结核

null结核分支杆菌及奶牛结核病的研究现状结核分支杆菌及奶牛结核病的研究现状前言：结核病防治研究的历史背景前言：结核病防治研究的历史背景结核病是一种古老的疾病。从《黄帝内经》到希波克拉底，世界各地早期的医学典籍都有对它有所描述，但长期以来人们对这种疾病一直束手无策。 1882年，德国细菌学家郭霍（Robert Koch，1843-1910）发现了结核分枝杆菌，明确了结核病的病因。结核病防治研究的历史背景结核病防治研究的历史背景1921年Calmette 和Guerin 研制出卡介苗； 1944年Waksman 发现了链霉素，链霉素等药物开始用于抗结核治疗 。人类终于首次在这场旷日持久的斗争中占了上风 。 60到70年代多种药物联合化疗 方案 气瓶 现场处置方案 .pdf气瓶 现场处置方案 .doc见习基地管理方案.doc关于群访事件的化解方案建筑工地扬尘治理专项方案下载 的使用，结核病的发病在全球范围内迅速下降；人们一度以为结核病会象天花、麻风等疾病一样淡出视线，然而近年来，随着全球人口的加速流动，人类免疫缺陷病毒(HIV)以及其他疾病的流行，耐药菌株的出现和传播，结核病再次抬头，成为当前急需解决的公共健康难题。 结核病防治研究的历史背景结核病防治研究的历史背景美国是第1个实行根除牛结核病的国家，自1971年实施消灭牛结核病的 计划 项目进度计划表范例计划下载计划下载计划下载课程教学计划下载 以来，已经使牛结核病发病率降至 0.5％，以后一直呈零星散发。美国于1998年实现了无结核病目标。欧盟国家于 20世纪50年代签署了控制牛结核病的协定，北欧的丹麦、比利时、挪威、德国和荷兰等国已基本消灭了牛结核病，英国和法国处在控制状态。大洋洲的澳大利 亚、新西兰等国家也已消灭了牛结核病。而西班牙的牛结核感染率为10%。前言：当前结核病流行形势前言：当前结核病流行形势然而近年来，随着全球人口的加速流动，人类免疫缺陷病毒(HIV)以及其他疾病的流行，结核病基因的多态性和变异，耐药菌株的出现和传播，BCG（卡介苗）效果不佳，诊断技术低劣，防治 措施 《全国民用建筑工程设计技术措施》规划•建筑•景观全国民用建筑工程设计技术措施》规划•建筑•景观软件质量保证措施下载工地伤害及预防措施下载关于贯彻落实的具体措施 削弱等，结核病再次抬头，成为当前急需解决的公共健康难题。 1980年代中期以来，结核病疫情在世界范围内出现回升或失控趋势。全球有三分之一的人口约20亿感染过结核分枝杆菌，结核病人约2000万人，每年新增结核病人800万~1000万，死亡300万。 当前结核病流行形势当前结核病流行形势根据WHO的报道，2009年全球约有9,400,000新发结核病患者，1,700,000人死于结核病。结核病的发病在全球不是均匀分布的，发病率最高的国家为撒哈拉沙漠以南的非洲地区，印度以及前苏联各国，80%患者居住于经济欠发达的国家和地区，结核病患者人数最多的国家是印度，其次是中国（见图1）。null图1.中国1990年至2009年结核病患病及发病情况。(根据世界卫生组织2010年结核病控制年度 报告 软件系统测试报告下载sgs报告如何下载关于路面塌陷情况报告535n,sgs报告怎么下载竣工报告下载 数据 )当前结核病流行形势当前结核病流行形势牛是结核病最易感的动物，由于牛(牛奶、牛肉、耕牛等)和人的关系，牛结核也是人结核最大的传染源之一。牛结核病和人结核病可以相互传染，2009年，杨醉宇等人通过试验发现牛结核病牛中有 9.5％是人分枝杆菌感染，而结核病人中有 10.6％为 M.bovis感染 。当前结核病流行形势当前结核病流行形势1960年，世界卫生组织(WHO)就指出：“在那些还存在牛结核的国家中，人类始终受到它的威胁，除非着手消灭牛结核病，否则人类结核病的防制是不会成功的”。 1993年，WHO宣布“全球进入结核病紧急状态”，1997年再次提出“遏制结核病的行动刻不容缓”。 null结核分支杆菌的生物学特性结核病的 检测方法目录结核病的预防与治疗一、结核分枝杆菌及其生物学特性一、结核分枝杆菌及其生物学特性一、结核分枝杆菌及其生物学特性一、结核分枝杆菌及其生物学特性定义： 结核病（tuberculosis）是由分支杆菌引起的人和动物共患的一种慢性传染病，其特点是在多种组织器官形成结核结节和干酪样坏死或钙化结节病理变化。 1.1 病原 1.1.1 形态与染色 病原是分支杆菌属（Mycobacterium）的3个种，即结核分枝杆菌（简称结核杆菌）（M.tuberculosis）、牛分支杆菌（M.bovis）和禽分枝杆菌（M.avium） 一、结核分枝杆菌及其生物学特性一、结核分枝杆菌及其生物学特性分枝杆菌的分类一、结核分枝杆菌及其生物学特性一、结核分枝杆菌及其生物学特性菌的形态，因种别不同而稍有差异。结核分枝杆菌是直或微弯的细长杆菌，呈单独或平行相聚排列，多为棍棒状，间有分支状，长约1.5 ~ 4μm，宽0.2 ~ 0.5μm，无鞭毛，无运动性，不形成芽胞，无荚膜，不产生内外毒素，革兰氏染色阳性。 经品红染色后即使酸性酒精也无法脱色，故又称抗酸杆菌。一般染色法较难着色，常用方法为Ziehi-Nèelsen氏抗酸染色法。一、结核分枝杆菌及其生物学特性一、结核分枝杆菌及其生物学特性1.1.2 培养特性 结核菌在含氧40%~50%并有5%~10%CO2和温度为36℃±5℃，最适PH值为6.8~7.2的条件下生长旺盛。结核杆菌在一般的培养基上不生长，必须在含有血清、卵黄、马铃薯、甘油以及某些无机盐类的特殊培养基上才能生长，如罗氏（Lowenstein-Jensen）固体培养基。所以结核菌最易侵犯氧气充足、血流、营养丰富的肺脏以及骨骼的两端。一、结核分枝杆菌及其生物学特性一、结核分枝杆菌及其生物学特性结核分枝杆菌细胞壁的脂质含量较高，影响营养物质的吸收，故生长缓慢。在一般培养基中每分裂1代需时18～24小时，营养丰富时只需5小时。 结核分枝杆菌的菌落呈颗粒、结节或花菜状，乳白色或米黄色，不透明。在液体培养基中可能由于接触营养面大，细菌生长较为迅速。一般1～2周即可生长。临床标本检查液体培养比固体培养的阳性率高数倍。null图1-1. 结核分枝杆菌菌落形态一、结核分枝杆菌及其生物学特性一、结核分枝杆菌及其生物学特性1.1.3 生化反应 结核分枝杆菌不发酵糖类。与牛分枝杆菌的区别在于结核分枝杆菌可合成烟酸和还原硝酸盐，而牛分枝杆菌不能。热触酶试验对区别结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌有重要意义。结核分枝杆菌大多数触酶试验阳性，而热触酶试验阴性； 非结核分枝杆菌则大多数两种试验均阳性。热触酶试验检查方法是将浓的细菌悬液置68℃水浴加温20分钟，然后再加H2O2。观察是否产生气泡，有气泡者为阳性。一、结核分枝杆菌及其生物学特性一、结核分枝杆菌及其生物学特性1.1.4抵抗力 分支杆菌属的细菌细胞壁脂质含量较高，约占干重的60%，特别是有大量分枝菌酸（mycolic acid）包围在肽聚糖层的外面，在自然环境中生存力较强，对干燥和湿冷的抵抗力很强。在干痰中能存活10个月，在粪便，土壤中可存活6~7个月，在病变组织和尘埃中能生存2~7个月或更久，在水中可存活5个月，在冷藏奶油中可存活10个月，在-7℃以下可生存4~5年。 一、结核分枝杆菌及其生物学特性一、结核分枝杆菌及其生物学特性结核分支杆菌对湿热的抵抗力差，60℃下持续30min，85摄氏度持续5min或90℃持续1min即可死亡。 对紫外线敏感，在直射阳光下经数小时死亡，可用于结核患者衣服、书籍等的消毒。 醇脂性溶剂——酒精能渗入其酯层而发挥奇效，用75%酒精2分钟便可将它杀死。 对消毒剂50 mL/l石碳酸、40 g/l氢氧化钠和30 mL/l福尔马林敏感。 一、结核分枝杆菌及其生物学特性一、结核分枝杆菌及其生物学特性结核分枝杆菌的抵抗力与环境中有机物的存在有密切关系，如痰液可增强结核分枝杆菌的抵抗力。因大多数消毒剂可使痰中的蛋白质凝固，包在细菌周围，使细菌不易被杀死。5%石炭酸在无痰时30 min可杀死结核分枝杆菌，有痰时需要24 h；5%来苏儿无痰时5 min杀死结核分枝杆菌，有痰时需要1～2 h。一、结核分枝杆菌及其生物学特性一、结核分枝杆菌及其生物学特性结核分枝杆菌在体内外经青霉素、环丝氨酸或溶菌酶诱导可影响细胞壁中肽聚糖的合成，异烟肼影响分枝菌酸的合成，巨噬细胞吞噬结核分枝杆菌后溶菌酶的作用可破坏肽聚糖，均可导致其变为L型，呈颗粒状或丝状。异烟肼影响分枝菌酸的合成，可变为抗酸染色阴性。这种形态多形染色多变在肺内外结核感染标本中常能见到。临床结核性冷脓疡和痰标本中甚至还可见有非抗酸性革兰阳性颗粒，过去称为Much颗粒。该颗粒在体内或细胞培养中能返回为抗酸性杆菌，故亦为L型。一、结核分枝杆菌及其生物学特性一、结核分枝杆菌及其生物学特性1.2 流行病学 牛结核病具有广泛的宿主范围，感染不同种属的温血动物 ，包括有蹄动物 、有袋动物、食肉类动物 、灵长类、鳍脚类动物和啮齿类动物在内的 50多种哺乳动物，还包括类鹦鹉鸟、石鸽、北美洲乌鸦等20多种禽类。 家禽中牛最易感，特别是奶牛，其次为黄牛、牦牛、水牛，猪和家禽易感性也较强，羊极少患病。野生动物中猴、鹿易感性较强，狮、豹等也有发病报道。 一、结核分枝杆菌及其生物学特性一、结核分枝杆菌及其生物学特性多数研究人员认为，牛结核病的传播是从家畜到野生动物，该病在野生反刍动物中病理损伤和症状与家养反刍动物极为类似。根据一个 物种对 BTB的敏感 性 以及感染 BTB的流行情况，这种物种可能充当其它物种的贮藏宿主或一过性宿主。对于贮藏宿主或维持宿主而言，感染可能通过水平传播而持续存在，也可能很快传播给其它易感宿主。仅仅一小部分物种充当维持宿主或贮藏宿主 ，包括画笔尾负鼠、欧洲獾 、美洲或欧洲野牛 、非洲野牛和白尾鹿。一、结核分枝杆菌及其生物学特性一、结核分枝杆菌及其生物学特性牛结核病主要由牛分支杆菌，也可由结核分枝杆菌引起，牛分支杆菌也可感染猪和人及其他一些家禽，禽分支杆菌主要感染家禽，但也可感染牛、猪和人。结核病患病动物尤其是开放型患者是本病的主要传染源，其痰液、粪尿、乳汁和生殖道分泌物中都可带菌，污染饲料，食物、饮水、空气和环境而散播传染。 本病主要经呼吸道、消化道感染，病菌随咳嗽、喷嚏排出体外，存在于空气飞沫中，健康的人、动物吸入后即可感染。饲养管理不当与本病的传播有密切关系，畜（禽）舍通风不良、拥挤、潮湿，阳光不足、缺乏运动，最易患病。 一、结核分枝杆菌及其生物学特性一、结核分枝杆菌及其生物学特性人结核病主要由结核分枝杆菌引起。由于缺乏诊断、控制结核的方法以及牛奶未进行巴氏消毒处理，由 M.bovis引起的动物源性的人结核在发展中国家逐渐增多。人可以通过吸人由 M.bovis感染牛咳嗽的飞沫或饮用污染了该病原的牛奶而感染。BTB感染年轻人群会引起颈部淋巴结核、肠内损伤性结核、慢性皮肤结核和其它非肺型结核。如果是通过吸入的方式感染 M.bovis，感染人通常会发展成典型的肺结核。另外，结核在爱滋病(HIV)感染人群中为一种主要的机会性感染传染病。WHO估计 70％(600万)共感染结核和 HIV的病人生活在非洲的亚撒哈拉地区。一、结核分枝杆菌及其生物学特性一、结核分枝杆菌及其生物学特性2000年全国流行病学调查 中国结核病流行病学特征： 1.高感染率。44.5%（5.5亿）人感染了结核杆菌。 2.高患病率。367/10万（451万）人患活动性肺结核，其中122/10万（150万）为涂阳病例。 3.高死亡率。每年0.98/10万（15万）人死于结核病。 4.高耐药率。见表1。一、结核分枝杆菌及其生物学特性一、结核分枝杆菌及其生物学特性5.结核病疫情特点。农村高于城镇，城镇高于城市。农村感染率59.4%，城镇感染率55.1%，城市感染率35.9%。16~50岁年龄组的患者所占比例超过2/3。一、结核分枝杆菌及其生物学特性一、结核分枝杆菌及其生物学特性1.3免疫和发病机理 分支杆菌是胞内寄生菌。机体抗结核病的免疫基础主要是细胞免疫，细胞免疫反应主要依靠致敏的淋巴细胞和激活的单核细胞互相协作来完成。体液免疫因素只是次要的。结核免疫的另一特点是传染性免疫和传染性变态反应同时存在。传染性免疫，是指只有当分支杆菌的抗原在体内存在时，抗原不断刺激机体才能获得特异性免疫力。因此也叫做带菌免疫。若细菌和其抗原消失后，免疫力也随之消失。 一、结核分枝杆菌及其生物学特性一、结核分枝杆菌及其生物学特性传染性变态反应，是指机体初次感染分支杆菌后，机体被致敏，当再次接触菌体抗原时，机体反应性大大提高，炎症反应也较强烈，这种变态反应是在结合传染过程中出现的，故称为传染性变态反应。由于机体对分支杆菌的免疫反应和变态反应一般都是同时产生，伴随存在，故可用结核菌素做变态反应来检查机体对分支杆菌有无免疫力，或有无感染和带菌。一、结核分枝杆菌及其生物学特性一、结核分枝杆菌及其生物学特性分支杆菌侵入机体后，与巨噬细胞遭遇，易被吞噬或将分支杆菌带入局部的淋巴管和组织，并在侵入的组织或淋巴结处发生原发性病灶，细菌被滞留并咋该处形成结核，当机体抵抗力强时，此局部的原发性病灶局限化，长期甚至终生不扩撒。如果机体抵抗力弱，疾病进一步发展，细菌经淋巴管向其他一些淋巴结扩散，形成续发性病灶。如果疾病继续发展，细菌进入血流，散布全身，引起其他组织器官的结核病灶或全身性结核。一、结核分枝杆菌及其生物学特性一、结核分枝杆菌及其生物学特性1.4 临诊症状 潜伏期长短不一，短者十几天，长者数月甚至数年。通常取慢性经过，病初临诊症状不明显，当病程逐渐延长，病症才逐渐显露。 1.4.1牛结核病 主要由牛分支杆菌引起。结核分支杆菌和禽分枝杆菌对牛毒力较弱，多引起局限性病灶且缺乏肉眼变化，即所谓的“无病灶反应牛”，通常这种就很少能成为传染源。一、结核分枝杆菌及其生物学特性一、结核分枝杆菌及其生物学特性1.5.2禽结核病 主要危害鸡和火鸡，成年鸡多发，其他家禽和多种野禽亦可感染。感染途径主要经消化道，但呼吸道感染的可能性亦不能排除。 1.5.3猪结核病 可由禽分枝杆菌、牛分支杆菌和结核分枝杆菌引起，猪对禽分枝杆菌的易感性比其他哺乳动物高。猪感染结核主要经消化道感染，在扁桃体和颌下淋巴结发生病灶，很少出现临诊症状，当肠道有病灶则发生下痢。猪感染牛分支杆菌则呈进行性病程，常导致死亡。 一、结核分枝杆菌及其生物学特性一、结核分枝杆菌及其生物学特性1.6病理变化 结核的病理变化特点是在器官组织繁盛增生性或渗出性炎症，或两者混合存在。机体抵抗力强时，机体对分支杆菌的反应以细胞增生为主，形成增生性结核结节，即增生性炎，由类上皮细胞和巨噬细胞集结在分支杆菌周围，构成特异性肉芽肿。外层是一层密集的淋巴细胞或成纤维细胞形成的非特异性肉芽组织。抵抗力低时，机体反应则以渗出性炎症为主，在组织中有纤维蛋白和淋巴细胞的弥漫性沉积，后发生干酪样坏死、化脓或钙化，这种变化主要见于肺和淋巴结。一、结核分枝杆菌及其生物学特性一、结核分枝杆菌及其生物学特性1.6.1牛 肉眼所见病灶，在肺脏或其他器官常见有很多突起的白色结节，切面为干酪化坏死，有的坏死组织溶解和软化，排出后形成空洞，有的见有钙化，切开时有沙砾感。胸膜和腹膜发生密集结核结节，呈粟粒大至豌豆大的白透明灰白色坚硬的结节，形似珍珠状，故称为“珍珠病”。胃肠粘膜可能有大小不等的结核结节或溃疡。乳房结核多发生于进行性病例，剖开可见有大小不等的病灶，内含有干酪样物质，还可见到急性渗出性乳房炎的病理变化。子宫病理变化多为弥漫干酪化，多出现在粘膜上，粘膜下组织或肌层组织内也有的发生结节、溃疡或瘢痕化。子宫腔含有油样脓液，卵巢肿大，输卵管变硬。一、结核分枝杆菌及其生物学特性一、结核分枝杆菌及其生物学特性1.6.2猪 全身性结核不常见，在某些器官如肝、肺、肾等出现一些小的病灶，或有的病例发生广泛的结节性过程，有的呈干酪样变化，但钙化不明显。在颌下、咽、肠系膜淋巴结及扁桃体等发生结核病灶。 1.6.3禽 病理变化多发生在肠道、肝、脾、骨骼和关节。肠道发生溃疡，可在任何肠段见到。肝、脾肿大，切面具有大小不一的结节状干酪样病灶，关节肿大，内含干酪样物质。二、结核病的检测方法二、结核病的检测方法二、结核病的检测方法 二、结核病的检测方法 牛结核病的检测方法，大体上可归为三类：第一类是细菌学检测，如涂片镜检、细菌培养、动物试验等；第二类是免疫学检测；第三类是分子生物学诊断技术。传统的细菌学方法由于繁琐费时、检出率低、灵敏度差，已不能满足当前疫病检疫的需要。目前世界各国都在致力于研究开发牛结核病的快速诊断方法，并已经建立了一些快速、准确、可靠的新型检测技术，有些技术已经在生产实践中得到了广泛的应用。二、结核病的检测方法二、结核病的检测方法2.1 抗酸染色法 病料涂片后进行抗酸染色, 显微镜镜检抗酸性杆菌, 本菌的细胞壁除了有肽聚糖外, 还有特殊的糖脂, 因为糖脂的影响, 致使革兰氏染色不易着染, 但能抵抗 30 mL/ L 石碳酸酒精的脱色作用, 抗酸染色为红色( 陆承平, 2001) , 常用齐尼二氏( Ziehl Neelson) 染色法, 也可用荧光抗酸染色法。如果组织内有抗酸性染色的微生物, 并且具有典型的组织学病变, 就可以做出初步诊断。抗酸染色法阳性率比较低, 但它作为一种传统的检测方法, 具有假阳性率低, 价格低廉, 操作简便等特点( 常晓辉, 2002) , 在牛场中就可进行, 所以仍有一定的实用价值。二、结核病的检测方法二、结核病的检测方法2.2 细菌分离培养法 一般采取病畜的病变组织、痰液、粪尿、乳汁及其他分泌物等，做涂片镜检、细菌培养和动物接种试验等进行细菌学检测。涂片镜检法检出阳性率不高，且无法区分死菌和活菌，但该方法所需设备简单，操作简便，是发现和防治结核病传染源的重要诊断依据。细菌培养在结核病诊断方面虽然具有决定性的意义，但由于其生长对营养要求较苛刻，生长缓慢，一般培养需10～30 d才能看到菌落，且培养检出率低，敏感性差。研究报道显示，有10％～20％的牛结核病病例牛分枝杆菌培养失败，因此细菌学检查已经不能满足于现代临床诊断的需要。二、结核病的检测方法二、结核病的检测方法2.3 结核菌素皮内变态反应（TST） 此方法在长期的实践中被证明是检测牛结核病的可靠的筛选试验，已被世界各国广泛采用，但不足之处在于，对因感染其它分枝杆菌而致敏的动物检测结果同样呈阳性，不能判断病情，且在那些因病情严重而导致免疫反应低下的动物易出现假阴性。此外，结核菌素皮内试验需要消耗大量人力，检验周期较长，所以有一定的滞后性。由于DTH (迟发型变态反应)的滞后效应，此方法不能在30d内重复进行。在一些对牛群进行BCG免疫的国家或地区，由于BCG疫苗中含有与PPD相同的抗原成分，因而PPD皮内试验不能鉴别免疫动物与感染动物。PPD的质量和剂量、结果判定标准及操作方法等因素均能影响检测结果，故需严格进行质量控制。在一些国家，使用比较结核菌素试验，即比较皮内试验(single intradermal comparative tuberculin test, SICTT)，在颈部一侧的不同部位，同时注射M. bovis PPD和M. avi um PPD, 对两种PPD的不同反应，能够提示被检动物是M. bovis 感染还是非特异的DTH 反应。二、结核病的检测方法二、结核病的检测方法2.4 血清学诊断 此类方法均利用抗原抗体反应检测针对牛结核分枝杆菌抗原的循环抗体。目前用于检测的抗原有PPD、F5、A60、LAM (lipoarabinomannan)及MPB70 等。已经建立的诊断技术有：酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)、免疫斑点测定法(dot immunoassay)、荧光偏振检测法(fluorescence polarization, FPA)、斑点金免疫渗滤试验 (dot immunogold filtration assay, DIGFA)、银加强胶体金技术(silver enhanced colloidal gold assay, SECGA)、免疫印迹法 (Western blotting)、固相抗体竞争试验(solid phaseantibody competitiontest, SACT) 以及固相抗体竞争夹心酶联法(solid phaseantibody competition test sandwich enzyme linked immunosorbent assay, SACSET) 等。二、结核病的检测方法二、结核病的检测方法由于牛体对大多数M.bovis的感染首先产生有效的细胞免疫，并能长期将感染限制在局部区域使之不能扩散，因而体液免疫反应出现较迟且往往反应低下，加之各种分枝杆菌之间含有较多的共同抗原成分，因而导致该法的灵敏度和特异性较低。高水平的循环抗体可见于病情恶化之后，可能与细胞免疫失败，从而失去对分枝杆菌繁殖的限制有关。 二、结核病的检测方法二、结核病的检测方法因此，在进行 PPD 皮内试验之后应用血清学检测方法复检，对高危病牛的鉴定有一定的作用。另外，对于那些因免疫无反应性而导致PPD皮内试验阴性的牛体，同时应用ELISA等血清学检测方法是解决这一问题的有效手段。血清学诊断利用单一抗原, 鸡尾酒抗原或重组抗原作为抗原经行 ELISA 检测, 试验结果不理想, 灵敏度和特异性很难达到预期目标。二、结核病的检测方法二、结核病的检测方法2.5 对菌体成分的检测 利用薄层层析技术(thin-layer chromatography, TLC )，通过分析M. bovis的脂质成分 PGL (phenolic glycolipid)与PDIM (phthiocerol dimycocerosate)，可以快速对M. bovis 进行检测和鉴定，仅需10~15 mg的细菌培养物，具有简便、快速的优点, 可以成为传统生化鉴定的替代方法。还有学者利用过氧化物酶标记的单克隆抗体，检测M.bovis菌体抗原(如MP B70等)的免疫过氧化物酶试验检测法。其优点是检测速度快、成本低、操作简便、在检测分枝杆菌混合感染时尤其出色; 缺点是结果易受标本采集和病程影响, 准确率比较低。二、结核病的检测方法二、结核病的检测方法2.6 淋巴细胞增生试验 致敏的外周血淋巴细胞( peripheral blood lymphocyte, PBL ) 在特异性抗原 ( 如 PP D、M PB70、M PB64 和 MP B59 等) 刺激下, 可使抗原特异性 T淋巴细胞亚群发生增生反应。经典方法使用同位素对合成 DNA 必需的某种核苷酸进行标记。该方法能有效地监测牛结核个体的发病和免疫情况, 但由于耗时及操作复杂，不适用于大规模牛结核疫情的检测。二、结核病的检测方法二、结核病的检测方法2.7 细胞因子及细胞因子受体检测法 这类方法的原理是: 通过检测抗原特异性的 T淋巴细胞在体外接受相应抗原刺激活化后分泌的 T淋巴细胞活化标记分子( 如 IFN 、IL 2、IL 2R等) , 可以判断机体对某种病原的致敏情况, 从而间接反映是否被该病原感染。与 PPD 皮内试验相比,具有出现反应早( 在牛被感染后 2~ 3 周即可得到阳性结果) , 试验快速、灵敏的优点。二、结核病的检测方法二、结核病的检测方法2.7.1 γ-干扰素( IFN-γ) 检测 此方法由 Wood 等于1990 年建立, 其原理为致敏的 PBL 在体外培养的条件下, 接受特异抗原( 如 PPD) 刺激后被活化, 表达并分泌 IFN-γ , 通过一定的技术手段对培养上清中的 IFN-γ进行检测( 如 ELISA) , 或者对 IFN-γmRNA 的表达进行定量或者半定量 ( 如 RT P CR)检测, 还通过 ELISPOT 技术对分泌 IFN-γ的淋巴细胞进行计数( 形成的斑点数) 及对单个细胞分泌的IFN-γ进行定量( 形成的斑点大小) 检测, 其结果与淋巴细胞增生试验具有很好的相关性 。二、结核病的检测方法二、结核病的检测方法目前在西方国家得到普遍应用的是 ELISA方法将 1. 0 mL 的肝素抗凝血液和 PPD 在 37 培养过夜, 第二天收集血浆样品并以夹心 ELISA 检测IFN-γ( Ng 等, 1997) 。用作全血培养刺激物的抗原是 M. bovis 的 PPD 和 M. avium 的 PPD( 后者用于检查交叉反应) 。该测定系统简便、快速, 便于用作疫情监测时大量样品的测试。二、结核病的检测方法二、结核病的检测方法与结核菌素皮内试验相比, IFN-γ测定法不仅简单、快速, 灵敏度和特异性( 尤其是后者) 高, 而且由于减少了前者试验中操作和解释上的主观性, 使结果更为客观、可靠。而且, 据 Ryan 等( 2000) 报道, 在皮内试验进行后再进行IFN-γ试验, 其灵敏度和特异性未有显著影响( 分别为 85% 和 93% )，因此可以作为皮内试验理想的补充试验。使用BCG 对牛群进行免疫接种并不会影响对疫情的监测, 因此能够并行实施疫情监测计划和免疫接种计划, 所以该方法尤其适用于那些对牛群进行 BCG 接种的国家或地区 。二、结核病的检测方法二、结核病的检测方法英国Jayne(2007)运用IFN-γ检测不仅能快速诊断结核病，还能区分接种和未接种疫苗的牛。但是，IFN-γ检测的缺点是成本较高，且检测必须在采血后8 h内进行，不适合于在基层使用。二、结核病的检测方法二、结核病的检测方法2.7.2 白细胞介素 2( IL 2) 检测 IL 2 主要由活化的 T 淋巴细胞分泌, 与 IFN 一样, 也是参与细胞免疫反应的重要细胞因子, 同样可以作为 T 淋巴细胞细胞介导的免疫反应的指标。有学 者通 过化 学发 光技 术( chemiluminescence) 测定 IL 2 mRNA 的表达量,以及通过光密度扫描( densitometric scanning) 或竞争 PCR 技术对其进行精确定量。二、结核病的检测方法二、结核病的检测方法2.7.3 白细胞介素 2 受体 肽链( IL 2R ) 的检测 IL 2R 是组成 IL 2 受体的一条肽链。静止状态的T 淋巴细胞仅表达低水平的 IL 2R , T 淋巴细胞被活化后, 其细胞膜上的 IL 2R 表达量增高, 使这些分子以可溶形式释放( 可能与特异性蛋白酶水解导致的切割有关) 。ELISA 检测经特异抗原( 如PPD、ESAT 6 等) 刺激后的牛外周血或脾脏淋巴细胞释放的 IL 2R , 可以了解动物机体对 M. bovis的细胞免疫状态( Pollock 等, 2000) 。二、结核病的检测方法二、结核病的检测方法2.8 聚合酶链反应 ( PCR 技术) 相对于传统的检测方法，PCR检测具有快速、敏感及特异的优点，尤其适合于生长缓慢、难以培养的病原体的检测。张鹭等(2007)根据牛分枝杆菌MPB70的特异性基因序列进行PCR扩增，检测牛奶中的结核分枝杆菌类病原菌(TBC)，阳性率达到40．9％。刘思国等(2006)根据已发表的牛分枝杆菌的pncA基因序列，设计可扩增294 bp目的片段的引物，建立了特异性检测牛分枝杆菌的PCR方法，该方法特异性强，敏感度可达到50 pg，阳性样品符合率为90％，阴性样品符合率为100％，而且有利于结果的判定和临床样品的直接检测。 二、结核病的检测方法二、结核病的检测方法PCR检测不仅可用于基因组DNA的扩增，而且可以直接从组织病料及其他样品中检测致病性病原菌的存在，大大缩短了结核菌的检测进程。PCR的技术操作并不复杂，但是要求很高的技术质量。因扩增子气溶胶污染而导致的假阳性和因标本中抑制物质存在而导致的假阴性以及试剂盒缺乏规范化、标准化是影响PCR结果可信性的关键。为此研究人员正在不断开发出新的高灵敏度和高特异性的PCR方法。 二、结核病的检测方法二、结核病的检测方法目前应用较为广泛的有逆转录PCR法、巢式PCR法、单管巢式逆转录PCR法、实时荧光定量PCR、酶联PCR等，克服了缺点，提高了检测的敏感性和特异性。Parra等(2008)研究了一种新的方法，利用实时定量PCR技术对牛的生物样本进行快速检测，该方法可以区别不同的结核分支杆菌及非典型结核分支杆菌等，其敏感性和特异性都很高。二、结核病的检测方法二、结核病的检测方法2.9 核酸探针技术 目前，检测牛分枝杆菌的分子生物学技术中PCR-RFLP和特异性PCR技术等可以直接检测。65 ku抗原基因是分枝杆属所共有的，因此必须同时合成不同群分枝杆菌相应的特异性探针，检测扩增产物才能得到准确的结果。Gormle等将 M.paratuberculosis 基因组上一段长度为165 bp, 含有PAN启动子的 DNA片段进行放射性标记并将其作为探针，提取待测菌株的DNA, 经限制性内切酶 EcoR I消化，Southern印迹后与探针进行杂交。该方法综合利用了EcoR I的限制性酶切片段长度多态性(RFLP)技术和DNA 探针技术, 能够从混合样品中一次检出 M. tuberculosis、M.bovis、M.avium和BCG等多种致病或非致病分枝杆菌。二、结核病的检测方法二、结核病的检测方法2.10噬菌体测定法 噬菌体测定技术是近几年发展起来的一种间接检测样本中牛结核活菌的快速诊断技术。该方法基本原理是借助特殊噬菌体在适宜条件下感染标本中活的牛结核杆菌，增殖，在24 h内可形成清晰的噬菌斑。由于噬菌体不能感染死的牛结核菌，因而此法可以区别牛结核杆菌是活菌或是死菌；此法敏感性高，102／L以上的活菌即能检出；从收集痰样本进行前处理到检测出结果仅需48 h，无需特殊仪器，成本低廉。 二、结核病的检测方法二、结核病的检测方法2003年，国外已有商品化试剂盒生产，并在多个国家和地区进行了临床试验。值得一提的是，此方法还可对样本中的牛结核杆菌直接进行药敏试验，2～4 d可得到结果，但目前还在实验室研究阶段。因缺乏统一的标准，还需要进一步研究。二、结核病的检测方法二、结核病的检测方法迄今为止, 经典的 PPD皮内试验依然是唯一得到公认的标准检测方法, 但其不足也是显而易见的, 因而临床上迫切需要新的诊断技术和标准。所以牛结核病普查比较好的做法是，多种方法联合应用，尽可能提高检测的敏感性和特异性。大量的研究结果和实践证明, 体外检测特异性细胞因子( 主要是 T h1 型细胞因子, 如 IFN 、IL 2 等) 的方法是早期诊断牛结核病的有力手段。随着分子生物技术在各个领域的广泛应用和飞速发展，其在结核杆菌的检测和结核病的诊断中将发挥越来越重要的作用。三、结核病的预防与治疗三、结核病的预防与治疗三、结核病的预防与治疗三、结核病的预防与治疗3.1牛结核防控的意义 牛分枝杆菌的宿主范围广泛，可感染人、50多种哺乳动物及25种禽类。结核牛是人结核病的传染源之一。如发达国家在实施牛奶巴氏消毒前，人感染牛结核的比例达10％～30％，实施牛奶巴氏消毒与牛结核根除计划后，人感染牛结核的比例降至1％以下。目前发展中国家约有10％～15％的人结核是由牛分枝杆菌引起。此外，牛分枝杆菌对常用的人结核治疗药如利福平、丙嗪酰胺等具有天然抗性，给临床治疗带来困难。三、结核病的预防与治疗三、结核病的预防与治疗牛结核防控除了其公共卫生意义外，对养牛业的影响也非常严重。牛感染牛分枝杆菌后，病初症状不明显，精神和健康状况随病程发展而逐渐恶化。临床症状与受害器官相对应，如肺结核时出现逐渐消瘦、咳嗽与呼吸困难；乳房结核时泌乳减少或停止，乳房中形成肿块，且常波及乳房上淋巴结，严重者乳腺萎缩或肿大变硬但无热无痛；肠结核时便秘和腹泻交替出现，食欲、消化和营养物质吸收紊乱；淋巴结核时淋巴结高度肿胀，硬而凹凸不平，其中有干酪样坏死；三、结核病的预防与治疗三、结核病的预防与治疗生殖器官结核时性欲亢进，母畜屡配不孕，孕畜可以出现流产等。病牛尤其是开放性结核病牛，通过鼻汁、唾液、痰液、乳汁和生殖器官分泌物将结核菌排出体外，污染饲料、饮水、空气和周围环境，经呼吸道和消化道感染牛、人及其他动物。 该病据不完全统计，世界范围内有5000万头牛感染了结核，造成的直接经济损失每年达30多亿美元。 三、结核病的预防与治疗三、结核病的预防与治疗3.2 牛结核病净化标准 根除牛结核病是人们近一个世纪来的梦想，但对于牛结核这样一个宿主谱广泛、持续感染普遍、病程经过缓慢、没有疫苗、没有先进快速诊断技术的疾病，实施根据计划要比口蹄疫难得多。欧美国家实施牛结核根除计划已有40余年，但至今尚无任何国家获得OIE“无结核”认可。 OIE无结核国家或地区的认可标准是： (1)牛结核感染应该是必须通报疾病，牛包括圈养或散养的牛、水牛和野牛； (2)正在执行一个公众认知计划，鼓励报告所有牛结核可疑病例；三、结核病的预防与治疗三、结核病的预防与治疗(3)连续3年定期检查所有黄牛、水牛和野牛的牛结核感染，99.8％的牛群应为牛结核阴性，99.9％的牛应为阴性； (4)应有一个监测计划，通过生前与死后检查监测牛结核； (5)如果实施上述(3)(4)监测计划连续5年未检测到牛结核感染，生前与死后检查的牛结核监测计划还应该坚持； (6)如果牛(黄牛，水牛，和野牛)引入无牛结核的国家时，必须出具官方兽医开具的表明牛群来自干无牛结核国家或地区的证明，或出示符合相关法规的官方证明。三、结核病的预防与治疗三、结核病的预防与治疗欧盟“官方无结核牛群(TBOF)”的认可标准是： (1)连续6年每年确定为结核感染牛群的比例不超过0.1％，或连续6年每年达到TBOF状态的牛群至少为99.9％，计算时间为每年的12月31日。 (2)每头牛的检疫都必须符合欧盟法规。 (3)所有屠宰牛都必须进行官方尸体检查，其检查结果将决定是否应停止或取消其TBOF资格。三、结核病的预防与治疗三、结核病的预防与治疗3.3 国外牛结核防控与净化经验 发达国家牛结核的主要防控经验可归纳如下： 3.3.1制定并切实实施牛结核控制和扑灭计划。上世纪初，欧美国家的牛结核感染率很高，10％以上的人结核病例被证实由牛分支杆菌引起，贸易加剧牛结核的传播，引起了农场主和政府的高度关注。为了保障公共健康，控制牛结核，促进贸易，政府决定执行牛结核根除计划，并以消灭牛结核为最终目标，农场主积极响应。根除计划的基本方法是检疫和扑杀。三、结核病的预防与治疗三、结核病的预防与治疗3.3.2制定有效的法律法规确保根除和控制计划的顺利实施。通过立法统一根除计划的实施程序与方法，明确无规定疫病的标准，在中央、地方财政与养殖者之间合理分配疫病控制成本，并强制执行，这些是各国成功控制或消灭传染病的重要经验。 欧盟第一个与牛结核根除计划有关的法令CouncHDirective64/432/EEC于1964年发布。各成员国积极参加牛结核根除计划，丹麦(1980)、荷兰(1995)、德国和卢森堡(1997)、奥地利(1999)、法国(2001)、比利时(2003)、芬兰和瑞典(1995)、捷克共和国(2004)等国相继获得欧盟的TBOF认可。三、结核病的预防与治疗三、结核病的预防与治疗3.3.3坚决实施与动态评估牛结核控制和根除计划的实施效果。疾病控制和根除从时间上是一个循序渐进的过程，如包括疫病普查，免疫降低感染率，感染群清群，目标群监测，无感染群，持续感染，保持无感染群，疫病扑灭等不同阶段；从空间上是一个扩大的过程，先在局部地区达到具体疫病的控制或消灭的目标，最终在全国范围内达到无规定疫病状态，这是欧盟、美国、澳大利亚的成功经验。欧盟的基本作法是：疫情得到控制或扑灭的省/州/成员国将获得官方颁发的“无规定动物疫病证书”，严格推行区域化管理和市场限制 制度 关于办公室下班关闭电源制度矿山事故隐患举报和奖励制度制度下载人事管理制度doc盘点制度下载 以防止再度感染，即无疫病地区可自由进行相应动物和动物产品的交易，而未控制疫情地区的动物和动物产品禁止进入无疫病区。 三、结核病的预防与治疗三、结核病的预防与治疗在计划执行早期，由于少数局部无疫病地区受到周围疫病流行区的威胁，重新暴发疫病的风险极大，持续监测和动物及其产品的市场移动限制对维持其无疫病状态非常重要。 由于宿主范围广泛，感染与发病过程缓慢，无疫苗，无快速高通量检测方法，及政府财力等多方面的原因，实施牛结核的根除计划更是一个慢长的过程，政府、兽医和民众对根除计划长期保持信心与热情尤其重要。三、结核病的预防与治疗三、结核病的预防与治疗3.3.4重视新技术开发与应用。准确检测牛结核是根除牛结核的前提，这首先需要一种实用、精确、快速、高通量的监测方法。结核菌素皮内变态反应试验(TST)是目前世界动物卫生组织(OIE)唯一推荐的牛结核病诊断方法，也是各个国家用于牛结核病检疫的基本方法。但TST的特异性受其他非致病性分枝杆菌影响，操作复杂，结果判断主观性强，不适合于野生动物。各发达国家在结核病控制上均利用了IFN-γ体外释放检测等实验室辅助检测方法，效果良好。病理学诊断与细菌性诊断也可作辅助诊断，但只对扑杀后动物的确诊有意义。三、结核病的预防与治疗三、结核病的预防与治疗3.4 我国牛结核流行现状与防控 各地不检或盲报现象严重，因此，我国牛结核流行现状的准确数据不详。可以肯定的是，我国牛结核尤其是奶牛结核呈上升与蔓延趋势，在牛结核病防控与净化方面存在如下瓶颈问题： 3.4.1尚未制定有效的牛结核防控与净化计划。虽然我国一直将牛结核列为检疫扑杀对象，但尚未制定牛结核的防控与净化计划，因此，我国牛结核防控与净化尚缺少国家层面的整体谋划、进程预计和具体目标。 三、结核病的预防与治疗三、结核病的预防与治疗3.4.2流行病学家底不清。虽然不同机构都对牛结核进行了一些流行病学抽样调查，从不同层面获得一些局部地区的牛结核流行病学资料，但处于疫情保密及错误庇护当地养牛业的畸形发展、或地方政府经济拮据不愿承担补偿费用等多种原因，使得流行病学调查难以实施高覆盖率采样，流行病学结核结果难以透明化。 研究一种最为经济的无害化处理方式非常有益于降低成本和提高防控效果。有专家建议，可以考虑将阳性牛送至生物安全条件好、具有相应资质隔离条件、政府授权或指定的屠宰加工场集中屠宰、实行无害化处理与综合利用。在控制好牛结核传播风险的前提下，该建议应该是条合理化建议。三、结核病的预防与治疗三、结核病的预防与治疗3.4.3牛群流动可追溯体系不健全。根据疫病流行情况进行区域化管理、限制牛群流动、实行可追溯体系是发达国家控制牛结核及其它重大疫病的重要措施和成功经验。我国牛群流动监管力度太少、区域之间无序流动现象普遍发生和基本无可追溯体系等是导致牛结核蔓延的重要原因。三、结核病的预防与治疗三、结核病的预防与治疗3.4.4缺乏有经济活力的政策法规。虽然国家中多个相关文件中均对牛结核给予了深切关注，如国务院颁发了“国务院关于促进奶业持续健康发展的意见”(国发[2007]31号)，强调“完善奶牛重大疫病防治和扑杀政策，将患结核病、布氏杆菌病而强制扑杀的奶牛，列入畜禽疫病扑杀补贴范围。”。但由于补贴标准过于陈旧等原因，导致相关政策缺乏经济活力，各方不能积极配合。三、结核病的预防与治疗三、结核病的预防与治疗3.4.5公众认知水平有待提高。由于结核病是一种慢性传染病，尽管感染基数大，但发病数相对较少，发病早期缺少特异性临床症状，扑杀的结核感染阳性牛相当部分无明显肉眼可见的病理变化，导致公众对牛结核的防控意义认识不足，而任何疫病防控与净化计划如果得不到公众的正确理解与热情配合是难以顺利实施的，因此公众认知水平低很大程度上妨碍了牛结核防控与净化。三、结核病的预防与治疗三、结核病的预防与治疗3.4.6牛结核防控相关技术研发进度慢。目前动物疫病种类多，计划免疫、检疫与监测对象多，导致基层防疫人员工作负担过重。加之牛结核检疫劳动强度大、耗时长、经济条件差的地区阳性牛扑杀补偿无法兑现等原因，牛结核少检、不检现象相当普遍。结核分枝杆菌本身的特点如生长慢、病程长、持续感染普遍、病例难以人工复制、细胞免疫与体液免疫分离、新型检测技术缺乏高效的金标准评估方法等给研究快速准确的检测方法带来诸多挑战，国家对诊断试剂审批手续多、周期长在一定程度上也影响了新型技术的市场转化。三、结核病的预防与治疗三、结核病的预防与治疗3.4.7野生动物结核有待重视。由于家养牛的结核病防控进程缓慢，野生动物结核病控制尚未得到重视。目前我国对生活在野外的野生动物结核病的流行情况的了解处于空白，对圈养野生动物如梅花鹿等有一定的了解，但无控制措施。据估计，梅花鹿结核病的流行率较高，对人类健康存在较大的风险。三、结核病的预防与治疗三、结核病的预防与治疗3. 5防制措施 3.5.1加强检疫。不从疫区或不安全单位引进新牛，引进牛时要经当地动物防疫部门检疫，证明非阳性方可引入，新引进牛应隔离观察1～2个月并经结核菌素试验，证明无病者方可混群。无病牛群每年定期用结核菌素试验检查，每年春、秋各检疫1次，以便及时发现病牛，清除传染源，净化牛群。 3.5.2隔离。对检出的阳性病牛立即扑杀并进行无害化处理，可疑病牛间隔25-30d复检，凡两次检查可疑者均判为阳性。优良种牛应隔离治疗，遵循早期治疗、联合用药，坚持疗程，彻底治疗，防止复发的原则。常用的药物有链霉素、异烟肼、利福平等。三、结核病的预防与治疗三、结核病的预防与治疗3.5.3净化措施。 被确诊为结核病病牛或检出结核病阳性牛的牛群(场)为牛结核病污染群(场)，要全面实施结核病净化工作。 ①污染牛群(场)的处理：对牛群进行反复监测，布鲁氏菌病污染牛群(场)间隔2个月检测一次，结核病污染牛群(场)间隔3个月检测一次，发现病牛、阳性牛及时扑杀，可疑牛及时隔离复检。对牛床、运动场、工具等坚持每周消毒一次，奶牛群中检出结核病病牛、阳性牛后，消毒处理按前述“环境控制”要求进行； ②假定健康牛群的处理：经扑杀病牛及阳性牛后的牛群为假定健康牛群。假定健康牛群的处理同污染牛群，凡连续两次以上监测结果均为阴性者，可认为是健康牛群； 三、结核病的预防与治疗三、结核病的预防与治疗③健康犊牛群的培育当牛群中病牛较多时，可在犊牛出生后先进行体表消毒，然后从病牛群中隔离开来，人工喂给健康母牛的初乳，以后喂健康牛乳或消毒乳。断级时及断奶后3～6个月进行2次结核菌素试验，均为阴性者并入健康牛群。受威胁的犊牛满月后可皮下注射50～100ml的卡介苗，20d后产生免疫力，可维持12～18个月，对个别症状轻微或病初患畜，每日用异烟肼3～4g，分34次混在精料中饲喂，每3个月为一个疗程。症状重者可口服异烟肼每日l～2g，同时肌肉注射链霉素，每次3～5g，隔日1次。三、结核病的预防与治疗三、结核病的预防与治疗3.5.4环境控制。奶牛饲养场生产区应与生活区隔离，场内不得饲养猫、狗、猪、鸡、鸭等动物，并禁止其它动物出入，努力消灭鼠、蝇等传播媒介。严格消毒，包括定期消毒和经常性消毒。定期消毒：每年2~4次，用20％的石灰乳粉刷墙壁，5％的烧碱消毒运动场，5％的烧碱、3％～5％来苏儿}肖毒牛床、牛栏、畜舍地面、粪尿沟。经常性消毒：生产区出入口设消毒池，犊牛移出隔离舍时，清除并烧毁全部垫草，产房每半月进行1次大消毒，分娩牛闲彻底消毒。三、结核病的预防与治疗三、结核病的预防与治疗3.5.5设施管理。已建的牛场也要积极创造条件，改善防疫设施，实行封闭式饲养管理，严防外来疫源的传人。实行分群管理，建立病牛场，假定建康场(检疫为阴性)、犊牛中间站(隔离场)。 3.5.6检疫监管。全面实行奶牛健康证和户口台帐管理，所有奶牛都应登记造册，及时记录奶牛存栏和调运状况。对健康奶牛发给奶牛结核病监测(检疫)合格证明，凭证销售牛奶或转让健康牛。 3.5.7人员管理。场内工作人员每年都要进行体检，取得健康证后方可上岗，工作一旦发现有患结核病病人，及时调离工作岗位，隔离治疗。工作人员的工作服、用具要保持清洁，不得带场。三、结核病的预防与治疗三、结核病的预防与治疗3.6 抗结核药物 3.6.1早期合成类抗结核药 雷米封(INF)。该药物是奥地利化学家H．Mayer在1912年合成的，是最早的合成抗结核药，1952年正式被用于临床。雷米封渗透力强，生物利用度99％，可透过脑膜，主要抵制DNA的合成。它在体内以烯醇式形式存在，发生乙酰化反应后，肼基上的质子被取代，其中某些衍生物具有杀菌作用，常并用其它药物治疗活动性结核病。三、结核病的预防与治疗三、结核病的预防与治疗PAS-Na，该药1946年合成，对结核菌有强烈的选择抵制作用，生物利用度100％，但不能透过脑膜，主要作用细胞外病菌。乙酰化反应迅速是较好的短期治疗药物。 PZA，于1952年合成，生物利用率高，可透过脑膜，在PH5～5.5灭结核菌效果十分显著，是化疗的重要辅助药物。 EMB。1961年人工合成，可抑制结核杆菌RNA，但生物利用度不理想。 普通合成类抗结核药物研究最早，临床应用最广泛。由于它的针对性强，对无耐药性的结核杆菌作用效果十分明显，常作为一线药物应用于临床。三、结核病的预防与治疗三、结核病的预防与治疗3.6.2 新抗结核药物开发与研究 利福平类：该药物在1988年被美国FDA批准应用于临床。它的杀菌效果十分好，细胞内移动眭是利福平的10倍。有关资料显示，在小鼠结核病治疗实验中利福喷丁加毗嗦酞胺的治疗不但效果显著，而且口服半衰期长，可问隔用药，复发率相对较低。目前已被广泛用于临床。三、结核病的预防与治疗三、结核病的预防与治疗氟喹诺酮类(FQs)：常用的治疗药物有环丙沙星、左氧氟沙星、氧氟沙星等，该类药物抗结核菌活性非常明显，同时具有一定的杀菌作用。主要优点为与现有药物不交叉耐药；可与其它药物一起应用；四、五代药物对多重耐药性结核杆菌有一定效果。主要缺点为作用效果不强，与氟哇诺酮类药物交叉耐药。 硝基咪哇并毗喃类：该类药物的主要有效成分为PA-824，它的作用具有双重性，可影响细胞壁霉菌酸的合成和结核杆菌的蛋白质合成，对发育休止期和对数增殖期的结核分歧杆菌有较理想的杀灭效果。由于它与其它类的抗结核药物不交叉耐药，成为新抗结核药物研究的重点发展方向，目前尝处临床实验阶段。三、结核病的预防与治疗三、结核病的预防与治疗功能基因组学、蛋白质组学的应用：1998年，随着7Rv基因组全序列的破译，使结核病的治疗进入了后基因时代，从而加速了药物的筛选进程。目前药物的开发流程是从药物作用的靶点开始的，即基因组一新作用靶点一筛选一先导物一药物，这种基于细胞水平的筛选技术被逐渐应用于新结核药的开发当中。 总之，结核病是一种感染性很强的顽症，目前仍以化疗及辅助药治疗为主要手段。随着结核分歧杆菌耐药性的提高，抗结核药物的种类越来越多，抗结核药物发展越来越开阔，期望在发展中不断创新，最终使结核病得到有效的控制。三、结核病的预防与治疗三、结核病的预防与治疗3.7 耐药结核病的治疗 3.7.1 各种耐药定义 1、传统的分类 ①原发耐药。指从未用过抗结核药物的患者，其感染的结核分枝杆菌对1种或数种抗结核药物发生的耐药。 ②继发(获得性)耐药。在治疗过程中，由于间断、不足量滥用抗结核药物而产生的耐药。 ③交叉耐药。细菌对一种抗结核药物产生耐药的同时又对其他抗结核药物也有耐药为交叉耐药。 ④初始耐药。对已存在耐药的患者，缺乏确切的既往化疗史的耐药。 三、结核病的预防与治疗三、结核病的预防与治疗⑤自然耐药。结核分枝杆菌保持的野生菌株突变的特性即自然基因突变，结核分枝杆菌对各种抗结核药物均可发生不同频率的自然突变，异烟肼为10-6，链霉素为10-5，利福平为10-12。联合用药和充分治疗是限制其生长发育，防止演变为继发耐药菌的唯一途径。 ⑥耐多药。耐两种以上，至少包括同时对异烟肼、利福平的耐药。 三、结核病的预防与治疗三、结核病的预防与治疗2、 WHO分类 ①单耐药。指结核分枝杆菌对一种抗结核药物耐药。 ②多耐药。指结核分枝杆菌对一种以上的抗结核药物耐药，但不包括同时对异烟肼、利福平耐药。 ③耐多药。对一种以上的抗结核药物至少同时包括异烟肼、利福平耐药。 ④广泛耐药。在耐多药的基础上，对任何氟喹诺酮(FQ)中的1种和二线抗结核注射剂(CM、KM、AM)中的1种发生耐药。 三、结核病的预防与治疗三、结核病的预防与治疗3.7.2抗结核药物的新分组 传统的抗结核药物分类法是将抗结核药物分为一线和二线抗结核药物。一线药物包括：异烟肼、链霉素(streptomycin，Sm，S)、利福平(利福喷汀，rifapentine，RFT，L)、毗嗪酰胺(pyrazinamide，PZA，Z)、乙胺丁醇(ethambutol，EMB，E)、氨硫脲(thioacetazone，TB1)6种药物；除一线以外的抗结核药均为