免疫磁珠法纯化B淋巴细胞的研究

免疫磁珠法纯化B淋巴细胞的研究 8刘岂,金怕泉,董邦权,等.上海免疫学杂志1993; 18:362 9路秀薹.国外医学免疫学丹册1993;16:183 10:范祖森.上海免疫学杂志1995;15:124 11BrennanFM,ZachariaeCC,ChantryD,etal EurJImmunol1990;20:214I I2DjeUJY.MatsushimaK,OppenheimJ,etalJ Immunol199~;144:2205 (1995年I1月14目收穑,1996年1月10日修回】 EffectsofIL-IOontheSecretionofIL-8byPeritonealMacrophages andSplenicLymphocytesinAARats FanZusenCaoRonghuaSunWenshengZhangQingylnMaDalong YuanYong ShandongMedicalUniversity,Jinan250012 Inthispaper.westudiedtheeffehtsofIL.10onIL?8productionfromperitoneal macrophagesandspleniclymphocytesinAArats.aswellasitstherapeuticeffecton AAratsbyperitonealinjection.Themechanismofactionwasinvestigatedpre? liminari]ywithmolecularhybridization.Experimentalresultsshowedthatpe ritone? almacrophagesandspleniclymphocytesinAAratscouldsecretemoresubstantial Ilr8thanthatnormal’S.IL?10couldsignificantlyinhibitedIL-8productionin pe tonealmacrophagesandspleniclymphocytes.IL?1OalsoamelioratedAAsymptoms inrats.Theabiliwtosynthes~eIL?8wasevidentlydecreasedaftertreatmentIL?10 coulddramaticallydown.regulatedIL.8mRNAexpressionfromperitonealmacro? phagesinnormalrats.Inconclusion.IL?10couldsignificantlyinhibitIL?8produc? tioninvitroandinvivowitheffectiveanti-inflammatoryactivity,thusprovidinga newagentfortreatmentofhumanrheumatoidarthritis(RA). KeywordsIL?10ratadjuvantarthritisimmunoregulation nucleicacidhybridization (上接第236页) 与抗原提呈细胞和辅助T细胞传递的抗原 结合后,SmIg发生交联,SmIg和抗原复合 物进人B淋巴细胞(内在化).由此休止B淋 巴细胞便发生自身活化,增殖和分化.Jel nek等认为小而休止的B淋巴细胞必须经 过抗原(有MHC约束性)激活后,才能从休 止的B淋巴细胞进人活化的B淋巴细胞: 活化的B淋巴细胞在各种淋巴因子存在时 促进增殖,分化成熟为抗体形成细脉本文 的实验结果验证了:anti.具有活化B淋巴 细胞的功能.说明分离纯化本身不影向B淋 巴细胞的增殖分化能力.’ 参考文献 1.曹雪涛,吴祖泽.中华血液学杂志1995;16:207 2.朱炳法.国外医学免疫学丹册1989:12:245 3.Ush~imaH,HonmaH,etalJVirolMe? thods299~;29:23 (1995年9月25日收稿,1995年I2月25日修回) 《}一协钜痉学杂志1996’L6珏4 转一?; 免疫磁珠法譬化B淋巴细胞的研究,J 茎—韭朱亚忠应大明 摘要应用CDI9单克隆抗体包被喑与多聚苯己烯礁球t特异性行)?并逝殊4.’集他IMPc一1)收尝细胞,纯 化B淋巴细胞26例,得到高纯度的岳淋岂纲胞,H=-簌褂较.j咆?l半 直Hjal~tiu激i.r比,证明本 刘量’雌豫施外关键词苎竺里苎壁’三.!烫j磊I 本文用可与B淋巴细胞表面CD19抗 原特异性结合的IgM单克隆抗体包被的多 聚苯乙烯磁珠一DynabeandsM.450Pan.B (CD19),经阳性选择分离纯化了26名正常 人外周血中的B淋巴细胞,并探讨了分离纯 化后的B淋巴细胞增殖活性. 1材料和方法 1.1主要试剂殛仪器CD19单克隆抗体 包被的多聚苯乙烯磁珠:DynabeadaM_450 Pan?B(CD19);磁性微粒收集仪(Magnetic ParticConcentrator,MPC.1);羊抗人 1gM【GoatantiHuman.IgM(anti?u)】;各 种细胞因子_(BCGF,IL_1,2,3,4,5,6,IF’N. ,B,丫,TNFB,TGF-BSCF);CO.孵育箱 ;流式细胞仪(FACScan). 1.2,卜掏血单个棱细胞(PBMNC)分离 采用常规的Fieoll密度梯度离心法. l-3B淋巴细胞的分离按1的比例,将 分离得到的PBMNC与CD19单克隆抗体 包梭的多聚苯乙烯磁珠混合加入试管中.置 4”C冰箱温育30min(孵育过程中应轻轻振 荡);再置MPC?1磁性镦粒收集仪上,使CD 19细胞与CD19一细胞分开,然后弃掉试管 内eD19一细胞,并用PBS缓冲液洗涤,最 后收集紧贴管壁盼已与CD19单克隆抗体 奉课 题 快递公司问题件快递公司问题件货款处理关于圆的周长面积重点题型关于解方程组的题及答案关于南海问题 由国家自然科学基金资助 包被的多聚苯己烯磁珠结合的CD19B淋 巴细胞. 1.4磁珠的洗脱用5ml含5%FCS的 RPMI1640培养液与结合有磁珠的CD19一 B什术巴细胞混合,置37?,5%(v/v)CO温育 过夜,使磁珠从B淋巴细胞上脱落下来,然 后再用MPC.1磁性微粒收集仪贴壁分离磁 珠,并收集悬液中的CD19B淋巴细胞. 1.5B淋巴细胞纯度,活力及回收率 1.5.1细胞纯度及回收率分别在用CD19 单克隆抗体包被的多聚苯乙烯磁珠分离前 后,采用单克隆抗体直接免疫荧光法,经 FACScan检测细胞CDl9及CD3抗原表 达百分率,计算出B淋巴细胞纯度及回收 率. 1.5一细胞活力采用常规的台盼蓝染色 法计算活细胞数. 1.6分离纯化的B淋巴细胞增殖的测定 将用CD19单克隆抗体包被的多聚苯乙烯 磁珠分离纯化的B淋巴细胞调成1×10./ml 细胞悬液,并分成四组:?单独B淋巴细胞 组:?B淋巴细胞+细胞因子组:?B淋巴 细胞+anti.组:?B淋巴细胞+anti.” +细胞因子组.然后置37?,5%(v/v)CO 孵育箱中培养72h,蔽闪测定细胞增殖情 况. ?236? 2结果 z?1B淋巴细胞的纯度回收率及活力 2.1.1B淋巴细胞的纯度及回收率在胃 CD19单克隆抗体包被的多聚苯乙烯磁珠分 离前一CD19细胞为11.1413.00%.CDI9 兰田胞占88.86+-2.60%;CD19细胞为95.00 ?5.20%,CDI9细胞仅占5.o0?520%,B 缅胞的回收率为58.7?239% 21.2B淋巴细胞活力用台盼蓝染色分 anc?5Hg+IL7tO00U antBpB+BCGF10% T口P0U abtilI5+t0B日lou I-T1~DO1.r 如E+]FN’1D00~J 【PNlOO~J ‘由’f+J娜m咖 BblI+[FNt000~I 图1B细胞对各种淋巴固r的 3讨论 忻活细胞数超过98% 2.2B淋巴细胞的增殖能力纯化后的B 细胞单独孵育时未见增殖反应;但加八各种 细胞(除BCGF有部份增殖反应)后均 末观察到B细胞的增殖反应经用anti. u 刺激后呈现不同的增殖反应;其中以加人 BCGF的增殖最为明显,增殖指数是4. 2,其 他如IL.1l2,3,4,6,IFNpTNF6 也均有增殖反应,增殖指数是1. 59--2.61,唯 TGF—p无增殖与文献报道符台,见(圈1) 在免疫学研究中,T,B淋巴细胞的分离 纯化是最常用的技术之一.目前常用的尼龙 毛法或羊红细胞玫瑰花形成试验等方法分 离纯化T,B淋巴细胞,方法较为复杂,用流 式细胞仪(FACS)分离纯化T,B淋巴细胞, 价格昂贵,且程序也繁杂,不易推广.本文介 绍的方法特点是降低了非特异性结台,快速 高效且易自动解离,收集到的B细胞未见自 发增殖现象,不致影响细胞功能,从而可使 所需的细胞纯化富集达到理想的效果,可与 流式细胞仪纯化得到的细胞比拟.本法分 离纯化到的B淋巴细胞比分离前提高约8,6 倍,B淋巴细胞的回收率达到58.7?23.9%, 且活细胞数高达98%. 本文所用的CDI9磁珠是购自Dynal 公司.但也可自行制备, 步骤 新产品开发流程的步骤课题研究的五个步骤成本核算步骤微型课题研究步骤数控铣床操作步骤 如下:磁珠的抗 体记:将需标记的抗体纯化后的IgG部份用 0.5toolpH9.5的硼酸溶液溶解,使蛋白含量 为150pg/ml然后将直径为4.5pM的多聚苯 乙烯磁珠加入抗体中(30mg/m1)将此混台 物放人22?温育24h,(在孵育过程将瓶的 一 端向另一端缓慢地不断的旋转)然后将此 磁珠洗涤3次,每次10rain,接着1次洗30 milx,最后放在含0.1%牛血清白蛋白,0.01 mol/L的PBS5ml中在4?过夜,再用磁珠 收集仪收集磁珠,磁珠:PBS,BSA:Ig的最 后比例应该是60mg:2ml:3001~g. B淋巴细胞表面膜免疫球蛋白(Smlg) (下特第220页)