【doc】 ES细胞-D3诱生的胰岛素分泌细胞及其分泌的胰岛素降糖活性的研究

【doc】 ES细胞-D3诱生的胰岛素分泌细胞及其分泌的胰岛素降糖活性的研究 ES细胞-D3诱生的胰岛素分泌细胞及其分 泌的胰岛素降糖活性的研究 第43卷第8期 2005年8月 山东大学(医学版) JOURNALOFSHANDONGUNIVERSITY(HEALTHSCIENCES) Vo1.43No.8 Aug.2005 文章编号:1671—7554(2005)08—0671—03 ES细胞一D3诱生的胰岛素分泌细胞及其分泌的 胰岛素降糖活性的研究 刘星霞,缪兵,李府,马秀峰,时庆,沈柏均 (山东大学1.齐鲁医院低温医学研究室;2.医学院生理研究所,山东济南250012) 『摘要1目的:探讨ES细胞一D来源的胰岛素分泌细胞(IPCs)分泌的胰岛素的降糖活性及IPCs移植 对糖尿病(DM)鼠的降糖作用.方法:ES细胞一D培养于经处理的鼠胚成纤维细胞滋养层上保持未分化状 态扩增,对数生长期时转入无血清含bFGF的DMEM诱导液进行诱导分化.使其分化为IPCs.于诱导的 第2l天,用ELISA法检测IPCs受高糖刺激2h后所分泌的胰岛素.同时将分泌的胰岛素静脉注射给小 鼠,观察受鼠血糖的变化;将诱生的IPCs移植给链脲菌素(SrZ)诱导的DM小鼠.观察受鼠血糖水平的 改变.结果:ES细胞一D体外诱导生成的IPCs所分泌的胰岛素具有降糖活性.且IPCs经两次移植给DM 小鼠后第5天,血糖水平较移植前显着降低(P<0.05).第2次移植后第l5天,受鼠血糖水平反弹到与移 植前没有差别.结论:小鼠ES细胞一D诱导生成的IPCs能够分泌有活性的胰岛素.且在一段时间内可显 着降低DM受鼠的血糖 『关键词1干细胞;胚胎;糖尿病;小鼠,近交BALBC 『中图分类号1R587.1’l文献标识码1A Studiesoftheglucose--reducingactivityofinsulin--producingcells “ ginatedfromembr~”cells—DoriginatedtromembryonicstemcellsD— LIUXing—xia,MIAOBing,LIFu,MAXiu—feng,SHIQing,SHENBai—jun (1.DepartmentofCryomedicine,QiluHospitalofShandongUniversity,Jina n250012,Shandong,China;2. InstituteofPhysiology,SchoolofMedicine,ShandongUniversity,Jinan250 012,Shandong,China) 【ABSTRACT】 Objective:Tostudytheglucose—reducingeffectofinsulin—producingcells(I PCs)de— rivedfromembryonicstemcellsfESCs)一 Dwereinducedinserum—freeDMEM D.Methods:Firstly,ESCs— supplementedwithbFGFformorethan2weeks.InsulinsecretionwasexaminedbyELISA.andthefunction ofsecretedinsulinwasdeterminedbyglucose—reducingexperimentonmice .Secondly,experimentaldiabetes wasinducedin6一to8一 week—oldmaleBALB/Cmicebyasingleintraperitonealinjectionr200mg/kg)of streptozotocinfreshlydissolvedin0.1mol/Lofcitratebuffer.pH4.5.andtheinducedIPCswereharvestedat day2lofinduction.andthengraftedsubcutaneouslyintheshoulderofstreptozotocin—diabeticmicetoob— serveitsglucose—reducingeffect.Results:ESCs—Dcouldbeinducedtodiff erentiateintoIPCsinserum—free DMEMsupplementedwithbFGF.TheinducedIPCssecretedactiveinsulin.andIPCstransplantationcould f基金项口1围家n然科学基金资助课 题 快递公司问题件快递公司问题件货款处理关于圆的周长面积重点题型关于解方程组的题及答案关于南海问题 (30271248) 【作者简介】刘星霞(1970一),女,博十,讲师.主要从事干细胞(尤其是 胚胎干细胞)的诱导分化及其移植治疗研究. (通讯作者1沈柏均,教授,博十生导师.主要从事干细胞(尤其是胚胎 干细胞及脐血造血干细胞)的扩增及其移植治疗研究. 672山东大学(医学版)43卷8期 reducebloodglucoseofdiabeticmousesignificantly.Conclusions:ESCs-D3 canbeinducedtodifferentiate intoIPCsinsenlm-freeDMEMsupplementedwithbFGF,andtheinducedIPCsnotonlysecretactiveinsulin, butalsoplayglucose-reducingroleswhenengraftedindiabeticmice. 【KEYWORDS】 Stemcells;Embryo;Diabetesmellitus;Mice,inbredBALBC 胚胎干细胞(embryonicstemcells.ESCs)诱导 分化为胰岛素分泌细胞(insulin.producingcells. IPCs)的研究尚不足5年,但该领域在探索诱导 分化的条件等方面已经取得了很大的进展].目 前,研究诱生的IPCs的分泌功能文献较多.但关 于IPCs及其分泌的胰岛素是否具有活性.尚未 见报道.我们实验室在国内较早开展了小鼠 ESCs.D诱导分化成IPCs的研究.并已取得成功 ] ,在此基础上,本研究进一步探讨了诱生的IPCs 所分泌的胰岛素的降血糖作用,并采用链脲菌素 (streptozotocin,STZ)制备的BALB/C小鼠糖尿病 (diabetesmellitus,DM)模型,研究了诱生的IPCs移 植对DM小鼠的降m糖作用 1材料与方法 1.1材料ES.D细胞系购自中国科学院上海细胞 生物化学研究所.DMEM,胎牛清及1%非必需 氨基酸购自Gibco公司:血清替代品3(SerumRe. placement3),链脲菌素(Streptozotocin.STZ)和双 硫腙(Dithizone,DTZ)购ASigma公司:重组鼠白 血病抑制因子(rm.LIF)购自Chemicon公司:重组 鼠碱性纤维母细胞生长冈子(rm.bFGF)购自R&D System公司.LIFESCANm糖仪系美国强生公司 产.雄性BALB/C小鼠36只,6,8周龄.(20+2)g. SPF级,南山东大学实验动物中心提供 1.2方法 1.2.1ES细胞.D诱导分化为IPCsa取孕13d BALB/C小鼠胚胎,常规法制备滋养层细胞.将ES 细胞.D,种植于原代鼠胚成纤维细胞滋养层上.种植 密度为5x10个/ml.将处于对数生长期的保持未分 化状态的ES细胞.D用胰酶.EDTA消化后,悬浮 培养于无血清含bFGF的DMEM诱导液进行诱导 分化. 1.2.2ELISA法检测IPCs分泌的胰岛素取诱导 分化第21天的细胞,用含5.5mmol/L葡萄糖的无 血清条件培养液(高糖刺激液)洗2次.继续高糖 刺激培养2h后,收集培养上清液,检测其中胰岛 素的含量. 1.2.3诱生的IPCs分泌的胰岛素的降糖活性雄 性BALB/C小鼠18只,随机分3组,每组6只.? 诱导第21天上清组:各鼠经尾静脉注射诱导分化 第21天的培养上清液0.3ml;?诱导第43天上清 组:各鼠经尾静脉注射诱导分化第43天的培养上 清液0.3ml作为对照;?标准胰岛素对照组:各鼠 经尾静脉注射标准胰岛素溶液0.3ml作为阳性对 照.用LIFESCAN血糖仪分别于注射前,后10,30 min检测每组小鼠各时间点的血糖水平. 1.2.4诱生的IPCs皮下移植对DM小鼠血糖的影 响. 1.2.4.1I型DM模型的制备雄性BALB/C小 鼠18只,适应性饲养3d后,随机均分为3组,每 组各6只.I组为IPCs移植治疗组,II组为DM模 型对照组,III组为正常对照组.I组,II组小鼠 一 次性腹腔注射STZ200mkg(用pH4.5的柠檬 酸缓冲液配制0.4%的STZ溶液)以制备DM模 型.III组各鼠腹腔注射等体积的柠檬酸缓冲液. 14d后,用LIFESCAN血糖仪分别检测各组小鼠 的血糖水平(检测时间均为上午10:00左右),I 组,II组小鼠血糖>16.7mmol/L即诊断为糖尿病. 1.2.4.2IPCs皮下移植及指标检测I组肩胛部皮 下移植IPCs(约5xlO个细胞/鼠),同时.给II组 及III组皮下注射等体积的诱导液作对照,初次移 植后第5天.相同剂量的IPCs用同法再行第2次 移植.第2次移植后第5天和第l5天,分别检测 各组小鼠的血糖水平. 1.3统计学处理采用两样本均数比较的t检验. 所有数据均用魁s 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 示,0【:0.0500(单侧). 2结果 2.1ELISA法检测诱生的IPCs所分泌的胰岛素 诱导分化第21天的IPCs经高糖刺激培养2h后. 上清中含有大量胰岛素[(43.7+6.2)~IU/ml,凡=6】. 刘星霞,等.ES细胞一D诱生的胰岛素分泌细胞及其分泌的胰岛素的 降糖活性研究673 2.2诱牛的IPCs分泌的胰岛素的降糖活性见 图1南图1可见,诱导分化组第21天培养上清 液注射给小鼠后,与注射前比较,小鼠血糖水平在 注射后10rain和30rain都显着降低(P<0.05);标 准胰岛素对照组小鼠血糖水平与注射前比较,在 注射后10rain和30rain也均显着降低(P<0.05); 诱导分化组第43天培养上清液注射组小鼠在注 射前后血糖水平基本不变. 二 0 昌 昌 一 * 氅 l23 (注射前)(注射后l0min)(注射后30min) 图1IPCs分泌胰岛素的降糖活性 Fig.1Glucose—reducingeffectofsecretedbyIPCs 2.3诱生的IPCs皮下移植对DM小鼠血糖的影 响见表1.由表1可见,移植前与制模前相比, IPCs移植组及DM模型对照组血糖水平均明显增 高(P<0.05);正常对照组无明显变化,模型制备成 功.初次移植后第5天,IPCs移植组血糖水平较移 植前无明显改变,初次IPCs移植并未起到降糖作 用:再次移植后第5天与移植前相比.IPCs移植组 血糖水平明显降低(P<0.05),且明显低于同时期 DM模型对照组的水平(P<0.05),IPCs第2次移 植.可有效降低受鼠血糖;再次移植后第15天, IPCs移植组血糖水平反弹至与移植前的血糖水平 无明显差别DM模型对照组和正常对照组小鼠血 糖水平始终均无明改变,且前组一直维持在高 水平,而后组一直维持在正常水平,, 表1IPCs移植前后各组小鼠m糖水平(?s.c/mmol?L-) 1PCs移植组56.2-+0.520.9?2l21.9+-2.3169?0.621.5+-2.8 DM模型对照组563?0.419.5+-2.522.1+-2.921.2?232l5?2.1 未造模对照组663?0.56.4+-0.973+-067.1?0.86.8+-1.0 P<O,05VS本组制模fjf『.P<O.05vs本组移植前,P< 0,05VSDM模型对照组 3讨论 ESCs诱导分化为IPCs的研究起步较晚,相 关报道不多,尤其是关于诱导qj成的IPCs及其 分泌胰岛素降糖活性研究的文献更少.所以,我们 在ES细胞一D诱导生成IPCs获得成功的基础上, 进一步研究了ES细胞一D诱生的IPCs及其分泌 胰岛素的降糖活性.本研究结果表明,诱生的IPCs 能够分泌胰岛素,且其分泌的胰岛素具有活性,它 与标准胰岛素一样,能够显着降低正常鼠的血糖 水平此外,第21天诱导培养上清液能显着降低 受鼠血糖水平;而第43天诱导培养上清液不能降 低受鼠血糖,说明诱导生成的IPCs分泌胰岛素的 能力具有时程变化 此外.关于诱生的IPCs移植受鼠后是否具有 体内降糖活性的报道较少.Soria等?报道将IPCs 移植脾脏,能够将DM小鼠血糖水平降至正常,并 维持l0周左右,然后,约一半受鼠血糖反弹至移 植前水平,原冈不明:Blyszczuk等进行IPCs脾脏 内及肾脏被膜下移植,能够将DM小鼠血糖水平 降至<10mmol/L,并维持约14d.上述研究说明, 脾脏内移植效果较为肯定.而Lumelsky等l3j进行 IPCs皮下移植时,未能纠正受鼠的高血糖,但受鼠 的一般状况得到改善,体重不减,原因不明本研 究在进行IPCs移植治疗实验时,考虑到临床应用 及患者的接受程度.认为皮下移植治疗有较大的 实用价值,故选择受鼠行皮下移植.本研究结果表 明,在第1次移植后第5天,血糖水平未降,我们 怀疑移植细胞的数量不够,接着进行了等量IPCs 再次移植.第2次移植后的第5天,发现小鼠血糖 虽然未降至制模前水平,但较移植前显着降低(尸< 0.05).上述结果说明,在本实验中,IPCs皮下移植 虽然不能将模型鼠的血糖水平降至正常.但在一 段时问内,能够明显降低DM受鼠的血糖水平,具 有一定的治疗作用. 本研究结果证实.小鼠胚胎干细胞ES—D能被 诱导生成IPCs,它诱生的IPCs能够分泌有活性的 胰岛素,且IPCs皮下移植,在一段时间内,能够显 着降低DM受鼠的血糖水平,从而有一定的治疗作 用.至于文献报道的皮下移植疗效不肯定的原因, 我们认为可能与移植IPCs的年轻程度,功能状态, 细胞数量,移植局部微环境,受者病情的严重程度 及个体差异等因素有关.目前,该领域的研究尚处 于初始阶段.ESCs诱生的IPCs用于临床移植治疗 糖尿病.还有很长的路要走,我们的研究结果将会 为今后人胚胎干细胞诱生的IPCs用于临床移植治 疗糖尿病提供有力的实验证据. (下转677页) (上接673页) 【参考文献】 【1】SoriaB,RocheE,13erna(.eta1.Insulin—secretingcells derivedfromembryonicstem(?ellsnormalizeglycemia inslreptozotocin—induceddiabeticmicelJ1.Diabetes, 162. 2000,49:157— 12jAssadyS,MaorlG,AmitlM,eta1.Insulinproductionby humanembry~)nicstemcellsIJI.Diabetes,2001,50: l69l—l697 【3】LumelskyN,BlondelO,LaengP.eta1.Differentiationof embryonicstemcellstoinsulin—secretingstructuressim— ilartopancroaticisletsIJI.Science,2001,292(5520): 【4】 【5】 【6】 l389一l394 BlyszczukP,CzyzJ,KaniaG,eta1.ExpressionofPax4 inembryonicstemcellspromotesdifferentiationof nestin—positiveprogenitorandinsulin—producingcells[J]. ProceedingsoftheNationalAcademyofScienceofthe UnitedStatesofAmerica,2003,lo0f31:998一l003. 刘星霞,沈柏均,李府,等探索胎干细胞分化为胰 岛素分泌细胞的诱导条件….山东大学(医学版), 2O04,42(1):118—120. 李艳华,裴雩涛.干细胞一糖尿病细胞治疗的新资源fJ1. 巾华内分泌代谢杂志.2003.19(11:429—431. 『收稿日期2004.Ol一131 (编辑:刘霞)