光合细菌中类胡萝卜素对脂质过氧化抑制作用研究

光合细菌中类胡萝卜素对脂质过氧化抑制作用研究 光合细菌中类胡萝卜素对脂质过氧化抑制 作用研究 第32卷第3期上海交通大学Vo】.32No3 对脂质过氧化抑制作用研究 俞吉安,叶永钧,林志新’--__--一 (上海交通大学生命科学与技术学院) 兰先德范小兵Q;f (上海交通大学昂立生物医药研究所) 摘要光合细茵中的类胡萝素有许多不同类型,从Rd.sphaeroidesP株中提取的类胡萝 素主要是一胡萝素,而从Rd.capsulataN株中提取的主要是蕃茄红素.在两个重要离体 系统中(即Fe一牛血清蛋白一亚麻油酸和Fe一脑组织匀浆),这些粪胡萝素具有显着的抗脂 质过氧化作用,当系统中类胡萝素敢度为0.2mg/L时,它们对脂质过氧化抑制率接近或超 过80.进一步研究表明,它们能明显地抑制邻苯三酚的自氧化速率.这证明它们对超氧阴离 子也具有很好的淬灭作用. 关键词垄全塑堕;苎塑蔓,查;叠釜弛墨塾翌苎? 中图法分类号Q93 OnEffectofCarotenoidsin PhOtOsyntheticBacteriaonInhibitingLipidPeroxiation YuJi’4,YeYongjun?LinZhixin (SchoolofLifeScienceandTechnology,ShanghaiJiaotongUniversity,China) LanXiande,FanXiaobing (SJTUOnlyBiologicalMedicineInstitute) AbstractCarotenoidsinphot0syntheticbacteriahavemanydifferenttype.Themainoneextracted fromRd.sphacroidesP4iscarotene,whilefromRd.capsutalaN3islycopene.Intwoimportantsys— ternsinvitro(Fe一BSA—linolenicacidandFe”一 brain—homogenat)they(carotenoidsextractedfrom P4orN3)haveaneffective~unctionofinhibitinglipid—peroxiation.Whenth econcentrationof carotenoidsisinthesystemsis0.2mg/L,theratesofinhibitionarenearlyorover80.Thefurther studiesshowthattb.eycouldinhihketherateoftriphenoKclog’sself-oxiat~o nobviously.Ithasbeen provedthattheyalsohavegoodeffectonquenchingsuper—oxideanion. Keywordsph0tosyntheticbacteria;carotenoids;Iipid—peroxidation;super —oxideanion 所有需氧的生物在新陈代谢过程中都会产生超氧酮离子,羟自由基等,并由此引发产生大量有机过 氧化物自由基(如RO和RO0’等),给机体造成很大损害,引发许多严重疾病如肿瘤,心血管疾病 等….在正常情况下,机体本身具有清除这些自由基的能力,但随着年龄的增长或不良环境因素打破这 种平衡时,体内自由基浓度将升高,由此引发各种疾病因此,国内外许多研究者从脂质过氧化角度探讨 了一些疾病发生的机理,并针对发生原因寻找有效药物或食品,以达到治疗和预防疾病的目的【. 收穑日期;1997一O3一l2 俞吉安:男,1946年生,鼓授.邮编;200030 io8上海变通大学第32卷 光合细菌是一种古老的微生物,它主要通过光合磷酸化获得能量而生长繁殖,其间会产生大量自由 基,同时细胞内也存在着有效的自由基清除系统,如类胡萝h素除行使传递光能作用外,一个重要的功 能就是清除自由基,以保护富含脂质的膜结构不受损伤. 本文分别从浑球红假单胞菌P株和荚膜红假单胞菌N中提取了不同类型的类胡萝h素,在两个 富含脂质的重要测定系统中,肯定了它们对脂质过氧化的抑制作用.并在连苯三酚自氧化系统中,证实 了它们对超氧阴离子的淬灭作用,从对氧自由作用的角度评价了光合细菌中类胡萝h素的生物学意义. 1材料与方法 1.1菌种及培养条件 浑球红假单胞菌P株(RhodobactersphaeroidesP)由上海交通大学生命科学与技术学院分离和保 存,荚膜红假单胞菌N(RhodocapsulataN.)由中科院上海植物生理所提供.以RCVBN为培养基, 光照强度为3000Ix,温度3O?,厌氧静置培养. 1.2类胡萝素的制取 制取方法与文献[5]中类同. 1.3在BSA.亚麻油酸-Fe系统中,类胡萝素对脂质过氧化抑制作用制定 用牛血清蛋白(BSA,上海医学化学研究所产品)配成浓度为1mg/mL的溶液,用3-氨基邻苯二甲 酰肼(Luminol,英国Aldrich公司产品)配成浓度为0.354mg/mL的溶液,两者以2.1体积比混合.取 混合液200L,加入15L亚麻油酸(日本东京化成工业株式会杜产品).然后,再加入不同浓度的类胡 萝h素抽提物的乙醇溶液2OL,空白对照组加入2OL无水乙醇,或加 入胡萝h素标准纯品(日本 东京化成工业株式会社产品)作为标准对照组.用生理盐水加至总体积为900,37C温育30rain,再 加入浓度为10mmol/L的FeSO溶液100L,继续温育30mln后,用SGH-H型生物化学仪测定该系 统30s内累积脉冲数(CP30s),每个浓度测定5只样品,取平均值. 1.4在脑匀浆-Fe系统中,类胡萝卜素对脂质过氧化抑制作用的测定 图1皂化前后P’抽提物和标准.胡萝卜 索觜外光谱比较 Fig.1Thecomparisonbetweenabsorption spectraofcarotenoidesfromP’be. foreoraftersaponificationandthe standard.carotene 2结果与讨论 取新鲜小鼠大脑组织,匀浆,用生理盐水配成含匀浆 1O的悬液,取400L悬液,加入不同浓度的类胡萝h素抽 提物(乙醇溶液),空白对照组仅加入2OL无水乙醇,标准 对照组加入标准卢-胡萝h素纯品.用生理盐水将总体积补 至900L,在37oC,温育30rain,然后加入浓度为10mmol/ L的FeS0溶液100,继续温育15rain,用上述同样方法 测定CP30S. 1.5类胡萝素对连苯三酚自氧化系统中超氲阴离子的清 除作用 取9mL,pH8.2,50mmol/L的Tris—HC1缓冲液加入 比色皿中,再加入1mL不同浓度的类胡萝h素抽提物乙醇 溶液,空白对照组加入1mL无水乙醇,标准对照组加入 胡萝h素纯品乙醇溶液1mL,然后加入浓度为100mmol/L 的连苯三酚溶液2OL,在波长为420D.1T/.处测定其光密度 变化,反应开始时计时,每30S纪录OD值,重复3次. 2.1类胡萝素成分分析 P株的抽提物在皂化前含较多叶绿素4,皂化后,叶绿素基本已除去,其主要吸收峰为506Am, 473nm和447Dm,与标准卢一胡萝h素纯品特征吸收峰基本一致,进一步以薄层层析分析,展层后出现3 个色斑,根据层析图谱中与胡萝h素相对位置及色斑洗脱后其吸收光谱特征,与图1中标准胡萝 第3期俞吉安.等:光合细菌中类胡萝卜素对脂质过氧化抑制作用的研究log 素相比较.大致可确定其主要成分是一胡萝素(一Carotene).其次有紫菌红素(Rodopin)和角黄素 (Canthaxathix). N.株的抽提物中也含有叶绿素.,皂化后基本除去,而类胡萝素的主要成分是番茄红素 (Lycopene),其次也舍有一胡萝b素和紫菌红素. 2.2在BSA亚麻油酸一Fe系统中类胡萝b素对脂质过氧化的抑制作用 亚麻油酸为亚麻酸(70)和亚油酸(30)的混和物,其化学结构中有多个不饱和双键,在空气中会 发生自氧化作用,BSA也有较强的自氧化作用,而Fe的存在加快了这一进程.此系统是模拟生物膜中 易自氧化成分的典型模型,具测定应用价值.为提高测定灵敏度,在该系统中加入发光剂(Lumino1),由 于自氧化作用,引发系统中易氧化物超弱发光,发光值的大小可直接反映脂质过氧化作用的强度,可用 生物化学发光仪测定. 从表1中可看到,当上述系统中加八类胡萝素抽提物后,发光仪测得的CP3Os值显着下降,并且 抑制作用随加人类胡萝素浓度提高而增强,当P株类胡萝素浓度为lOmg/L时7~6,空白捌量杯CP30s为8?2 2.3在脑匀浆一Fe系统中.类胡萝i,素对脂质过氧化的抑制作用 脑组织中含有丰富的脂质和不饱和脂肪酸,特1其中二q-二碳三稀酸等易由Fe一引发脂质过氧化 作用,并由此产生生物材料超弱发光,其强度也可由发光仪直接测得.实验结果表明,在该系统中随加人 类胡萝h素浓度的提高,对脑组织中脂质过氧化的抑制作用也增强. 根据表2测得CP30s计算,当系统 中加入的P类胡萝素浓度为10mg/L时(系统中实际浓度为0.2mg/L),其抑制作用高达92.3, 与标准胡萝素纯品的作用接近;在同样浓度下,N株类胡萝b素的抑制作用较弱,为78.1. 衰2类胡萝卜素在脑匀浆一h计系统中对膳质过t化抑制作用 Tab.2Theeffectof~arotenoldeOllinhibitinglipid—peroxldatloninICe”一brainhomogenatesystem 对J!}【组加 止无水己醇,CP30S为49024-68t空白测量杯CP30s为84-2 2.4类胡萝b素对连苯三酚自氧化过程中产生的超氧明离子的淬灭作用 连苯三酚在碱性(pH8.2)条件下有自氧化作用,产生超氧阴离子自由基,并由它产生连锁反应,引 发羟自由基,单线态氧和过氧化氢产生,这些活性氧能直接或间接促进细胞膜中脂质过氧化,导致膜结 构损伤.因此,常用这类化合物自氧化法测定生物话性物质(如超氧化物岐化酶,维生索E等)对氧自由 基的清除能力一. 连苯三酚自氧化进程.可由420nm处OD值OD变化得到反映,OD的变化情况可由其氧化速 率的大小表示,从而间接表示超氧阴离子的产生量. LlO上海史通大学第32卷 由图2可见,随测定系统中类胡萝h素浓度增加,连苯三酚自氧化反应进程曲线斜率k变小,表明 连苯三酚自氧化速率变慢,原因是类胡萝h素对氧自由基淬灭作用随类胡萝h素浓度增加而增强.根据 图2计算出每一个浓度的类胡萝h素相对应的连苯三酚自氧化速率(即斜率值),并由此作图3.从图 3可以更清楚看到类胡萝h素对连苯三酚自氧化抑制作用的强度(值减小趋势)与类胡萝h素浓度的 相关性.图3还表明:在相同浓度下,P株类胡萝素对连苯三酚自氧化抑制作用要强于N株类胡萝 h素.实验结果还显示P类胡萝h素与标准一胡萝素的这种抑制作用强度十分接近. 图2不同浓度P株类胡萝h素存在下连苯三酚自 氧化反应进程曲线 Fig.2TheprocesscurveoftriphenolLogseLf-oxida- tioninthepresenceofdifferentconcentra tionsofcarotenoJdefromP. E 0 甘 删 l基 图3类胡萝h素浓度对连.苯三酚自氧化速率的影响 Fig.3Theeffectofdifferentconcentrationsof carotenoideontherateoftriphenollogseLf- oxidation 目前国内外比较注重研究一胡萝h素],而对种类众多的类胡萝素研究较少,而从有益微生物 中提取的色素.由于它们对人畜无毒,来源广泛,容易提取,成本低廉等优点,有着广阔的应用前景,也有 必要对其生理活性作进一步研究,本文在模拟组成生物膜典型的脂质成分及富含脂质的脑组织匀浆两 个重要测定系统中.肯定了从光合细菌提取的类胡萝h素对脂质过氧化显着的抑制作用.另外,从抑制 连苯三酚在碱性条件下,会产生超氧阴离子等自由基而引发自氧化过程的强度,阐明了类胡萝素对氧 自由基的淬灭作用.从而在对氧自由淬灭作用和抗脂质过氧化作用两个互相关连的方面评价了光合细 菌中类胡萝h素的生物学意义. 参考文献 方允中,李文杰.自由基生命科学进展.北京:原子能出版社,1993. 中华医学杂志编辑委员舍.脂质过氧化疾病专题.中华医学杂 志,1987,67(12):641,651 杨大庆,俞吉安.光台细菌P株分离鉴定微生物学通报,1991,18(3):135,138 WeaverPF,WallJD,GestH.Characterizationofrhodopseudomonascapsulat aArchMierobiol,1975,105:207 , 2l6 俞吉安t叶永钩,林志新类胡萝卜束在光合细菌P.株中生物合成及紫外防护.上海变通大学,1996,30(9):1,7 陈蔹莺.胡天喜.中药复方和某植物分泌液对脂质过氧化的抑制作用.发光,1994,15(4):348,352 谢卫华t姚菊芳+衰勤生.连苯三酚自氧化法测定超氧岐化酶括性+医药工业,1988,19(5):2l7,219 OscarH,ClarkA.Photoprotectivefunctionofearotenoids.In:KrinskyNI,ed. Carotenoids:ChemistryandBiolo— gy.NewYork:PlenumPress,1990. 12345678