申克孢子丝菌随机扩增DNA多态性分型研究

申克孢子丝菌随机扩增DNA多态性分型研究 申克孢子丝菌随机扩增DNA多态性分型研 究 临床皮肤科杂志2006年35卷第7期JClinDermatol,July2006,Vo1.35,No.7 申克孢子丝菌随机扩增DNA多态性分型研究 451 论着 王敬,尤刚,王晓红,李若瑜z (1.黑龙江省医院南岗分院皮肤性病科,黑龙江哈尔滨150001;2.北京医科大学第一 临床医院皮肤科.北京100730) 【关键词】申克孢子丝菌;随机扩增DNA多态性;聚合酶链反应 -4963(2006)07—0451-02 【中图分类号1R379.2【文献标识码lB【文章编号l1000目前国际上采用分子生物学方法如线粒体DNA限制性片 段长度多态性(RFLP) 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 等进行菌株分型研究I一,对流行病学 研究有很大促进作用.为了解我国北方地区申克孢子丝菌 (sporothr/xschenckii)DNA水平的特点,笔者对黑龙江地区孢子 丝菌病患者皮损中分离的29株申克孢子丝菌进行随机扩增 DNA多态性(RAPD)分型,探讨不同感染部位的致病菌与 RAPD型别之间的关系. 1材料与方法 1.1试剂 氯化苄为北京化学试剂厂生产的分析纯原液;随机引物 氧核苷三磷酸 SsssOPM.(上海生物 工程 路基工程安全技术交底工程项目施工成本控制工程量增项单年度零星工程技术标正投影法基本原理 公司);脱 (dNTP),DNA聚合酶(Taq酶),PCRmarker(PBR322)及6种内切 酶(酶切获得)购自深圳华美公司. l_2方法 收集从黑龙江省孢子丝菌病患者分离的申克孢子丝菌29 株,取材部位:上肢l6株,面部11株.下肢2株.其中菌种实验 编号al,a2,a3,a5,a6,a9,alO,al2,a14,a15,a16,al7,al8,a20, a22,a25,a26,a29为固定型孢子丝菌病;a4,a7,a8,al1,a13, a19,a21,a23,a24,a27,a28为淋巴管型孢子丝茵病. 1.2.1DNA提取所有菌种接种于沙堡培养(SDA)平皿.25? 培养2周,刮取菌丝体0.1,0.3g于Eppendorf管中,以氯化苄法 提取DNA~] 1.2.2RAPD分析反应在0.5mLEl~pendorf管中进行.反应体 系25Lo预变性94?40s,1个循环;94oC20s,35oC1min,72? 1min,45个循环;最后72C延伸10min.取l0反应产物,与 2溴酚蓝加样缓冲液混匀.点入含0.4~g/mL溴化乙啶的 1.5%琼脂糖凝胶中.用IxTBE缓冲液在80v电泳2.5h. 1.3统计学方法 首先用分子质量标记以确定反应产物在凝胶上的相对 位置,采用人工方法计算条带数量.有反应带为…1'.无反应 带为…0'. 单匹配系数Sin(singlematchingcoefficient)计算公式为:Sm= a/(a+b),式中…a'为两菌共有的…1'和"0"的条带总数."b"为两 菌非共有"1"和…0'的条带总数.输入每个菌株的…1'和…0'数据 后,用MINI软件的uPGMA聚类分析法进行分析.则表示菌株 间亲缘关系的树状图自动生成.将OPM.引物扩增后电泳分离 得到的条带总数输入电脑.用该软件分析. 收稿13期:2005-07—26;修回13期:2005—12-27 2结果 由OPM.引物扩增带型和聚类分析结果可将29株申克孢 子丝菌分为4型,即I,?,?,?型(其型内Sm值均为1.0.Sm 值表示菌株间相似程度),其中I型9株;?型5株;?型9株: ?型3株.型内一致性高而型间差异明显,即根据分子大小有 无237bp,695bp,994bp和1200bp条带判断DNA型别.另外 3株中a3同时缺少695bp和994bp2条带;al1同时缺少695 bp,994bp和1200bp3条带,因某特异带型的缺少并不能肯 定基因组中不存在此带,所以.是否为独特的种间型还有待于 进一步探讨;a26DNA已降解,无明确带型.可能的原因是模板 DNA本身在实验过程中受干扰所至.分型结果与聚类分析结果 完全一致.而其他引物如sss的扩增却不能显示上述4 种类型的结果,其种内差异不是很明显.5个引物扩增综合聚类 分析显示本实验用菌具有很大的种内相似性. 3讨论 申克孢子丝菌是一种在世界范围内广泛分布的双相真菌. Kawasaki等同曾对来自哥斯达黎加,美国,芬兰,巴西,13本的申 克孢子丝菌进行线粒体DNA分型研究.以l4个线粒体DNA 类型系统发生树为基础,申克孢子丝菌被分为两个主要的组:A 组(1,3型,11型和l4型)和B组(剩余的9个线粒体DNA类 型).13本的种群大多属于B组,而来自哥斯达黎加和中美洲的 种群大多属于A组.本实验对29株临床分离自同一地区的申 克孢子丝菌进行RAPD研究发现:由OPM引物扩增带型和聚 类分析的结果可将29株申克孢子丝菌分为4个种间型.反应 出种内DNA多态性.而多引物扩增综合聚类分析显示种内菌 株间相似程度较高.除OPM.引物外其他引物并不能很好地反 应其DNA多态性.申克孢子丝菌形态较为单一,表型多态性标 志少.本实验所用菌株通过RAPD虽发现种内存在多态性.但 经对照分析4个种间型与感染部位无明确对应关系.如al,a3, a14,a15RAPD型别虽不同.但在临床上均引起固定型孢子丝菌 病;a7,a8,a24,a28RAPD型别虽不同.但临床上均引发淋巴管 型孢子丝菌病.所以从总体看.本实验所用菌种内菌株问相似 程度较高. 目前还不知道中国申克孢子丝菌种群的线粒体DNA类型. 其与RAPD分型的联系与比较还有待于今后更深入的探讨 参考文献 【1】LinD,LehmannPF,HamoryBH,eta1.Comparisonofthree typingmethodsforclinicalandenvironmentalisolatesofAB. 452临床皮肤科杂志2006年35卷第7期JClinDermatol~July2006,VoI.35'No.7 pe哂llusfumigatus【J].JClinMicrobiol,1995,33(6): l596一l6O1. 【2]RinyuE,VargaJ,FerenczyL.Phenotypicandgenotypicanaly— sisofvariabilityinAspergillusfumigatus【J].JClinMicrobiol, 1995,33(10):2567-2575. 【3]MitchellTG,SandinRL,BowmanBH,eta1.Molecularmycolo- gy:DNAprobesandapplicationsofPCRtechnology~].JMed VetMycol,1994,32(Supp1)1:351-366. 【4]ZhuH,QuF,ZhuLH.IsolationofgenomicDNAsfromplants, fungiandbacteriausingbenzylchloride【J].NucleicAcidsRes, 1993,2l(22):5279—528O. 【5]KawasakiM,IshizakiH,NishimuraK,eta1.MitochondrialDNA analysisofExophialamoniliae[J].Mycopathologia,1993,121(1): 7—1O 论着 系统性红斑狼疮64例疾病活动临床指标分析 傅琳玲.曹双林 (南通大学附属医院皮肤性病科,江苏南通226001) 【关键词】红斑狼疮,系统性;疾病活动 【中图分类号】R593.24【文献标识码】B【文章编号】1000—4963(2006)07—0452 —01 系统性红斑狼疮(SLE)为一种侵犯多种脏器的严重的结缔 组织病.其病情复杂,缓解期和活动期往往交替出现ll1.笔者对 所在医院2001--2004年有明确SLE病史.因疾病活动需住院 治疗的64例患者进行临床回顾性分析,总结患者疾病活动时 的临床指标,现 报告 软件系统测试报告下载sgs报告如何下载关于路面塌陷情况报告535n,sgs报告怎么下载竣工报告下载 如下. 64例患者SLEDAI评分平均为(20.00+1.82)分,其中10,14 分11例,病情属中度活动.>15分53例,病情属重度活动.有 28例患者曾在本院住院治疗过,出院时SLEDAI评分平均为 (2.30+0.34)分,病情基本无活动,仅有2例出院时SLEDAI评分 分别为5分和8分,病情为轻度活动. 1临床资料2讨论 1.1一般资料 64例患者中男12例,女52例,平均年龄(34.2+0-3)岁,均 曾确诊为SLE,病程3个月,20年.64例患者均采用过糖皮质 激素,免疫抑制剂,氯喹等多种药物治疗.其中27例在本次住 院前仍服用泼尼松,剂量为2.5,30mg/d.此次住院的64例患者 因临床表现多样,在不同的科室住院,其中肾脏内科25例.呼 吸内科7例,血液内科6例,心血管内科5例,皮肤科4例.儿 科3例,骨科,放疗科,神经内科,消化内科,监护病房,产科各2 例,眼科,普外科各1例.64例患者本次住院时的主诉主要为: 面部和四肢水肿,胸闷,咳嗽,发热,便血,紫癜,腹泻,昏迷等, 皮肤出现蝶形红斑或盘状红斑狼疮(DLE)的皮损少见,其中58 例患者入院时病情危重. 1.2实验室及临床异常指标 根据多伦多大学SLE疾病活动指数(SLEDAI)的评估项目 对本组64例SLE患者的临床异常指标评估显示:白细胞减少 (<4.OxlO9/L)50例,血小板减少(<10.OxlO9/L)46例,发热(体温> 38?)37例,抗双链(ds)一DNA抗体阳性(滴度>1:64)60例,补 体减少60例,心电图异常50例,胸部x线片异常(肺纤维化, 肺纹理模糊,肺实变,胸腔积液等)38例,毛发改变14例,黏膜 破溃6例,蛋白尿52例,血尿(每高倍视野红细胞数>5个)18 例,管型尿4例,特异性肌酶改变2例,关节痛31例,甲周短棒 状血管扩张17例,中枢神经系统病变2例,出现新皮损4例, 眼底血管改变1例. 1-3SLEDAI评分 收稿日期:2005—07—26;修回日期:2005—10—07 64例患者均有明确的SLE病史.多为35岁左右的女性.病 程多在3年以上.此次入院,64例患者的临床表现复杂多样,大 部分患者病情危重.主要受累脏器为肾脏,其次为心脏,肺,血 液系统,脑和肝脏等,根据SLEDAI评分结果,这些患者病情均 处于中,重度活动期.而部分患者表现为高血压,高血糖,高血 ,咽部,尿路等感染及因低钙所致股骨头 脂和低蛋白血症.肺部 坏死往往与病情活动程度,长期使用糖皮质激素和免疫抑制剂 治疗有关.在临床上.SLE患者若出现新的异常症状,应首先考 虑病情活动,并给予相应的治疗. 从SLE活动指标看,常见的活动指标为血常规中全血细胞 减少,尿液中出现蛋白质,白细胞,红细胞,管型,胸部X线片, 心电图出现异常,抗ds—DNA抗体阳性,补体下降.上述SLE疾 病活动指标门诊均可检测,因而建立SLE患者门诊随访 制度 关于办公室下班关闭电源制度矿山事故隐患举报和奖励制度制度下载人事管理制度doc盘点制度下载 , 可及早发现病情活动.进行 规范 编程规范下载gsp规范下载钢格栅规范下载警徽规范下载建设厅规范下载 治疗.可提高患者的生活质量 和生存率.另外,本组患者抗SSA和抗SSB抗体,以及抗心磷脂 抗体检出率也较高,它们是否与病情易活动有关尚待进一步研 究.抗SSA抗体阳性者白细胞下降明显,与Wenzel等[31的报告 相似,其机制有待进一步研究. 参考文献 【1]赵辨.临床皮肤病学【M].3版.南京:江苏科学技术出版社, 20o3:662. 【2】蒋季杰.现代红斑狼疮病学【M】.北京:人民军医出版社,2005: 278-279. 【3]WenzelJ,GerdsenUerlichM,eta1.Lymphocytopeniainlupus erythematosus:closeinvivoassociationtoautoantibodiestargeting nuclearantigens[J].BrJDermatol,2004,150(5):994-998.