HPLC法测定复方氨基酸注射液 (18AA)中氨基酸含量

HPLC法测定复方氨基酸注射液 (18AA)中氨基酸含量 鲍恩泉(巢湖市药品检验所 巢湖 238000) 摘要 目的:建立HPLC法测定复方氨基酸注射液(18AA)中各种氨基酸含量方法及测定厂家18AA制剂中氨基酸的含量。 方法:氨基酸采用柱前衍生后用HPLC法测定;色谱柱:Agela Technologies C18(4.6mm×250 mm，5μm);流动相:A相:1mol/L乙酸钠水溶液(冰乙酸 -1调节pH至6.0)，B相:50%乙腈;梯度洗脱;流速:1.0 ml?min;检测波长:360 nm;柱温:27?;进样量:20 μl。结果与结论:各种氨基酸的线性、稳定性、重复性和准确性均符合方法学要求。 关键词:HPLC;复方氨基酸注射液(18AA);梯度洗脱;含量测定 复方氨基酸注射液(18AA)是一种复方氨基酸注射液 ，它们是构成蛋白质的主要成分，在医学上广泛用于治疗各种疾病 ，特别是复方氨基酸注射液作为营养药品，应用日益广泛。其氨基酸种类多;必需氨基酸含量高;支链氨基酸含量丰富;含一定量胱氨酸、酪氨酸及较高含量的精氨酸;我们建立了一种柱前衍生化后利用HPLC法测定复方氨基酸注射液(18AA)中各种氨基酸含量的测定方法，选用了新的流动相成分和比例，对影响分离的诸因素做优化试验。通过试验，明确了各因素对不同的氨基酸保留时间的影响，优选出了最佳分离条件，使得各氨基酸的分离度符合要求、重现性稳定，定量结果令人满意。 1 实验材料 1.1 供试品 安徽丰原药业股份有限公司,复方氨基酸注射液(18AA)3批,批号:09082931、09082821、09081521 1.2 仪器 Agilent 1200全自动进样高效液相色谱仪;梅特勒-托利多AL204电子天平;Jl-120超声波清洗器。 1.2 试剂 氨基酸对照品(中国药品生物制品检定所，批号:140624-200805);乙腈为进口色谱纯;水为重蒸馏水;其他化学试剂均为分析纯;2，4一二硝基氟苯(DNFB)为生化试剂(经减压重蒸馏)。 2 方法与结果 1 2.1 色谱条件 色谱柱:Agela Technologies C18(4.6mm×250 mm，5μm);流动相A相:1mol/L乙酸 -1钠水溶液(冰乙酸调节pH至6.0)B相:50%乙腈;梯度洗脱:见表1;流速:1.0 ml?min;检测波长:360nm;进样量:20μl;柱温:27?。 表1 梯度洗脱表 序号 时间(min) 流动相A(%) 流动相B(%) 1 0.00 71.0 29.0 2 5.00 65.0 35.0 3 10.00 57.0 43.0 4 11.00 51.0 49.0 5 15.00 45.0 55.0 6 20.00 35.0 65.0 7 25.00 25.0 75.0 8 30.00 2.0 98.0 9 35.00 2.0 98.0 10 36.00 60.0 40.0 11 37.00 60.0 40.0 12 44.00 71.0 29.0 2.2 供试样品和对照品及空白溶液的制备 对照品溶液的制备 按样品处方配置，精密称取对照品适量，加水适量超声溶解。再精密量取1ml置10ml量瓶中，依次加入0.05mol/l的碳酸氢钠溶液1ml和1%2-4二硝基氟苯1ml，放入60?水浴中1小时，取出，冷却置室温，再用水稀释至刻度，摇匀。作为对照品溶液，进样前用0.45μm微孔滤膜过滤。 供试品溶液的制备:精密量取本品2ml，分别置200ml量瓶中，充分摇匀，再精密量取1ml置10ml量瓶中，依次加入0.05mol/l的碳酸氢钠溶液1ml和1%2-4二硝基氟苯1ml，放入60?水浴中1小时，取出，冷却置室温，再用水稀释至刻度，摇匀。作为供试品溶液，进样前用0.45 μm微孔滤膜过滤。 空白溶液的制备 按处方称取除氨基酸外其它组分，按供试品溶液制备方法制备，作为空白溶液。 3. 结果 3.1 辅料与衍生化试剂的干扰 分别吸取对照品溶液、供试品溶液及空白溶液20 μl在HPLC上进样分析，记录色谱图，见图1。各成分分离均符合要求，各氨基酸的理论板数均大于30000，阴性样品供试液无干 2 扰。 A B C 图1.氨基酸对照品(A)，供试品(B)，空白(C)的色谱图 3.2标准曲线的制备 吸取“2.2”项下对照品溶液，5μl、10μl、20μl、50μl、100μl分别进样分析，记录色谱图。以峰面积y对进样量x (μg)进行线性回归得各种氨基酸的线性回归方程，由结果可见各氨基酸在含量测定浓度范围内，蜂面积与进样量呈良好线性关系，线性回归方程表见表2。 表2 线性回归方程 序号 氨基酸名称 线性回归方程 r 1 L-谷氨酸 y=0.02532x-0.03215 0.9991 2 L-脯氨酸 y=0.01824x+0.08532 0.9995 3 L-丝氨酸 y=0.02732x-0.04524 0.9996 4 L-苯丙氨酸 y=0.03528x+0.10252 0.9978 5 L-亮氨酸 y=0.02497x+0.01461 0.9997 6 L-颉氨酸 y=0.01803x+0.02897 0.9999 7 L-门冬氨酸 y=0.03290x-0.00691 0.9998 8 L-异亮氨酸 y=0.02405x-0.01541 0.9998 3 9 L-赖氨酸盐酸盐 y=0.0200x-0.01012 0.9999 10 L-精氨酸 y=0.02253x+0.02136 0.9999 11 L-苏氨酸 y=0.02235x+0.08525 0.9992 12 L-蛋氨酸 y=0.01311x+0.06325 0.9989 13 L-组氨酸 y=0.01939x-0.00231 0.9981 14 甘氨酸 y=0.01568x-0.00256 0.9999 15 L-丙氨酸 y=0.03258x+0.03292 0.9992 16 L-酪氨酸 y=0.02361x+0.0122 0.9982 3.3 精密度试验 精密吸取对照品溶液20μl，重复进样分析5次，记录色谱图。测得各氨基酸峰面积的RSD在0.1,1.2%之间(见表2)，表明进样精密度较好。 表3 精密度试验 峰面积 名称 RSD 1 2 3 4 5 614.077 613.323 613.683 614.290 614.832 0.1% L-脯氨酸 670.684 669.717 670.369 670.301 670.110 0.1% L-谷氨酸 573.472 572.894 573.272 573.581 574.153 0.2% L-丝氨酸 466.402 466.680 467.145 467.764 467.975 0.2% L-亮氨酸 325.135 325.437 326.086 326.510 326.501 0.2% L-异亮氨酸 435.340 434.844 435.106 435.288 435.680 0.1% L-缬氨酸 375.664 376.224 377.073 376.688 376.753 0.2% L-门冬氨酸 564.699 564.324 564.945 565.336 565.343 0.1% L-苯丙氨酸 595.248 594.205 594.343 596.343 596.675 0.2% L-赖氨酸醋酸盐 156.592 156.426 156.426 156.371 156.219 0.1% L-蛋氨酸 429.354 429.038 429.500 429.763 429.837 0.1% L-丙氨酸 125.600 125.891 126.989 128.262 128.882 1.2% L-组氨酸盐酸盐 221.080 221.030 221.329 221.358 224.753 0.2% L-精氨酸 303.747 303.461 303.862 304.030 304.091 0.1% L-苏氨酸 336.439 336.715 336.850 337.065 337.082 0.1% 甘氨酸 37.840 38.223 32.053 38.485 38.921 1.1% L-酪氨酸 3.4 衍生物稳定性试验 取安徽丰原药业股份有限公司生产的复方氨基酸注射液(18AA)(批号:09082931)样品，经“2.2”项下处理后，分别在制备后0、3、9、12、24、48 h进样测定，记录色谱图。结果各氨基酸峰面积的RSD均小于2.0%，表明溶液在48h内稳定。 3.5 重复性试验 取安徽丰原药业股份有限公司生产的复方氨基酸注射液(18AA)(批号:09082931)，按 4 “2.2”项下处理制备5份，在上述色谱条件下测定，记录色谱图，按标准曲线法计算供试品中各氨基酸的含量。测得其含量的RSD在0.8%,1.8%之间，表明方法重复性合格。 3.6 加样回收试验 取已知含量的安徽丰原药业股份有限公司复方氨基酸注射液(18AA)(批号:09082931)，精密量取25ml，置100ml量瓶中，分别精密加入“2.2”项下氨基酸对照品溶液2ml，按“2.2”项下处理，进样20μl，记录色谱图，以平均峰面积按标准曲线法计算，测得各氨基酸回收率(n=6)均在97.5%,102.3%，RSD不大于2.0% 3.7 样品的测定 取安徽丰原药业股份有限公司生产的复方氨基酸注射液(18AA)的3批样品，分别按“2.2”项下制备三份供试液，分别按“2.1”项下条件进样分析两次，记录色谱图，以平均峰面积按标准曲线法计算样品中氨基酸含量，测定图谱见图2。各氨基酸含量均为标示量的82.2%,116.5%。 图2 (按保留时间顺序，各氨基酸分别为 1.门冬氨酸 2.谷氨酸 3.丝氨酸 4.精氨酸 5.甘氨酸 6.苏氨酸 7.脯氨酸 8.丙氨酸 9.缬氨酸 10.蛋氨酸 11.异亮氨酸 12.亮氨酸 13.苯丙氨酸 14.组氨酸 15.赖氨酸盐酸盐 16.酪氨酸) 4. 讨论 4.1 衍生化试剂和氨基酸的用量 衍生化试剂和总氨基酸的摩尔浓度比约大于4:1，且衍生化试剂的进样总浓度应不高 -1于1mg.ml，否则可能出现衍生化不完全或者干扰基线，对分析结果造成不利影响。 4.2 L-色氨酸含量测定 色氨酸本身就有紫外吸收，且可能与衍生化试剂反应后发生淬灭现象而无吸收，所以色氨酸的测定采用直接紫外分光光度法。 5 4.3 系统分离效能 采用本系统进行检测时，各组分均能达到完全有效的分离，其中，控制在较低温度使得苯丙氨酸与组氨酸达到良好的分离，其中在试验时发现，由于一次分离较多的成分，所以对色谱柱的分离效能要求比较高 4.4 柱温的选择:柱温对氨基酸的分离度有明显的影响，其中对较难分离苯丙氨酸和组氨酸的分离度影响较大。在低温条件下，苯丙氨酸和组氨酸的分离度较好;随温度升高，苯丙氨酸和组氨酸的分离度明显下降，所以我们在低温(27?)进行系统实验，通过调节梯度洗脱的程序来使复方氨基酸注射液中各成分均有效分离，达到中国药典的要求。 参考文献 1 .陈娅兰，付宜和，王国林等(十八种氨基酸注射液的HPLC 2，4一硝基氟苯柱前衍生化法 含量测定(药物分析杂志，1990，10(3):149 . 2.白新桂(数据分析与试验优化 设计 领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计 (第二版,北京,清华大学出版社，1986(188. 3. 中国药典(2000(二部:附录:174. 4 .倪维芳，金 瓯，张劲松(HPLC法测定复合氨基酸胶囊中氨基酸的含量[J](药物分析杂 志，2004，24(4):402( 5. 聂小春等(柱前衍生化HPLC法测定复方氨基酸崩剂的应用研究.药物分析杂志,1996，(5). 6