BDNF诱导干细胞向神经元转化恢复创伤神经功能研究（可编辑）

BDNF诱导干细胞向神经元转化恢复创伤神经功能研究（可编辑） . 学校代码: 坌类苎:. 密 级: 学 号: 学位类别: 科学学位团 专业学位口 又蚌酱科矢粤 硕士学位 论文 政研论文下载论文大学下载论文大学下载关于长拳的论文浙大论文封面下载 ’ 论文题目:诱导干细胞向神经元转化恢复创伤 神经功能的研究一级学科: 临床医学 二级学科: 外科学 神外 论文作者: 王延民 指导教师: 张赛教授 天津医科大学研究生院 二九年五月/删四 删棚脚舢舢肼朋 学位论文原创性声明 本人郑重声明:所呈交的论文是我个人在导师指导下独立进行 研究工作取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容和致 谢的地方外,论文中不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过 的研究成果,与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在 论文中作了明确的说明并表示了谢意。 ? , 学位论文作者签名:之姥区日期:孵月谚日 学位论文作者签名:弦憋匹日期: 孵月谚日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解天津医科大学有关保留、使用学位论 ? 文的规定,即:学校有权将学位论文的全部或部分内容编入有关数 据库进行检索,并采用影印:缩印或扫描等复制手段保存、汇编以 供查阅和借阅。同意学校向国家有关部门或机构送交论文,并编入 有关数据库。 保密 ,在??年解密后适用本授权书。 本论文属于. 不保密囵。 请在以上方框内打“? 作者签名:塞壁区期:卿月谚日 翩签名芗缮吼叫年月妒日天津医科大学硕士学位论文 中文摘要 背景:随着社会的发展和经济的进步,人类生活方式例如交通工具的升级转 变以及生活环境在逐步改变,与此同时,颅脑创伤患者的数量与日俱增,颅脑创 伤以及颅脑创伤后遗症也越来越多地给我们人类造成身心及经济上不可估量的损 失。国内外众多学者的研究表明,多种组织来源的干细胞具备向神经细胞方向分化 的潜能,但研究同时发现几乎所有的干细胞均倾向于向神经胶质细胞而非神经元方 , 向分化。众所周知,大量神经胶质细胞增生是脑创伤后期进行神经组织修复的基础, 但与此同时,这也在极大程度上限制了以神经元为结构基础的神经功能的恢复。近 ~ 年来有很多研究报道,脑源性神经营养因子 , 可以在一定程度上增加干细胞向神经元方向的分化比例。本研究拟利用 这个特性,探索经基因修饰的干细胞是否具备进一步恢复创伤后神经 运动功能的能力。 目的:利用脑源性神经营养因子诱导干细胞向神经元转化的特性实现 对脑创伤后神经功能恢复的进一步优化。 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 :利用腺病毒载体转染进入脐带间充质干细胞,酶联免 疫吸附方法测定分泌时相;建立去胸腺小鼠脑液压打击模型进行 干细胞移植,检测如下指标:实验动物神经功能评分,干细胞移植位点的表 达,转染与非转染细胞在体内表达神经元特异性烯醇化酶和胶质纤 维酸性蛋白黜的比例,以及局部细胞凋亡数量。 结果:的表达于病毒转染 后持续高水平稳定分泌。体内移植后,动 物神经功能改善明显,位点阳性细胞比例明显增多,但 阳性细胞比例下降.,高表达位点周围细胞凋亡数量明显减少 .。 结论:通过对干细胞进行基因转染可增加干细胞向神经元而非神经胶质 细胞的分化比例,进一步提高干细胞恢复创伤后神经运动功能的潜能。 关键词:脑源性神经营养因子干细胞分化颅脑创伤天津医科大学硕士学位论 文: , 协, , ,, 谢, .? , ‘ . ’酉 . , , ., ., . :. : . , . , , . : .. ?天津医科大学硕士学位论文 :盱 , . 『【‘ :天津医科大学硕士学位论文 目录 中文摘要?“?? 缩略语/符号说明? 前言? 翮香?“??。??“一”一?”?”研究现状、成果? 研究目的、方法 材料 关于××同志的政审材料调查表环保先进个人材料国家普通话测试材料农民专业合作社注销四查四问剖析材料 和方法? 结果”” 讨论?” 结论??一?“?” 参考文献发表论文和参加科研情况说明附勇专 综述??“”脑源性神经营养因子基本特性及临床应用研究进展综述参考文献 一??“”? 致射?“? ?天津医科大学硕士学位论文 缩略语/符号说明 中文全称 英文缩写 英文全称 脑源性神经营养因子 神经元特异性烯醇化酶 胶质纤维酸性蛋白 心姆 脐带间充质干细胞 . 骨髓间充质干细胞 神经生长因子 中枢神经系统酪氨酸蛋白激酶 .天津医科大学硕士学位论文 刖舌 研究现状、成果:随着社会的发展和经济的进步,人类生活方式例如交通 工具的升级转变以及生活环境在逐步改变,与此同时,颅脑创伤患者的数量与日 俱增,程度也日益加重。统计资料显示,颅脑创伤占全身创伤发生率第二位,但致 死率和致残率却位居第一位。我国每年大约有万例颅脑创伤病人,其中死亡人 数约余万人,颅脑创伤已成为发达国家儿童和青年人伤病致死的首要因素。颅脑 创伤病人通常存在意识丧失、运动神经功能障碍、记忆功能障碍和精神功能异常。 颅脑创伤本身以及颅脑创伤后遗症也越来越多地给我们人类造成身心及经济上不可 估量的损失。 颅脑创伤带来的神经损伤能否及时准确地进行受损神经元修复是神经功能 恢复 与否的关键。全世界神经科学家、临床医师和药厂都在通力合作,力争把通过长期 实验研究发现的大量能够促进神经功能恢复的药物,逐步过渡到临床应用。国外学 者已经采用医学循证方法,将多种脑保护药物用于治疗急性颅脑创伤病人,但 未能发现任何一种临床真正有效的药物,其中包括如今临床常用的谷氨酸拮抗剂、 自由基清除剂、钙离子拮抗剂、大剂量激素等。 国内外众多学者的研究表明,多种组织来源的干细胞具备向神经细胞方向分化 的潜能。间充质干细胞是干细胞家族的重要成员,来源于发育早期的中胚层和外胚 层。间充质干细胞最初在骨髓中发现,具有多向分化潜能、造血支持和促进干细胞 植入、免疫调控和自我复制等特点,目前人们知道,人体内主要存在的干细胞有人 脐带组织源间充质干细胞与骨髓源间充质干细胞,迄今的研究表 明,脐带来源的间充质干细胞不但能够成为骨髓间充质干细胞的理想替代物,而且 具有更大的应用潜能。脐带间充质干细胞表达多种胚胎干细胞的特有分子标 志,具 有分化潜力大、增殖能力强、免疫原性低、取材方便、无道德伦理问题的限制、易 于工业化制备等特征,因此有可能成为最具临床应用前景的多能干细胞。 神经组织的再生是困扰医学界的难题之一,国内外研究发现,几乎所有的干细 胞均倾向于向神经胶质细胞分化而非神经元方向分化。大量的神经胶质细胞增生 是颅脑创伤后期进行神经组织修复的基础,但与此同时,这也在极大程度上限制了 以神经元为结构基础的运动神经功能的后期恢复。 在神经损伤修复过程中,神经元的生长必须有来自靶组织的营养因子的支持,天津医科大学硕士学位论文 限制了这些因子的产生,将使那些生长到错误靶组织或在靶组织错误定位的多余神 经元突触和轴突因得不到足够的营养因子而退化。在神经系统发育中,靶源性的神 经营养因子能够控制中枢神经系统相互联系的神经元的数量,促进神经元的成熟及 分化,并进一步促进神经递质的选择和转换过程中的酶系发育,促使错误联系的神 经元退化、死亡,在神经系统的生长、发育以及功能维持和神经系统的可塑 性 上起着极其重要的作用。 脑源性神经营养因子是目前继神经生长因子后发现的第二个神 经营养因子,众所周知,脑源性神经营养因子作为神经营养因子家族中的一 员,脑内存在着的,证实了中枢神经可以合成,主要分 布在大脑皮层、髓质、小脑、海马等中枢神经系统,另外在外周的心脏、肺、骨骼 肌和坐骨神经也检测到 的存在,还存在于的上丘及周围组 织中。是一类可促进运动神经元、感觉神经元、基底节前脑胆碱能神经元、 皮层神经元、海马神经元、多巴胺能神经元等多种神经元的存活和生长发育并能防 止它们受损死亡,改善神经元病理状态、促进受损伤神经元再生及分化成熟等生物 效应的多肽或蛋白质,在中枢神经系统的损伤修复中具有重要的作用。 对神经元的生存、生长、分化和可塑性有重要影响。在神经系统发育过 程中,通过受体的介导可诱导神经前体细胞的定向分化,加快神经元迁 移,促使神经元增生,确保神经系统的成熟和完善。在成体,则表现出广泛的神经营 养和神经保护作用,对神经元的存活、正常生理功能的维持及损伤后的修复有着积 极的意义。神经营养因子假说理论认为,处于发育中的神经元,其存活依赖于它所 支配的靶细胞产生的特殊的营养因子。 不但对多种神经元的发育分化和生长再生具有维持和促进作用,也能通 过为损伤神经元提供营养而挽救受损的运动神经元和感觉神经元。等 提出,是的一种由去甲肾上腺素能神经元合成的顺行性神经营养因子。 为了检测的功能重要性,实验中以多巴胺羟化酶作为去甲肾上腺素 能神经元的标记物, 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 了携带有.基因转基因鼠的 酪氨酸激酶活 性。发现在.转基因鼠去甲肾上腺素能神经元中的合成增加,可 以提高生后小鼠的新皮质这一去甲肾上腺素能靶区的 酪氨酸激酶活性;对 新生 鼠的面神经这一第二个去甲肾上腺素能靶区进行了功能检测,以进一步证实 去 甲肾上腺素能神经元表达的顺行性地调节着神经元的存活,发现若同时使对 照组及转基因组的新生鼠面神经损伤,周后,对照组小鼠的面神经神经元有% 天津医科大学硕士学位论文 缺失,而在.转基因鼠中,去甲肾上腺素能神经元的缺失仅为%%。 表明由去甲肾上腺素能神经元分泌并激活靶区的、致靶神经元存活和分 化,即存在有自去甲肾上腺素能神经元向其纤维及其末梢的顺行性转运,并 通过对受 损伤神经元提供营养而挽救受损伤的神经元。的细胞内信号传递途径主要有 两条,即途径和途径。在大多数情况下途径是发 挥作用的优势途径。一些神经递质受体如亲代谢性谷氨酸盐受体、、多巴胺 受体等和雌激素、可在体外激活神经元途径,而毒蕈碱类乙酰胆碱受体 在体外和体内均可使激活延长。从理论上来说,这类制剂的使用可能产生与 同样的神经元保护作用。 在外伤性脑损伤中的作用脑损伤可以使很多神经营养因子表达增加,其 中则可以削弱因为细胞毒素、自由基、缺氧或外伤等相关因素所启动的脑损 伤。其机制可能包括自由基代谢以及对钙平衡的维持等。有研究表明,脑损伤后, 丧失活 可通过调节 的活性来起到治疗作用,如果损伤导致 性,则的治疗无作用。等发现能减少介导的活体内的神 经细胞的死亡,这为艾滋病人的治疗和提高其生活质量提供了一种新的方法。在细 菌性脑膜炎中,能够抗氧化并能有效的减少细菌性脑膜炎多种脑损害,可能 是脑炎症性反应的内源性神经保护性机制的组成之一,因此可以作为这种疾病的辅 助治疗手段,能有效的保护大脑神经元和海马回的空间记忆等功能。在对老年性痴 呆的研究中发现,多巴胺神经元通过自分泌和旁分泌两种途径分泌以减少纹 状体的营养缺失。以前的研究认为对脑组织及空间记忆功能有保护作用,但 最近的研究发现,脑损伤后,不同性别的表达空间区域不同,在对环境强化 以改善空间认知方面没有明显作用。但抵抗神经损伤,促进神经元的修复、 分化、增殖,加强神经功能恢复等方面的作用已经较为肯定,因此,可以通过内部 和外部条件的改变来强化的表达来治疗脑损伤,并可把表达量的变化 作为疗效指标之一。 研究目的、方法:近年来有很多研究报道,脑源性神经营养因子 ,可以提高神经元的生物活性,减少损伤后神经 元的自然死亡。神经损伤后,影响再生的因素除局部及靶器官的某些反应产 物外, 邻近非神经元细胞、传入纤维的末梢及远近组织所释放的激素、营养物质、 代谢产 物等,均可通过局部扩散或血液循环到达损伤部位,影响神经再生过程。脑源 性神 天津医科大学硕士学位论文 经营养因子可以在一定程度上增加于细胞向神经元方向的分化比例旺。本 研究拟利用这个特性,探索经基因修饰的干细胞是否具备进一步恢复 创伤后神经运动功能的能力。 天津医科大学硕士学位论文 材料和方法 材料和方法 .材料与试剂 .一般材料:胎牛血清杭州四季青,胰蛋白酶美国 .重组腺病毒均购自中山大学;异硫氰酸荧光素标记流式抗体、 、、和英国,兔抗人抗体美国, 山羊抗小鼠胶质纤维酸性蛋白 ,抗体和罗 丹明荧光标记二抗北京中杉,兔抗小鼠神经元特异性烯醇化酶 ,和山羊抗小鼠抗体武汉博士德,试剂盒美国 公司,流式细胞仪美国 公司, 型号 pcr仪的中文说明书矿用离心泵型号大全阀门型号表示含义汽车蓄电池车型适配表汉川数控铣床 ,人脐带组 织天津高新区国家干细胞中心提供。雄性去胸腺小鼠只,均购自于中国 军事医学科学院,采用同等喂养方法饲养于天津医科大学动物实验中心。,: .脐带间充质干细胞 间充质干细胞是一类存在于多种组织、具有自我更新能力和多向分化潜能的细胞 口。脐带组织源间充质干细胞产量和绝大多数生物学特征与骨髓源间充质干细胞的 相似,且具有比骨髓源间充质干细胞更高的增殖能力,脐带组织源间充质干细胞目 前认为是骨髓源间充质干细胞理想的替代品嘲。间充质干细胞表面标志并非单一 性,它表达间质细胞、内皮细胞和表皮细胞等多种细胞表面标志喳一,一般认为整合 素家族成员、、以及等是间充质干细胞的重要标志物’ 铂,它属非造血类细胞,造血细胞表面抗原如造血前体细胞标志抗原、成熟 造血细胞标志抗原、白细胞标志抗原、淋巴细胞表面抗原和单 核细胞/巨噬细胞表面抗原阴性凹一们。间充质干细胞表面表达,, ,,和等分子,而不表达,,等造血细胞标 志’,由此可以与造血干细胞区分羽。 .研究方法 . 分组方法:该实验共分为对照组,不接受干细胞移植、单纯 移植组,接受单纯移植以及】汀移植组 ,接受转基因移植三组。这三组研究对象在以上资料方 面无显著性差异。 . 脐带间充质干细胞的培养与鉴定:在无菌条件下将人脐带 天津医科大学硕士学位论文 材料和方法 浸入无血清的中,洗涤去除残存血。将脐带剪碎至大小组织块, 先后经胶原酶?和.%胰蛋白酶消化,细胞筛过滤,离心。以.密度接种到 咖塑料培养皿,、%、饱和湿度条件下细胞培养箱中培养。至 单层贴壁细胞接近%汇合时,.%胰蛋白酶消化,:传代。取约个第 代细胞悬于液,分别加入适量异硫氰酸标记、、、和 抗体避光染色 ,检测采用间接荧光标记。 .流式细胞仪分析:取出细胞后,通过离心/, 方法用 溶液.洗次,去上清后,边振摇边缓缓加入 冷乙醇%乙醇、.% 氯化钠,避免细胞成团,固定过夜后,溶液离心洗涤,用柠檬酸缓冲液重悬 制备单细胞悬液并调整细胞浓度为个人,加入至终浓度/,置 室温 后,碘化丙啶染色 /,流式细胞仪采集数据钔。 . 基因转染与分泌时相测定:取生长状态良好的脐带间充质干细胞接 种于孔板,约%汇合时进行.重组腺病毒转染,分别于转染 、 、 、 后第 、 时间点应用方法检测培养液中的 表达水平,非转染的脐带间充质干细胞作为对照。 .脑创伤液压打击模型的建立: 侧方液压打击脑损伤模型通过液压装置骤 然改变密闭颅腔内的压力,从而造成颅脑损伤即。脑创伤液压打击模型的建 立:将 去胸腺小鼠以%水合氯醛腹腔注射麻醉之后,固定于标准的立体定向仪上,在 无 菌条件下暴露小鼠的颅骨,以颅骨前囟后. 为中心,开直 、中线右侧. 径 圆形骨窗,保持硬脑的膜完整性,固定打击管于骨窗边缘。连接液压颅脑 创伤仪,保持打击管内始终密闭,以峰值冲击压力为.加. 、平均时程 冲击致伤小鼠头部,制成小鼠液压颅脑创伤模型’刀。 . 移植:取生长状态良好的转染与非转染的脐带间充质干细 胞常规胰蛋白酶消化,充分悬浮,制成单细胞悬液备用。微量注射器固定 于立体定向架,于小鼠致伤后,紧贴骨窗边缘将悬液在内以 ×个/山缓慢匀速注入脑皮质创伤灶边缘。注射后留针,拔针后 针孔用医用生物蛋白胶封闭以防脑脊液外漏。 .动物神经功能评分:分别于治疗前、治疗后第、第、第和第 个时间点对每组的只小鼠进行动物神经功能评分钔,具体评分方法参照 级评分法们,在小鼠处死前进行神经功能缺损评分。级:无体征,记分;级: 动物不能完全伸直其前肢,记分;?级:动物一侧肢体瘫痪,有追尾现象,记 材料和方法 天津医科大学硕士学位论文 分;?级:动物不能站立/打滚,记分;?级:无自发性活动,有意识障碍,记 分‘铷。 . 、和在创伤灶边缘的表达:于治疗第每组各处死 只小鼠,取小鼠脑组织制备成石蜡切片后予以组织免疫荧光方法检测,将固 定好的 细胞用.%.处理 后,. 洗次,用%的羊血清? 封闭 ,加一抗兔抗:;山羊抗 /,冰箱中过夜。 用. 液洗遍,加标记的羊抗兔二抗和生物素化兔抗山羊二抗? , 孵育 ,再用.溶液洗次,加.:孵育 .溶液洗 ,染细胞核?,约,.溶液洗次, 然后用水溶性封片剂封片。其中抗体稀释比为:,稀释比为:, , 稀释比为:。组织原位凋亡检测时细胞用%多聚甲醛室温固定 依次用.%双氧水中和内源性过氧化物酶和.%柠檬酸钠 .处理, 加入/生物素混合液,。孵育 后加入亲和素一过氧化物酶工作液 ,然后用显色试剂盒显色每项操作前应用溶 ?孵育 液冲洗,同时设立对照用缓冲液代替/生物素混合液。按原位凋 亡检测试剂盒操作说明进行晗羽。 ..统计学处理:应用 .统计软件进行数据比较分析,数据以均数? 标准差表示,两组间比较用检验,多组间比较运用方差分析,.有统计学 意义。 记物,是内皮细胞标记物,和是造血干细胞标记物。通过多 种指标联合检测证实培养细胞为,符合实验要求,具体结果详见附录 图所示,为流式细胞仪检测表面特异标记蛋白的表达。 .分泌时相:在非转染基因的条件培养液中始 终维持较低含量的表达,但在转染的条件培养液中 含量持续增加,至第 后可基本稳定在一个较高水平,具体详见附录图所 示。 .脑创伤灶边缘、和的表达和原位凋亡检测:如 附录图.所示,所选区域均为脑创伤灶边缘部位,即干细胞移植部位。胞浆 绿色荧光为标记阳性细胞,红色荧光为标记细胞。附录图中显 示为在脑创伤灶边缘的表达情况,可见在对照组和单纯移植组 的表达程度均较低,二者间比较没有统计学差异.,但在 移植组创伤灶边缘可见大量阳性细胞,与对照组和单纯 移植组比较具有明显的统计学差异.。附录图中显示为神经 胶质细胞特征性标记蛋白在脑创伤灶边缘的表达,附录图中显示为神 经元特征性标记蛋白的表达。与对照组比较,移植组和 阳性细胞数均有所增加,但阳性细胞比例.%?.%明显大于 阳性细胞比例.%?.%。与此相比较,移植组阳性 细胞比例.%.%明显降低,同时阳性细胞比例.%?.% 增加。提示经基因转染的向神经元的分化潜能增强,同时向神 经胶质细胞的分化潜能减弱。附录图显示为创伤灶局部的细胞凋亡情况。可 结果 天津医科大学硕士学位论文 见移植组细胞凋亡数量..比对照组.?.明显减 少,而.移植组在创伤灶边缘凋亡细胞数量进一步减少,局部仅 见少量凋亡细胞.?.,与单纯移植组比较具有统计学差异 .。 .动物神经功能评分:如表所示,移植组在个检测时间 点动物神经功能均优于未接受干细胞移植组,而?师.移植组动物神 经功能进一步优于单纯移植组。各组间比较均具有统计学差异氏 .。 表实验动物神经功能缺损综合评分比较 ?与对照组比较.,?与组比较尸. 天津医科大学硕士学位论文 讨论 讨论 颅脑创伤病人术后存在神经组织修复以及神经功能恢复两大病理生理活 动,其中神经组织修复的结构基础是神经胶质细胞的增生和再生,而神经功能 恢复的结构基础是未损伤神经元的功能代偿和储存于室管膜下和海马旁回区域 的神经干细胞向神经元的分化。然而对于成年人和绝大部分未成年人而言,这 种功能代偿机制实际上都是极其有限的,这也是脑创伤病人术后运动功能障碍 长期存在得不到有效改善的重要因素。此外,大量胶质细胞的增生也成为癫痫 发作的潜在因素?。 近年来,干细胞移植为从根本上救治颅脑创伤病人,最佳化地提高运动神 经功能提供了可能。但大量研究证实,体内移植的各种干细胞在体内微环境诱 导下大多分化为神经胶质而非神经元,这在一定程度上限制了干细胞的应用船铂。 因此,能否良好地解决这一问题,将对干细胞移植恢复创伤神经功能方面产生 深远影响。有研究表明,可在一定程度上促进干细胞向神经元方向的分化 嘲。本研究我们应用先前在方面的研究平台啪刀,利用腺病毒载体将 转染进入,观察其在体内诱导干细胞向神经元和神经胶质细胞方向 的分化,及其恢复创伤神经功能的影响。 众所周知,脑源性神经营养因子. , 是神经生长因子家族成员,与神经系统发育有着密切关系,不仅对中枢神经元 的发育、增殖分化、存活起重要作用嘲,而且对损伤后神经元的修复与功能重 塑也起重要作用啪。广泛分布于中枢及周围神经系统,以海马和皮质含量 最高啪。研究表明可支持中脑多巴胺能神经元存活并向多巴胺能表型分 化,并且能保护多巴胺能神经元免受一羟多巴胺.的神经毒素作用曙?。 还可通过支持胆碱能细胞的生存和上调胆碱乙酰转移酶的表达,增强神经系统 的学习记忆作用啪;可减少钙离子内流、抗自由基损伤、抑制细胞凋亡等,从 而保护神经元免受脑缺血缺氧的损伤嘲 目前认为,是通过与其高亲和力受体而发挥作用泓。为一种 天津医科大学硕士学位论文 讨论 跨膜受体,具有胞外区、跨膜区和胞内区三个区域,其胞内区为受体酪氨酸激 酶区,配体与受体结合后,诱导受体二聚化,从而激活酪氨酸激酶。磷酸化的 酪氨酸与信号系统的其它分子结合,进一步使其它分子磷酸化,导致激酶瀑 布 效应从而激活整个信号传递系统汹’舶’。因此,在信号传递系统中,受 体酪氨酸磷酸化是整个系统的启动程序。受体有全长型和截短 型.两种亚型。二者配体结合区及跨膜区结构相同,但全长型受体含有 完整的受体酪氨酸激酶区,而截短型受体缺乏胞内受体酪氨酸激酶区,故它 不 能激活信号传导疆刀,汪志凌汹等通过实验得出外源性可能诱导表达 上调,而这种作用具有时间依从性。的细胞内信号传递途径主要有两条, 途径和途径。在大多数情况下途径是发挥作用 的优势途径啪川,但其具体途径目前尚不清楚。 孙春艳玎等研究显示人脐静脉内皮细胞、人脑血管内皮细胞等多种内皮细 胞以及新生血管平滑肌细胞均能产生,而且对血管内皮细胞的生长 发育起着重要的支持作用池’ 对体外人脐静脉内皮细胞的增殖有一定的 促进作用?, 作用后人脐静脉内皮细胞的存活细胞数为对照 / 组的.倍,但两者之间差异无统计学意义。还对人脐静脉内皮细胞体外 迁移产生影响:对人脐静脉内皮细胞体外迁移具有促进作用,作用 后迁移到膜下表面的细胞数明显增多耵。因此我们推测可能在一定程度上 参与了机体新生血管的形成。 本研究中我们将移植于动物脑创伤灶边缘位点主要基于两点考 虑:?创伤灶内缺血缺氧严重,大量毒性物质堆积,不利于在局部的 存活和生长分化;?脑创伤灶近缘尚存在一定数量的功能神经细胞,这些细 胞 的及时营养和有效救治是创伤后神经功能恢复的关键。 此外,为减少人源性进行动物体内移植后的免疫排斥反应,我们 选择去胸腺小鼠为干细胞移植对象。经过建立优良的液压脑创伤模型和稳定 的 干细胞移植环境,我们对脑创伤灶近缘的基因表达,神经元特征性标记讨论 天津医科大学硕士学位论文 蛋白,以及神经胶质细胞特征性标记蛋白进行定量检测,结果发现 在移植组的脑创伤灶边缘出现大量阳性细胞,但阳性细胞 极少,提示原位移植的在脑内微环境影响下绝大部分自发分化为神经 胶质细胞,而非神经元,这和国内外报道相符。 研究表明,在中枢神经系统中,只存在于神经元中,是一种神经 系统特异性蛋白质一,它主要存在于神经元细胞浆中,并且含量较高,大约 占人脑皮层烯醇化酶的%.%。屈洪艳等通过实验发现,当发生颅脑损 伤时,大量神经元细胞因受到创伤而损坏。被释放出细胞外,同时透过受 损的血脑屏障进人血循环,致血清中水平升高。颅脑损伤越重,死亡崩解 的神经元越多,脑屏障受损程度越高。神经元释放人血的越多,血清中 含量就越高咖’盯。 的鉴定依赖于巢蛋白是一种神经元中间丝蛋白?羽,其表达始 于神经胚形成时,当迁移基本完成,巢蛋白的表达量逐渐减少,并随分 化的完成停止表达。免疫组化证实均呈阳性。等旧鉴定出一 种结合蛋白即,可作为的标志物。对分离培养得到的 进行标记时发现,和呈双重阳性,且随着分化成为神经元, 二者的标记作用也消失,说明具有与相似的特异性和种间保守 性啷。和作为早期原始神经细胞的标志物已被广泛地应用于 的鉴定汹。 在.移植组脑创伤边缘我们检测到大量的表达,与 此同时,该位点存在大量阳性细胞和部分阳性细胞,与单纯 移植组比较,阳性细胞比例明显降低由.%?.%下降到.%? .%,同时阳性细胞比例明显增加由.%?.%上升到.%?.%, 提示通过基因的有效转染和表达,可促进向神经元的分化比例, 同时降低向神经胶质细胞的分化。此外,我们还观察到,在高表达位点, 细胞凋亡数量明显减少,同组动物运动神经功能评分优于低表达组对 天津医科大学硕士学位论文 讨论 照组和单纯移植组,提示可能通过促进干细胞向神经元的分 化比例,以及其自身对半损伤区域的神经细胞的营养作用,来共同促进实验 动 物的运动神经功能的恢复。 天津医科大学硕士学位论文 结论 结论 口 ?匕 通过对脐带间充质干细胞进行基因转染,可以增加干细胞向神经元而非 神经胶质细胞的分化比例,进而进一步提高干细胞恢复创伤后神经运动功能 的潜能, 加快脑创伤患者神经功能损伤恢复。 参考文献 天津医科大学硕士学位论文 参考文献 . 】 ,?. .,:. 】 ,..,:?. 【】吕璐璐,宋永平,魏旭东,等.人脐带和骨髓源间充质于细胞生物学特征的 对比研究.中国实验血液学杂志,,:. 【】范存刚,张庆俊,韩忠朝.人脐带间充质干细胞向神经细胞分化的研究. 中 华神经外科杂志,,:.. .,,,:?. 【】. 王金福,王立娟, ,等.骨髓间充质干细胞与造血干细 胞共培养对脐血造血干细胞扩增的作用.浙江大学学报理学版,, :?. 郭子宽,唐佩弦,刘晓丹,等.人骨髓来源的间充质干细胞体外支持造血 的研究.中国实验血液学杂志,,:. .【 】. ,,:?. 邱丽燕,王金福,沈丹,等.人骨髓间充质干细胞的扩增培养及向成软 骨样细胞的定向诱导分.浙江大学学报理学版,,:.】 , , , . .,,:. ., 】八 , . ,: 【 ,.【】. ,:. 】. , , , .】. ,,: 参考文献 天津医科大学硕士学位论文 一. 江红,张苏明,史庭慧,等.缺血性脑损伤中原代培养神经元凋亡的观 察.华中科技大学学报医学版,,:. 高进喜,王水良,王如密,等.小鼠液压脑损伤后一和基因的表 达分布.中华微侵袭神经外科杂志,,:?. , .【】 衲 . ,, :?. , , , , ..,,:.. 【 , , 】圮. ,,: . , , , . ? 】.,,:. 王敏忠,刘雪平,付庆喜,等.小鼠缓慢注射自体血脑出血模型的改良.中 风与神经疾病杂志,,:. 王虎,浦佩玉,王广秀,等.脑胶质瘤中、删与舯表达的研究. 中国精神神经疾病杂志,,:. . 】 :. . ,: 王宁,杨树源,赵均铭.小鼠骨髓间充质干细胞静脉移植治疗小鼠脑损伤. 中华神经医学杂志,,:. . 【】 , , , : . .,:., , .. 砒 ., 天津医科大学硕士学位论文 参考文献 :.. 孙洪涛,刘晓智,张赛.脐带间充质干细胞分离、鉴定与神经分化.中华 神经外科疾病研究杂志,,:. 张赛,刘振林,胡群亮,等.介导脐带间充质干细胞实现永生化的 研究.中华神经医学杂志,,:. 王海珍,刘呜,赵莘瑜,等.的克隆及/?重组表达载体 的构建.神经损伤与功能重建,,:. , , 【】 ,.、, 】. ,,:?. , .】. ?,,:. ,豇.】 】.,,:?..,】 】. ,,:?. ,, ,. 【】.?,,: .. 周晖,毛萌,李胜富等.脑源性神经营养因子对缺氧胚鼠脑皮质神经元 的保护作用.华西医科大学学报,,:. , . , . 一 ,,:. , 【 .: . , ,:?. , , ,. 盘 . ,,: 天津医科大学硕士学位论文 参考文献 ?. 汪志凌,毛萌,周晖,等.脑源性神经营养因子对缺氧胚脑神经元保护 作用的信号传递途径初探.四川大学学报医学版,,:. , , , .【】 ?饥 孕加 . . ,,: ?, . , 】 ,: . ,,:?. 孙春艳,胡豫,吴涛.脑源性神经营养因子对血管新生的作用.中华病理 学杂志.,:. , , 【】 , . , :“ ,,:. , , . . 【 .,:. , ;】 , ; . ,,: 洪岸,姚志彬,陈以慈,等.老年性学习记忆减退大鼠新皮质和海马结构 胆碱能纤维的定量研究.神经解剖学杂志,,:. .【】 . . ,,:. ,, . ,. ,,:. , ,, . 】 ., ,: .. 屈洪艳,彭翔,蔡润.颅脑损伤患者血清的含量变化及临床意义.中 天津医科大学硕士学位论文 参考文献 国临床神经外科杂志.,:. . 】 , ,】. ,,:. ,?, ,. . 】】.,,: .. .【】铋 , , .,,:?. .?一: 【 , . ?. , , : 黎靖宇,陈维平.神经干细胞的研究进展及前景展望.中华医学实践杂 志.,:一一. 朱晓峰.神经干细胞基础及应用.北京:科学出版社,,: ?. 天津医科大学硕士学位论文 发表论文和参加科研情况说明 发表论文和参加科研情况说明 王延民,孟艳丽,张赛.高压氧对重型颅脑创伤患者治疗作用的临床研究 . .天津医药,,:.附录 天津医科大学硕士学位论文 附录 图..%,阳性 天津医科大学硕士学位论文 附录 图..%,阳性 图..%,阳性附录 天津医科大学硕士学位论文 图..%,阴性 图..%,阴性附录 天津医科大学硕士学位论文 图..%,阴性天津医科大学硕士学位论文 附录 图.不同时间点细胞培养液中表达水平比较附录 天津医科大学硕士学位论文 一唧移组 对照组 移枇组 图.脑创伤灶边缘的表达检测标尺 注:对照组和单纯移植组的表达程度均较低,二者间比较没有统 计学差异.,移植组创伤灶边缘可见大量阳性细胞, 与对照组和单纯移植组比较具有明显的统计学差异. 耶一嫣移纽 对照组 『移植组 图.脑创伤灶边缘的表达检测标尺 注:与对照组比较,移植组阳性细胞数增加,阳性细胞比 例.%.%,移植组阳性细胞比例.%.%。天津医科大学硕士学位论文 附录 对照组 【移植组 盯一吣移组 图.脑创伤灶边缘的表达检测标尺岬 注:与对照组比较,移植组阳性细胞数增加,阳性细胞比 例.%士.%,移植组阳性细胞比例.%士.%。 对照组 移植组 ?煅移组 图.脑创伤灶边缘原位凋亡检测标尺 注:移植组细胞凋亡数量.士.比对照组.士.明显减 少,移植组创伤灶边缘凋亡细胞数量进一步减少,局部仅见少 量凋亡细胞..,与单纯移植组比较具有统计学差异.。综述 天津医科大学硕士学位论文 综述 皇不】尘 脑源性神经营养因子基本特性及临床应用研究进展 颅脑创伤及其预后是世界范围性课题,颅脑创伤占全身创伤发生率第二位,资 料显示它的致死率和致残率位居创伤的第一位。我国每年大约有万例颅脑创伤病 人,其中死亡人数约万人,颅脑创伤已成为发达国家儿童和青年人伤病致死的首 要因素。颅脑创伤病人通常存在意识丧失、运动神经功能障碍、记忆功能障碍和精 神功能异常。颅脑创伤本身以及颅脑创伤后遗症也越来越多地给我们人类造成身心 及经济上不可估量的损失。 神经损伤之后能否及时准确地进行受损神经元修复是神经功能恢复与否的 关 键。脑源性神经营养因子是目前继神经生长因子后发现的第二个神 经营养因子,众多研究表明,它在神经系统的发育、功能维持和神经元分化等诸多 方面起重要作用。目前国内外学者正积极研究内在特性,并进一步探索开发 用于临床神经损伤的康复治疗。 .脑源性神经营养因子来源、分布 .脑源性神经营养因子?师来源、分布:是由德国神经生物学家 及同事,于年首次从猪脑中分离纯化出的有促进神经生长活性的一种蛋 白质】。年,.等人用鼠探针和 方法分析发现,脑 内存在着的,证实了中枢神经可以合成瞌,主要分布在 大脑皮层、髓质、小脑、海马等中枢神经系统,另外在外周的心脏、肺、骨骼肌和 坐骨神经也检测到 的存在,。也存在于的上丘及周围组 织中。损伤后神经断端远侧部有较多的,提示雪旺氏细胞等支持细胞是应激状 态下周围神经组织增多的主要来源。此外,等证实,人类血小板中 也含有,对于神经损伤部位的周围感觉神经元再生提供了一个重要来源,研究 表明,它对于周围和中枢神经系统神经元的存活和发育均发挥重要作用。 . 分子量及分子结构:是一种碱性蛋白,分子量为.,等 电点为,因其来源于脑组织,并可维持鸡胚感觉神经元的体外存活、促使其神 经 元出芽而被命名哺。由.千克的猪脑中可提取该因子,其生物活力为. /.。有两种不同的前体形式,分别是长链和短链前体,目前已知短链 前体由个氨基酸组成阳】,研究发现与已知的神经生长因子结构上综述 天津医科大学硕士学位论文 有着极其相似的氨基酸序列及相互关联的生物学活性,表现为二者的肽链均 由大约 个氨基酸组成约有%%的氨基酸同源序列,其中的个恒定的半胱氨 酸残基可形成维持、生物活性所必需的三对二硫键。天然的以同 源二聚体的形式存在。平衡超离心研究,即使在蛋白浓度. 也没有单体发 现。的对二硫键于.、.、之间形成, 对的稳定和功能起重要作用。和盐酸胍变性研究其重折叠,分析得到 的一系列图谱、荧光图谱、图谱表明主要由.折叠和无规级结 构组成。亚基之间通过疏水性相互作用强烈结合。 由此我们提出,与同为一个基因家族,并与后来以技术鉴定 克隆出的、.和一起被统称为“神经营养素家族”一。以载体克隆 法对人全长基因产物克隆及基因序列分析显示,人基因全长共 ,起始密码子为,终止密码子为阳。所诱导的突触增强作用 由介导的门控系统来调节。基因定位于号染色体的近端短臂上, 为单拷贝基因。从人和猪的资料可知属于单一外显子结构,不被内含子分割。 而小鼠的基因上游有个启动子、个外显子,调节不同组织、不同细胞群 的基因表达。人的基因编码的前体蛋白含有个氨基酸残基,氨基酸顺序 分析表明信号肽部分第位之间有一个潜在的.糖基化位点和一个位于 之后的二元化切点 ,在该处切开,产生一个由个氨 基酸残基组成的分泌型成熟多肽,等电点.。相当保守,在人、猪、鼠中 成熟蛋白的氨基酸顺序完全相同,尽管编码的核苷酸顺序有些差异 .基本生物学特性 . 的基本特性:神经元的生长必须有来自靶组织的营养因子的支持, 限制这些因子的产生,将使那些生长到错误靶组织或在靶组织错误定位的多余神经 元突触和轴突因得不到足够的营养因子而退化?。在系统发育中,靶源性的神经营 养因子能够控制中枢神经系统相互联系的神经元的数量幻,促进神经元的成熟,促 进神经递质的选择和转换过程中的酶系发育促使错误联系的神经元退化、死亡, 在神经系统的发育生长、功能维持和神经元群的成形性上起着重要作用们。 .促进胚胎神经元分化成多巴胺能神经元,维持能神经元存活:对 研究较多的是它在阿尔茨海默病病理改变和在帕金森病中的 神经元保护效应及对病理行为的改善作用。和等分别认为,是 一种允许特殊神经元存活的因子,它可刺激胆碱能神经元的存活和分化、增加多巴综述 天津医科大学硕士学位论文 胺摄取活性。在中,对基底胆碱能神经元、能神经元、中脑 黑质能神经元均有营养作用,在中脑黑质能神经元的发育过程中起重要作 用。发育中的,其早期神经元在不同发展阶段总会产生相应的神经递质类型及 其受体,周围环境如化学、体液和细胞间的相互作用等可决定发育过程中神经元 选择表现型。将 /加入种植培养的胚鼠大脑皮质细胞,可见到 分泌酪氨酸羟化酶的培养细胞增加迅速,表明神经递质可通过自身调节和相互间作 用来调节未成熟神经元对神经递质类型的选择,而对多种胚胎神经元的发育 既有多方面的作用,又有一定的选择作用,可以说是中枢多巴胺能神经元存 活、生长和分化中的关键因素之一。.等胡在关于、对模型鼠脑 移植区胆碱能神经元发育生长调控的研究中发现,和一样,能促进 模型鼠行为改善和移植区胚胆碱能神经元的发育生长;若对胚脑移植分别加用 、以及、并以单纯胚脑移植对照作脑功能改善效应结果的比 较分析,发现和联合使用比单独使用一种因子更为有效。等副 以实验表明,构建表达载体,用脂质体方法转染细胞、 抗体免疫组化方法检测可见有在细胞中表达,所表达的蛋白 分泌至胞外并促进脑黑质细胞的发育、生长、存活和分化。以基因疗法治疗 病发现,还能促进轴突生长、防止能神经元退化?。。 .提高神经元的生物活性,减少损伤后神经元的自然死亡:神经损伤后,影 响再生的因素除局部及靶器官的某些反应产物外,邻近非神经元细胞、传入 纤维的 末梢及远近组织所释放的激素、营养物质、代谢产物等,均可通过局部扩散 或血液 循环到达损伤部位,影响神经再生过程。 不但对多种神经元的发育分化和生长再生具有维持和促进作用,也能通 过为损伤神经元提供营养而挽救损伤的运动神经元和感觉神经元。等副 提出,是的一种由去甲肾上腺素能神经元合成的顺行性神经营养因子。 为了检测的功能重要性,实验中以多巴胺羟化酶作为去甲肾上腺素 酪氨酸激酶活 能神经元的标记物,分析了携带有.基因转基因鼠的 性。发现在.转基因鼠去甲肾上腺素能神经元中的合成增加,可 酪氨酸激酶活性,对新 以提高生后小鼠的新皮质这一去甲肾上腺素能靶区的 生鼠的面神经这一第二个去甲肾上腺素能靶区进行了功能检测,以进一步证 实去甲肾上腺素能神经元表达的顺行性地调节着神经元的存活,发现若同时 使对照组及转基因组的新生鼠面神经损伤,周后,对照组小鼠的面神经神经 元有综述 天津医科大学硕士学位论文 %缺失,而在.转基因鼠中,去甲肾上腺素能神经元的缺失仅为%~ 、致靶神经元存 %。表明由去甲肾上腺素能神经元分泌并激活靶区的 活和分化,即存在有自去甲肾上腺素能神经元向其纤维及其末梢的顺行性转 运,并 通过对受损伤神经元提供营养而挽救受损伤的神经元。 对于感觉神经元,与亦有协同营养作用,即感觉神经元通过中枢突 获得而通过背根节的周围突获得。在体外实验中,可通过减少神 经元死亡而非促进增殖这一营养方式来维持游离种植的鸡胚感觉神经元存 活并促 使其轴突生长。除了营养发育早期的感觉神经元,也经营养因子受体 来介导对成熟感觉神经元的营养作用。 . 的其它活性:能维持前庭神经核、三叉神经感觉神经元的功 能及胚胎视网膜神经节细胞的存活口。的这种功能具有选择性,应用其同家 族的则未发现类似功能。以分子生物学手段实验性破坏基因致使缺失, 发现前庭神经核及三叉神经节的体积分别缩小%及%,动物尚有运动及平衡失 调 出现。 . 发挥作用的受体 神经细胞表面存在两类受体,一类是低亲和力受体,为相对分子质量约 为 的跨膜蛋白,它可与神经营养素家族所有的因子结合;第二类受体属 ,,包括、和, 于酪氨酸蛋白激酶 其中与亲和力最大,是主要的功能性受体。不仅在神经 系统发育过程中维持神经元的功能,而且在神经元损伤后的再生修复以及防 止神经 细胞退行性变等诸多方面发挥作用。 .与外伤性脑损伤 能保护中枢神经元、修复脑损伤 .外伤性脑损伤后的表达: 灶,同时脑损伤后 表达增加,其特异的功能受体表达亦见增多, 且时空分布与 相对应,从而扩大了的功效在海马结构中, 在对损伤相对耐受的齿状回、皮层及海马区表达增加明显,而在 表达的调节只在特定的细胞群产生, 区则无表达增加。脑损伤后 说明各个脑区神经元调节 表达的潜力不同。最近的研究认为基因的改 变可以影响的表达,通过改变等位基因,可以增强的表达功能, 有利于脑损伤的恢复乜?。在海马回的亚区对冲击性脑外伤高度敏感,其敏 感程 度与年龄有关,而其基因表达的改变导致表达降低是老年人大脑更易损伤的 综述 天津医科大学硕士学位论文 潜在机制胁】。近年的研究表明,锻炼、年龄、饮食等外部因素也可引起表达 的改变。等豳发现,外伤性脑损伤后,推迟进行功能锻炼,有助于 增量调节;而伤后即进行锻炼,则会降低的表达,有可能推迟损伤愈合。在 对不同年龄的小鼠脑损伤模型的研究中,等?们在相同程度脑损伤后于相同 的 时间点测定其含量,得出小鼠年龄越大,其脑内的含量越低,愈合 的状况越差的结果。脑损伤后,不同性别的表达的空间区域也不完全相同昭盯。 饮食中过多的饱和脂肪酸.也能降低的水平,从而降低海马回 的可塑性和加重认知功能的损害汹一。所以,与其受体在细胞分布上的一致 性表达上调可抵御神经元损伤,而降低的表达,则会减弱神经元对损伤的抵抗, 并降低受损神经元自我修复、增生,移行的功能。同时的表达受多种内部和 外部因素的影响,与损伤程度和损伤时间具有一定的量效关系。同等程度损伤后, 各脑区 表达到最大量的时间不同,而不同程度的损伤,在相同的时间 点的表达量也不一样。等在对小鼠冲击性脑损伤模型研究中发现, 大脑海马回的的表达量与损伤程度和损伤时间具有相关性。脑损伤后 的表达增加是神经元对脑损伤的自身保护。在对对视神经损伤的保护 作用的研究中也发现,如在视神经损伤前有持续一段时间的脑损伤,则会提高视网 膜神经节细胞对损伤的耐受,而这种神经保护作用与视网膜的表达无关”引。 另有研究表明:若事先遭受过较轻损伤刺激的神经元在面临相继而来的非致死性较 严重的损伤时,可显示出较强的耐受性。以往人们认为这种损伤耐受性可能是事先 的刺激提高了热休克蛋白的水平,进而发挥神经保护作用,但目前的证据不支持这 种假说曲钊,而认为是相关主导作用啪。因为这种预先刺激在相继而来的较 重刺激之前,已经诱导了在脑内易损区的表达增加。 关于脑损伤后引起神经元死亡的机制 .外伤性脑损伤后的作用机制: 还未确定,但谷氨酸细胞毒性及细胞内钙超载假说正为人们所接受。具有谷氨酸受 体的神经元,对脑损伤的刺激特别敏感,如海马区锥体神经元和基底节神经元 富含受体,因此特别容易遭受继发损伤。谷氨酸受体激活通过细胞膜配体门 控性和电压依从性离子通道,促进日流导致神经元损伤和死亡。细胞内钙的增 加可诱导蛋白激酶的过分激活及自由基的形成增加,继而损伤神经元,阻止细胞内 钙的增加以及减少自由基的生成,都能保护神经元抵御损伤。可使培养的海 马神经元内的钙结合蛋白 及的含量增加,这种钙结合蛋 白能使细胞内超量的排出,维持细胞内钙稳定,从而保护神经元抵御损伤?。