冠状静脉窦逆行灌注血管内皮生长因子基因的实验研究

冠状静脉窦逆行灌注血管内皮生长因子基因的实验研究 冠状静脉窦逆行灌注血管内皮生长因子基 因的实验研究 贵州医药2008年11月第32卷第11期 冠状静脉窦逆行灌注血管内皮生长 因子基因的实验研究* 贵州省人民医院心内科(贵阳550002)韦方李安杰周永刚袁明兰王树辉一 摘要目的观察经冠状静脉窦逆行灌注血管内皮生长因子基因(pAdtrackCMV- VEGF65)对其表达分布的影响.方法20只新西兰大白兔随机分为实验组(VEGF基因治疗组)和对 照组,2组动物常规全麻,气管插管,胸骨正中切开,暴露心脏,结扎左室支建立心肌梗死模型,冠状静 脉窦插管,实验组逆行灌注pAdtrackCMv.VEGF165,对照组以生理盐水对照.全程 记录 混凝土 养护记录下载土方回填监理旁站记录免费下载集备记录下载集备记录下载集备记录下载 心电,1周后 取梗死区(左室心尖部)及非梗死区(高侧壁)心肌,采用逆转录聚合酶链反应(IPCR)检测基因表 达情况.结果对照组1只动物死亡,实验组所有动物全部存活;结扎左室支即刻所有动物出现ST段 抬高并与T波融合;RT-PCR显示实验组梗死区检测到转染基因表达,而非梗死区及对照组则未检 测到转染基因表达.结论冠状静脉窦逆行灌注技术能很好地将VEGF基因靶向转移至梗死区. 关键词冠状静脉窦逆行灌注血管内皮生长因子基因治疗免心肌梗死 ExperimentStudyonpAdtrackCMV-VEGF165RetrogradePerfusionthroughCoronarySi nusin RabbitMyocardialInfarctionModelWFang,LiAnjie,ZhouYonggang,YuanMinglan,Wan g Shuhui.Depa~mentofCardiology,GuizhouProvincialPeople'Hospital,Guiyang550002, Guizhou,ina. AbstractObjectiveToobservetheaffectionofdistributionandexpressionofvascularendothe— lialgrowthfactorgene(pAdtrackCMv.vEGF165)bycoronarysinusretrogradeperfusioninrabbit myoeardialinfarctionmodelMethods2ONewZealandrabbitsweredividedinto2groupswhichwere experimentalgroupandcontrolgroup.2groupsanimalsweregeneralanesthesiaandopenthorax,ele— vatingtheapexoftheheart,clampingthemainsternofleftventHcularcoronary,pAdtrackCMV- VEGF165wereretrogradeperfusedtroughcoronarysinusinexperimentgroup.Thephysiologicalsa— linewasusedincontro1group.ThedistributionandexpressionofpAdtrackCMV-VEGF165werede- tected1week1ateratdifferentpointof】 eftvetrencle!Results1anirnaldiedincontrolgroupandallan- imalsurvivedinexperimentalgroup.TheSTsegmentofanimalselevatedimmediatelyandfusedwith Twaveafterthe1igationoftheleftmainventricularbranch.Inexperimentgroup,theexpressionof transferredgenecanbedetectedininfarctionareabyusingRT-PCRtechnique.However.theexpres— sionoftransferredgenewasnotdetectedinnon-infarctionareaaswellasincontrolgroup.Conclusion RetrogradecoronarysinusperfusiontechniquecouldperfectlydistributeVEGFgenetOthetargetis— chemiaareainrabbitmyocardialinfarctionmodel KeywordsCoronarysinusretrogradeperfusionVEGFGenetherapyRabbit Myocardialinfarction 中图分类号:R541.4文献标识码:A文章编号:1oOoI744X(2O08)11-0973-02 近年来,应用促血管生成因子达到所谓"自身搭 桥"基因治疗越来越引起人们的兴趣和关注,这些促 血管生成因子中最为肯定的是血管内皮生长因子 (VEGF).VEGF是1989年发现的特异性的促内 皮增生,促血管生成,增进内皮功能和存活的细胞因 子[】],大量研究表明VEGF具有促进缺血区域新生 血管形成,改善心功能等作用;但是,如何将基因靶 向导人缺血区域至今尚无完美的方法[2_引.本研究 旨在观察经冠状静脉窦逆行灌注VEGF基因对其 注:*贵州省优秀科技教育人才省长专项资金资助项目[黔省专 合字(2005)33号];科技厅:省黔科合字fiz0o433065 **本院检验科 ? 973? 在心肌分布的影响,为下一步临床应用奠定基础. 1材料与方法 1.1实验对象及心梗模型的建立新西兰大白兔 20只,体质量1.7"--2.5kg,雌雄不居,由贵阳医学 院动物实验中心提供,随机分为实验组(VEGF基因 治疗组)和对照组,氯安酮(10mg/kg)+氯丙嗪(20 mg/kg)麻醉,保持兔自然呼吸状态,仰卧固定于手 术台上,剪除胸前区毛,碘伏消毒,沿胸骨左缘切IZl, 切断左侧第3-.-4肋软骨,用开胸器撑开,暴露纵隔 及心脏,两侧胸膜完整,兔呼吸平稳.纵行切开心 包,用棉签轻轻将心脏向右上抬起,缝扎左室支,左 ? 974? 心室前壁及心尖部颜色变暗,搏动减弱,表明结扎完 全.将3根电极分别置于两上肢及下肢,连接MPA 多导生理记录仪(上海奥尔科特生物科技有限公司) 系统,于冠脉结扎前后连续描记心电图.确认心梗 模型成功建立后纵向剪开右心房,于冠状静脉窦口 周边用protene线作一荷包缝合,从冠状静脉窦口 插入顶端带有气囊的4F导管约3cm.注水3mI 使逆行灌注管前端水囊充盈,防止管道滑脱.实验 组予pAdtrackCMV_?GF1652与肝素5oU混 合溶于2mI生理盐水中,通过逆行导管灌入,温度 控制在34?,注人冠状静脉窦前要充分氧合,消泡, 滤过,防止气泡和微栓进入微循环.逆灌流量3,5 mI/min,逆灌压维持在3.92,4.90kPa;对照组予 肝素50U混合溶于2mI生理盐水中,同上步骤通 过逆行导管灌人,逐层关胸,予青霉素,庆大霉素肌 注预防感染.1周后按前述方法麻醉开胸,取梗死 区(左室心尖部)及非梗死区(左室高侧壁)心肌检测 VEGF基因表达情况. 1.2心肌VEGF基因表达检测采用RT-PCR 法,冰浴下将所取动物组织剪碎,置匀浆器中加入1 mL变性液匀浆,提取总RNA(QIAGEN公司),取 0.5/xg总RNA逆转录合成cDNA(QIAGEN公 司),再行PCR扩增.由于兔和人的VEGF有94 的同源性__4],为区别转染基因表达的VEGF和兔本 身表达的VEGF,我们在实验设计时选择人的 VEGF基因,并设计特异性引物区别兔自身的 VEGF(forward:5,CCTTGCTGCTCTACCTOCA(二3, backward5,ACAAI10C1,r_I]兀])肼了). 2结果 2.1动物存活情况对照组1只动物于术后3d 死亡,经尸检证实死亡原因为心衰,基因治疗组无动 物死亡. 图11:Marker;2,7:基因治疗组梗死区心肌组织; 8,1O:基因治疗组非梗死区心肌组织;11,12:对照组心肌 组织. 2.2心电图心电图检测以两个以上导联出现ST 段持续抬高及出现病理性Q波为心梗模型建立成 功标志.结扎左室支后即刻可见左室前壁及心尖部 GuizhouMedicalJournal,2008,Vo1.32,No.11 颜色变暗,搏动减弱,心电图出现ST段抬高并与T 波融合,提示心肌梗死模型制作成功. 2.3心肌组织VEGF基因表达检测结果实验组 梗死区心肌组织扩增出分别为490bp和432bp(人 VEGF)2条带,而非梗死区及对照组心肌组织仅扩 增出l条兔的VEGF片段(49Obp),见图1. 3讨论 基因治疗的关键是如何将治疗基因靶向转移到 缺血区域,目前应用较多的是心肌局部注射法和球 囊导管法[2.引,心肌局部注射法操作复杂,风险大, 难以被患者接受和推广,且很难达到多部位.利用 球囊导管经冠状动脉顺行介导法,由于冠脉狭窄或 闭塞很难真正到达缺血区.冠状静脉窦逆行灌注技 术(RCSP)是一种心肌保护措施,用于冠脉搭桥术 中,由于冠状静脉无瓣膜,不发生粥样硬化,在冠状 动脉发生粥样硬化时冠状静脉仍保持通畅,能够保 障药物到达缺血心肌区域形成有效浓度嘲.本研究 将RCSP技术与现代分子生物学技术巧妙结合,将 VEGF基因经冠状静脉窦逆行灌注,结果表明,基因 治疗组梗死区检测到转移基因表达,而非梗死区及 对照组则未检测到转移基因表达.说明RCSP技术 不仅能确保目的基因靶向转移需要新生血管形成的 缺血区域,而无需血运重建区域的外源基因则随血 流清除,避免在局部滞留造成不必要的血管新生. 总之,本研究结果表明,RCSP技术能很好地实现目 的基因的靶向转移,确保在需要血运重建的缺血区 域充分发挥生理作用. 参考文献 [1]CastillaMA,CarameloC,GazapoRM,eta1.Roleofan— dothelialgrowthfactor(VEGF)inendothdialcellpro— tectionagainstcytotocicagents[J].LifeSciences, 2000,67:1003—1013. 1-23LopezJJ,LahanRF,StamlerA,eta1.VEGFadminis— trationinchronicmyocaMiatischemiainpigsEJ].Card— iovascRes,1998,40(2):272—281. 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