中国医院药学杂志2006年第 26卷第 6期 Chin Hosp Pharm J,2006 Jun,Vol 26,No.06 ·685 ·
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[收稿日期]2005—12—22
高效液相色谱法测定人乙肝免疫球蛋白中麦芽糖的含量
吕应年 ,蒋桂香。,吴科锋 ,朱光祖。 (1.广东医学院天然药物研发重点实验室,广东湛江524023;2.三九集团双林药
业有限公司,广东 湛江 524005)
[摘要] 目的:建立高效液相色谱法,测定静脉注射用人乙肝免疫球蛋白(HBIGIV)中麦芽糖的含量。方法:采用氨基柱 Kro—
masil1()O一5NH2(4.6 ITIITIx 250 mm)及示差折光检测器,以0.004 mo卜L 硫酸溶液做流动相,柱温 50℃,流速0.8 mL·
min~。结果:麦芽糖含量的线性范围5~40 g·L~.平均回收率( =6)为99.4 ,RSD为1.13 。结论:本方法准确、简便 ,适
用于测定人 乙肝免疫球蛋白静脉注射液 中麦芽糖含量的测定。
[关键词] 高效液相色谱 ;静脉注射用人 乙肝免疫球蛋白;麦芽糖 ;含量
[中图分类号]R927.2 [文献标识码]A [文章编号]1I)I)1—5213(2006)06—0685—02
Determination of malt ose in human hepatitis B immunoglobulin for intravenous llse by HPLC
LV Ying-nian,JIANG Gui—xiang,WU Ke-Feng,ZHU Guang-zu(1.Guangdong Medical College,Guangdong Zhan
jiang 524023,China;2.Shuanglin medicines limited company of Shanjiu group,Guangdong zhanjiang 524005,China)
ABSI ACT:OllJ『EL'rIVE To investigate a method of HPLC for the determination of the content of malt ose in human hepati—
tis B immunoglobulin for intravenous use.METItODS The analytical column was the Kromasil 100-5NH,columrl(4.6 mnl×
250 mm)and the detector was refractometer,the mobile phase was 0.004 mo卜L~ sulfate acid solution,column temperature
was 50℃ ,the flow rate was 0.8 mI ·min~.REsIII I The calibration curves of ma lt ose were linear in the concentration
range from 5—4()g·L_。,the average recovery and RSD were 99.4 ( =6)and 1.13 ,respectively.CONCLUSION The
method iS accurate,simple and can be adopted for determ ining the malt ose in HBIGIv.
KEY W0RDS:HPI ;HBIGIV;ma lt ose;content
人乙肝免疫球蛋白是用于防治乙肝病毒感染的
一 种特异性免疫制剂[】· ,由含有高效价乙肝抗体的
健康人血浆中提取精制而成[3]。目前我国批准上市
的人乙肝免疫球蛋白为肌肉注射剂[4],静脉注射用人
乙肝免疫球蛋白在欧洲药典中已有收载[5],但我国尚
处于研究试制阶段。本实验用高效液相色谱法测定
静脉注射用人乙肝免疫球蛋白中的麦芽糖含量。
1 仪器与试药
岛津高效液相色谱,LC一10AD泵,RID一10A
示差折光检测器,CTO一10ASVP柱温箱;台式离
心机(8O一2B型,上海安亭科仪厂);麦芽糖
标准
excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载
品
(chem.service Inc.);静脉注射用人乙肝免疫球蛋
白 (蛋 白 含 量 5 ,批 号 20040501、20040502、
20040503,三九集团双林药业公司试制);其他化学
试剂为分析纯。
2 方法与结果
2.1 色谱条件 采用氨基柱(Kromasil 100-5NH2,
4.6 mmX250 mm),流动相为0.004 mol·L 的硫酸
溶液,柱温 5()℃,流速0.8 mL·min~,进样量 20 L。
2.2 溶液配制
2.2.1 标准品储备液 麦芽糖标准品经85℃干燥
恒重,精密称取5.002 8 g,放人 100 mL量瓶,加水
溶解并稀释到刻度。
2.2.2 供试品溶液 准确吸取 10 mL人乙肝免疫球
蛋白静脉注射液,置于50 mL量瓶,加入1.5 磺基水
杨酸至刻度,沉淀后离心(3 000 r·min~,10 min),上
清液用0.45 tan的微孔滤膜过滤,取续滤液。
2.2.3 阴性对照溶液 按工艺
规程
煤矿测量规程下载煤矿测量规程下载配电网检修规程下载地籍调查规程pdf稳定性研究规程下载
制备免疫球蛋
白液,不加麦芽糖,取此空白蛋白液 10 mL,置于 50
mL量瓶,加入1.5 9/6磺基水杨酸至刻度,沉淀后离
[作者简介]吕应年,男.硕士,讲师,电话:0759—2388405,E-mail:lyn7591@hotmail.corn
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· 686 · 中国医院药学杂志 2006年第 26卷第 6期 Chin Hosp Pharm J,2(H)6 Jun,Vol 26,No.06
心(3 000 r·rain~,10 rain),上清液用0.45 m的微
孔滤膜过滤,取续滤液。
2.3 系统适应性及专属性试验 分别取对照品溶
液、供试品溶液及阴性对照品溶液各 2() L进样色
谱仪,记录色谱图如图 1。在上述色谱条件下麦芽
糖出峰时间 4 rain,供试品在麦芽糖峰相应位置有
一 显著峰,无其他杂峰,阴性对照品在麦芽糖峰相应
位置无吸收。试验结果表明人乙肝免疫球蛋白溶液
经沉淀离 fl,除蛋白后不含有麦芽糖检测的干扰物
质,色谱系统的适应性及专属性良好。
4 5 6 4 5 6 4 5
timin t/rain t/rain
图 1 高效液相色谱图
A麦芽糖标准品;&供试品;C.阴性对照品
Fig 1 HPLC chromatograms
A refe-rence substance;13.sample;C.negative control
2.4 线性关系考察 精密吸取标准品储备液1.(),
2.0,4.0,6.(J,8.()mL,分别放人 10 mL量瓶,加水
到刻度,摇匀即得系列浓度的对照品溶液。分别取
配制好的各浓度对照品溶液 2() L,进样高效液相
色谱。以峰面积 A为纵坐标,麦芽糖浓度 C为横坐
标回归 计算,得 回归方 程:Y = 一6 484.2 X +
10 033.0,r=0.999 5。表明本法检测麦芽糖含量
在 5~4()g·L 范围内线性关系良好。
2.5 精密度试验 精密吸取麦芽糖对照品溶液,按
照上述色谱条件和检测方法连续进样,每次进样量
2() L,进样 6次,以峰面积计算相对标准 偏差
RSD。计算得 RSD为0.65 9/6,表明试验方法精密度
良好。
2.6 重复性试验 取同批号供试品6份,按供试品
溶液配制方法制样,每份进样 2() L,测定麦芽糖含
量,计算相对标准偏差 RSD。计算得麦芽糖平均含
量100.6 g·L‘。,RSD为0.35 9/6,表明试验重复性 良
好 。
2.7 加样回收率试验 取 1()mL相同批号的供试
品 6份,准确称重 6份麦芽糖标准品,分别加人供试
品中,按供试 品溶液配制方法制样,每份进样 1()
L,计算样品麦芽糖含量平均回收率。计算结果如
表 I,平均回收率99.4%,RSD为1.13 。
2.8 样品含量测定 按照“2.2.2供试品溶液配
制”的方法制样,取 20 L进样,测定,根据峰面积
表 1 麦芽糖回收率试验结果( =6)
Tab 2 Results of recovery of malt ose( 6)
计算麦芽糖含量。本品为蛋白含量 5 9/6的人乙肝免
疫球蛋白静脉注射溶液,其中麦芽糖含量应控制在
(100±10)g·L~。测定并计算结果批号分别为
20040501,20040502,20040503的样品麦芽糖含量
分别为100.6,10().7,101.7 g·L~。
3 讨论
麦芽糖在静注人乙肝免疫球蛋白制剂中作为蛋
白质的稳定剂,具有维持蛋白质活性结构、防止蛋白
质沉淀变性的作用。麦芽糖含量是该制剂的一项重
要质控指标,麦芽糖含量过低不能有效起到蛋白质
保护剂的作用,含量过高可能对接受输液的糖尿病
患者不利,因此准确控制制剂中麦芽糖含量十分重
要。
由于麦芽糖分子没有共扼结构,不能产生紫外
吸收,本方法中不采用常见的紫外检测器。在示差
折光检测中麦芽糖有明显的吸收峰,响应灵敏,因此
高效液相色谱分析采用示差折光检测器。
作者在实验研究中曾采用水作为流动相,样品
中的磺基水杨酸在水中电离,对氨基柱的使用寿命
不利,而在酸性条件下磺基水杨酸的电离被抑制,经
多次实验比较最后选定用0.004 tool·L 的硫酸溶
液作流动相,可保护氨基柱,延长柱的使用寿命。
蛋白质的存在会影响麦芽糖含量的测定,供试
批号的蛋白制剂中麦芽糖的含量大约 100 g·L~,
高效液相色谱分析时先要进行稀释。因此在制备供
试品溶液时,加人 4倍体积1.5 9/6的磺基水杨酸溶
液,不仅可以将供试品中的蛋白质沉淀除去,而且将
麦芽糖含量稀释到20 g·L 左右,在 HPLC测定的
线性范围内,所得结果准确可靠。
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