBJECllVETostudythephannacedynamicparametersofNGFandNGFstericallystabilizedhposomes(NGF—SSL)vianasal
administrationandcomparewithNGFintravenousinject.METHODSAlzheimer’sdisease(AD)modelwasmadebyMeynertnucleusinject—
ed访thibotenicacid(IBO).andwasevaluatedbytllewatermaze,footshockavoidanceandAchEHistochemistrystainingtests.1hepharma—
cedynamieparametersofNGF(iv)andNGF,NGF-SSL(na)werestudiedbyusingtheADmodel.RE吼Ⅱ门暇ADmodelWasappraisedtobe
suitableforstudyingthepharmacologyefficacyofNGF.r11lepharmacedynamicsofNGFvianasaladministrationwasbetterthanthatofNGFin·
travenousinject,andthatofNGF-SSLvianasaladministrationWasfu血erimproved.Nasaladministrationprotectedthecholinergicneuronfrom
beingdamagedbyIBO,theswimtimeoftheratsWasshorten,andthefootshockavoidancelatencyWasextended,theintegralspectr(卜density
ofAchEstainingwasneartothatofcontrolrats.CONCLUSIONNasaladministrationisabetterwaytotargetthebrain,andthebrainup—
takeofdmgmodifiedwithlioposomeswouldbeincreased,thephannacodynamicswouldbeimproved.
KEYWORDS:nervegrowthfactor(NGF);liposome;nasaladministration;pharmacedynamics
血脑屏障(blood—brainbarrier,BBB)的存在使得
常规给药途径脑内药物浓度都比较低,限制了脑部
疾病的治疗。鼻腔与颅腔在解剖生理上的独特联系
使得将鼻腔给药作为脑内递药途径成为可能。药物
经鼻黏膜吸收入血,同时也能从外鼻孔向后到达鼻
腔与颅腔的筛孔,此处组织屏障作用最弱,有利于难
以透过BBB的药物直接进入颅内。这种给药方式
方便,患者易接受,是药物绕过BBB进入脑组织的
一条有效途径。
神经生长因子(nervegrowthfactor,NGF)对损伤
的神经元具有保护和修复作用,是预防和治疗阿尔
茨海默氏病(Alzheimer’Sdisease,AD)的理想蛋白多
肽类药物。但由于其难以透过BBB,因此目前给药
方式仅限于脑室注射和植入埋植剂。Frey等llj最早
研究过NGF通过鼻腔给药后脑组织的摄入,结果发
现125I标记的NGF在鼻腔给药后20min即在嗅球中
出现,脑内其他部位也有分布,但量少。为避免蛋白
多肽类药物被鼻黏膜上的蛋白酶水解和氨肽酶降
解,常使用酶抑制剂、对药物进行化学结构修饰或应
用大分子载体等方法来增加肽类及蛋白质药物在鼻
腔内的稳定性心J。本实验将对NGF鼻腔给药在大
鼠体内药效学进行研究,并考察用脂质体包载NGF,
对NGF脑摄人的影响。
目前有多种AD动物模型引3,如外科手术切段
穹隆.海马伞造成胆碱传递障碍,应用衰老加速小
鼠SAMP系列,采用化学神经毒素如鹅膏蕈氨酸、
基金项目:国家自然科学基金资助项目(30171114)
作者简介:谢英,女,硕士,讲师 +通讯作者:侯新朴,女,教授Tel:(010)82801508
·742·ChinPharmJ,2005May,V01.40No.10
Fax:(010)62015584E.mail:houxinpu@bjmu.edu.∞
万方数据万方数据
红藻氨酸、AF64A及使君子酸等进行基底核注射,
损害神经元,导致学习记忆功能障碍和胆碱能功能
丧失。NGF生物效应是能够使受损的神经元恢复
或保护神经元免受损伤,利用神经毒素鹅膏蕈氨
酸[40]进行Meynert核团注射制造的病理模型和
NGF的生物学效应相对应,是研究NGF药效最为
合适的模型。
胆碱能神经元受损后在行为上表现为认知记忆
能力障碍,在病理学上表现为胆碱能神经数目减少,
乙酰胆碱酯酶(AchE)含量降低L6J。本实验通过行
为学实验如水迷宫实验,跳台实验和AcllE的组织
化学来评价NGF脂质体的药效。
1
材料
关于××同志的政审材料调查表环保先进个人材料国家普通话测试材料农民专业合作社注销四查四问剖析材料
和方法
1.1材料和仪器
NGF(Mr=26×103,浙江永宁制药厂);豆磷脂
(SPC,德国LucasMeyerGmbH公司);胆固醇(Chol,
北京化学试剂公司);二硬脂酰磷脂酰乙醇胺一聚乙
二醇(DSPE—PEG-2000,日本NOF公司);水合氯醛
(天津华东试剂厂);鹅膏蕈氨酸(ibotenicacidIBO,
Acms公司);碘化乙酰硫代胆碱Acros公司)。
SD大鼠(200±12)g(北京大学医学部)。大鼠
脑立体定位仪(北京江湾Ⅱ号)。SLEICA&550CW
图像分析系统(德国)。
1.2鼻腔给NGF脂质体[NGF.SSL(na)]的制备
采用逆相蒸发法制备NGF脂质体。按SPC—
Chol一(DSPE—PEG)=24:16:1比例取适量的SPC,Chol
和DSPE—PEG-2000,用二氯甲烷一正己烷=1:1溶解,
加入适量NGF,涡旋振荡后超声1min使其形成均
匀的W/O型乳液,减压蒸发至形成凝胶态物质后,
继续旋转蒸发10min。然后补充一定量的生理盐水
使其水化,分散成均匀的脂质体混悬液。
1.3 AD模型的制造
取sD雄性大鼠20只,腹腔注射10%水合氯醛
麻醉(0.4mL·1009。1)。头部固定在大鼠脑立体定
位仪上,剪去大鼠头顶部被毛,酒精棉球消毒,沿大
鼠头顶部皮肤正中线用眼科剪剪一约0.5cm切口,
再用单面刀片沿切口轻划至头骨清晰可见,用10%
的双氧水擦洗切口及周围,以前囟门为基点,根据大
鼠脑立体定位图谱一J,确定Meynert核位置,坐标为
脑正中线旁侧2.0lnln,前囟前一1.4mln,硬脑膜下
7.0Bin。用电钻在坐标处垂直颅骨钻孔后,用10皿
微量注射器沿钻孔轻轻插入至靶点,缓慢注射5腭·
mLo的鹅膏蕈氨酸,两侧各2皿,注射后留针1
min,用强力胶粘合伤El皮肤。假手术组注射2皿
的生理盐水。单笼饲养,动物2d后恢复行动自由。
饲养7d后,进行模型评价。
1.4 AD模型的评价旧J
1.4.1水迷宫实验水迷宫泳箱由聚乙烯塑料制
成,110cm×115cm×35cm,泳道宽15cm。水深20
cm,水温(25±1)℃。训练期:首先将大鼠在安全台
上放置10S适应环境,然后分别将大鼠依次放入第
二、第三、第四盲端,由近至远,逐渐加长路程。当大
鼠游到台处,并爬上台后,进行下一盲端训练。训练
结束第2天同一时间进行记忆测验:首先将大鼠在
安全台上放置10S,然后将大鼠放置安全台附近处
水中,使其自动爬上台1次。实验时将大鼠放置第
五盲端,同时启动秒表,记录到达终点的时间和错误
次数。设定实验时间为180S,超过180S不能游出
者按180S计。第3天重复记忆实验。
1.4.2 跳台实验该装置为20cm×20cm×60cm
的被动回避条件反射箱,用黑色塑料隔板分隔成2
间,底部栅板(间距0.5em)可以通电。第1天学习
成绩测定:将大鼠放入跳台仪中,适应环境1min,然
后立即通以36V交流电,大鼠受电击后蹦窜,记录
大鼠第1次找到安全台的时间,以及此后跳下台的
错误次数作为学习成绩,记录时间为180S。24h记
忆成绩测定:将大鼠放入同前一次的测定箱中适应
环境1min,然后将大鼠放在安全台上,通电计时3
min,记录大鼠第1次跳下安全台的时间为潜伏期,
以及此后跳下台的错误次数。记录时间为3min。
48h重复记忆成绩测量。
1.4.3 AchE的组织化学恻9①脑组织的固定:大
鼠腹腔注射10%水合氯醛(40mg·1009-1)麻醉,固
定大鼠,暴露心脏,通过左心室依次灌注生理盐水和
4%多聚甲醛。2h后取脑,在4%多聚甲醛溶液中
固定4h,置30%蔗糖溶液4℃饱和至沉底,做冰冻
冠状切片,厚度为20tan。②AchE染色:切片先用
0.1mol·L。1醋酸钠缓冲液(pH6.0)浸洗2次,然后
在反应液[32.5mL0.1mol·L。1醋酸钠缓冲液(pH
6.O),2mL0.1mol·L一枸橼酸三钠,5mL0.03mol·
L~CuS04,9.5mLn20,1mL0.005mol-L一1
K3FecN6,25IIlg碘化乙酰硫代胆碱]中反应30min。
切片经0.1mol·L。1醋酸钠缓冲液(pH6.0)浸洗后
依次用1%NH4S04和0.1%AgN03处理。最后切片
经乙醇梯度脱水,二甲苯中透明处理,中性树胶封
片。③积分光密度测定;用图像分析系统测量单位
面积内AchE的积分光密度,定量参数为每
5949412.00心内AchE阳性细胞覆盖的面积与光
Ch/nPharmJ,2005May,V01.40No.10‘743。
万方数据万方数据
密度的乘积。测量纹状体尾壳核CPU和海马CA
区,每组实验取相同部位3张切片,以AchE阳性细
胞积分光密度的平均值做统计分析。所有结果按
SPSS8.0统计软件包做t检验处理。
1.5 NGF及NGF脂质体药效学研究步骤
1.5.1取SD雄性大鼠40只,饲养2d后,用水迷宫
实验筛选均匀分组。将大鼠分为4组,分别为生理
盐水(iv),NGF(iv),NGF(na),NGF.SSL(na)组。尾静
脉注射和用乙醚微麻后鼻腔给药,给药部位为鼻孔
内0.4cm。给药剂量均为NGF:10ttg·100g‘。,每13
1次给药,连续给药7d。
1.5.2按照“1.3”实验方法制造AD动物模型。造
模后2d,动物基本恢复自由活动,继续给药7d,每
日1次。
1.5.3采用前述水迷宫实验和跳台实验方法。
1.5.4每组选择2只动物做AchE染色,方法同
“1.4.3”项下。
2结果
2.1鼻腔给NGF脂质体的性质
用逆向蒸发法制备的NGF—SSL(na)具有蓝色乳
光,清亮透明。其包封率为(27.05±1.78)%。
粒径<100Hill。
2.2 AD模型建立及评价
2.2.1 学习记忆障碍水迷宫结果和跳台结果见
表1,2。
表1鹅膏蕈氨酸(IBO)Meynert核注射对大鼠水迷宫成绩
的影响.n=4~6,x±5
Tab1 EffectonthelearningandmemorydeficitsinducedbyIBO
inratsbywatermaze.n=4~6.露±s
注:1)P<0_ol
Note:1)P<0.01
表2鹅膏蕈氨酸(IBO)Meynert核注射对大鼠跳台成绩的
影响.n=4~6,元-4-s
Tab2 EffectonthememorydeficitsinducedbyIBOinratswith
footshockavoidanceasindex.n=4~6.贾±s
注:1)P<0.01
Note:1)P<0Ol
从表1和2的水迷宫实验和跳台试验可以看
·744·ChinPharmJ,2005May,V01.40No.10
出,IBO造模组游泳时间显著延长,错误次数增多,
跳台记忆实验潜伏期缩短,错误次数增加。而生理
盐水假手术组与正常大鼠学习记忆能力无显著差
异。
2.2.2 AchE阳性细胞分布、定量分析⋯用生理
盐水造模和IBO造模后,脑组织切片染色后,显微镜
下从CPU区和CA区染色结果中可见生理盐水假手
术组AchE表达阳性,细胞呈红棕色,可见清晰神经
纤维,而IBO损伤造模组AcIlE表达阴性,细胞呈灰
色,表达AchE量很少。经图像分析后,发现IBO造
模组的积分光密度明显低于生理盐水假手术组,图
像分析结果见表3。
表3比较鹅膏蕈氨酸(IBO)和生理盐水Meynert核注射后
大鼠CPU和CA区的AchE积分光密度
Tab3 Comparisonoftheintegralspectro-densityofAchEinduced
bvIBOorNS
注:1)P<0.01
Note:1)P<0.01
由上述结果可以看出,IBOMeynet核注射制造
的AD模型在行为学上表现出认知记忆障碍,在病
理学上表现AchE量显著减少,具有AD临床和病理
特征。
2.3 NGF及NGF脂质体鼻腔给药后药效学研究
2.3.1 NGF鼻腔给药后大鼠行为学研究结果sD
大鼠造模前后鼻腔给药,2周后进行水迷宫和跳台
实验,实验结果见表4和5。水迷宫结果显示,与生
理盐水尾静脉给药[Ns(iv)]组和NGF静脉给药组
[NGF(iv)]相比,NGF和NGF.SSL经鼻给药[NGF
(Ha),NGF.SSL(na)]大鼠游泳时间明显缩短,错误
次数减少。尤其NGF—SSL(ha)组的学习成绩具有显
著性增加,其游泳时问已经基本与正常大鼠相近。
由此可见,NGF经鼻给药具有很好的提高大鼠空间
学习记忆能力的效果。
各组大鼠跳台的学习成绩和记忆成绩见表5。
当跳台通电后,NGF—SSL(na)组大鼠受电击蹦窜能够
很快找到安全台,而且上台后犯错误次数较少,而生
理盐水组大鼠很难找到安全台,即使跳上也很快跳
下,表现紧张不安。24h后记忆成绩测量时将大鼠
先放在安全台上再通电,发现NGF—SSL鼻腔给药组
大鼠一般能够坚持3’min的测量时间呆在台上不
动,极少有试探动作,而其他组大鼠常因跳下台受到
电击。从跳台成绩可以明显看出NGF—SSL经鼻给药
万方数据万方数据
表4 NGF及NGF脂质体鼻腔给药后对大鼠IBO损伤后水
迷宫成绩的影响.凡=4~10,x±s
Tab4 EffectofNGFliposomesfollowingnasaladministrationOil
thelearningandmemorydeficitsinducedbyIBOinratsbywater
maze.n=4~10.牙±S
注:1)P
O.05);EMS10.8
g·kg。1可延长大鼠颈动脉血栓形成时间(P<0.05)。结论EMS能降低血浆及血管壁中血栓素A2水平,具有调节TXA2与前
列环素平衡、抑制血栓形成的作用。
关键词:海洋贝类提取物;血栓形成;6-酮.前列腺素Fl。;血栓素赐
中图分类号:R282.77 文献标识码:A 文章编号:1001—2494(2005)lO一0746—03
StudiesoninfluenceofextractfrommarineshellfishEMSonPGFln/TXB2inratplasmaand剐臁wallandits
anti.thromobosisaction
L1USail,ZHONGWei—zhenl,WANGShou—lan2,LIUZhan—ta01,ZHANGJianl,SUNWei3(1.Depqnment旷劭彻啪∞如一
gY;2.NursingFaculty;3.Thea嘶ili,aeaHospital,MedicalCollege,QingdaoUniversity,Qingdao266001,Ch/na)
ABSTRACT:oBlECⅡⅥ£ToinvestigatetheinflHenceofthecomprehensiveextractfromⅡmrineshellfish(,EMS)onthecontentofthrom—
boxaneB2(TXB2,metaboliteofthromboxaneA2),6-Keto-PGFlainplasmaandaorticwall.Tostudytheeffectonthetimeofarterialthrombo-
sisandinvestigatethemechanismofanti.atheroscleroticaction.METHODS1heconcentrationsof7Ⅸ赐and6-Keto-PGFtainplasmaand
aorticwallweredeterminedbyradioimmunityanalyse(RIA).髓eexperimentalcarotidarterythromobosisinratmodelwasevaluatedbyelec—
tricstimulationinjury.Thentheactivityofanti.thromobosisofEMswasinvestigated.RE双】I胚EMS(5.4,10.8g-ks“)significiantlyde—
creasedtheamountofTXB2inaorticwall(P<0.05)anddecreasedthe1evelofTXB2inplasma(P<0.05).EMS(2.7,5.4and10.8g·
ks一)didn’tsignificantlyeffectontheconcentrationof6-Keto-PGFI。(P>O.05).EMS(10.8g-ks’1)obviouslypmlongodthethromobesis
timeinrats(P<0.05).CONCLUSION喃eanti.atherscleroticmechanismofEMSmayberelatedtothereductionofTXB2inplasmaand
aorticwallandtheinhibitionofthrombosis.
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吲
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例
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万方数据万方数据
神经生长因子脂质体大鼠鼻腔给药的药效学研究
作者: 谢英, 杜熠, 耿兴超, 侯新朴, XIE Ying, DU Yi, GENG Xing-chao, HOU Xin-Pu
作者单位: 北京大学药学院药剂系,北京,100083
刊名: 中国药学杂志
英文刊名: CHINESE PHARMACEUTICAL JOURNAL
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7.梅妮 盐酸利多卡因鼻腔凝胶剂的研制及脑内递药特性研究[学位论文]硕士 2006
本文链接:http://d.g.wanfangdata.com.cn/Periodical_zgyxzz200510007.aspx