慢病毒介导RNA干扰Sez6对小鼠小脑切片培养浦肯野细胞发育影响

慢病毒介导RNA干扰Sez6对小鼠小脑切片培养浦肯野细胞发育影响 同济大学医学院 硕士学位 论文 政研论文下载论文大学下载论文大学下载关于长拳的论文浙大论文封面下载 慢病毒介导RNA干扰Sez6对小鼠小脑切片培养浦肯野细胞发育影 响 姓名:李卓权 申请学位级别:硕士 专业:人体解剖与组织胚胎学 指导教师:张军 20090501 摘要 摘要目的在体外筛选高效率干扰小鼠,,,,基因表达的,,,,,片段，将高效,,,,,包装到慢病毒载体中，构建,,,,,,,,,慢病毒系统。 检测 工程第三方检测合同工程防雷检测合同植筋拉拔检测方案传感器技术课后答案检测机构通用要求培训 ,,,,基因在,,种不同组织来源的人肿瘤细胞中的表达情况，探讨,,,,基因与肿瘤细胞之间的关系，为进一步研究,,,,基因的生物学功能提供理论依据。研究干扰小鼠小脑中,,,,表达后，。小脑浦肯野细胞树突的生长发育与胞体的排列变化，阐述,,,,基因表达在小鼠小脑浦肯野细胞生长发育过程中的作用。方法针对,,,,基因组第二外显子设计合成不同的,,,,,片段，构建,,,,,,;,,,,,,,,,,,干扰质粒;同时构建,,,,第二外显子融合蛋白,,,,,,,,,,重组子，干扰质粒与重组子在体外进行共转染,，,,,,细胞，筛选出高效率干扰,,,,基因表达的,,,,,片段。构建,,,,第二外显子融合蛋白,,,,,,,,,,重组子慢病毒系统，转染,,,,,,细胞培养稳定表达融合蛋白,,,,,,,,,,的,,,,,,,,,,,细胞株。挑选最高效率的,,,,,片段，构建;,,,,,,,,,,,,,,质粒。体外培养,,种不同组织来源的人肿瘤细胞，抽提总,,,，运用,,(,,,检测,,,,基因的表达情况。建立小鼠小脑组织切片体外培养模型。应用构建成功的;,,,,,,,,,,,,,,质粒，建立,,,,,,,,,慢病毒系统，感染切片培养的,,小鼠小脑，干扰小脑组织切片神经细胞,,,,基因表达。结果流式细胞术检测，筛选出干扰抑制效率达,,(,,的,,,,,片段;,,,,,,、,,,,,,,,,,,检测证实，;,,,,,,,,,,,,,,质粒构建成功。,,,,在肿瘤细胞,,,,、,,,,,、,,,(,,、,,,,,、,,, ,,,、,,,,、,,,,,、,,,,、,,,,(,,,、,,,,,、,,,(,,(,,,中表达，其中，在,,,,,、,,,,,、,,,,、,,,,(,,,、,,,,,及,,,(,,(,,,细胞系中高表达，与阳性对照组无差异。在高转移性肿瘤细胞,,,,(,,,、,,,,,、,,,—,,(,,,、,,,,,和,,,(,,中,,,,高表达，与低转移性肿瘤细胞有显著性差异(尸(，,(,,)。慢病毒系统;,,,,,,,,,,,,,,转染体外培养小鼠小脑组织切片后，观察到组织切片中浦肯野细胞生长发育变化:树突发育延后，分支数量减少，长度缩短 (,,,(,,);浦肯野细胞胞体排列不整齐。结论建立高效的,,,,,,,,,慢病毒系统，这为进一步应用慢病毒转染组织和动物活体打下基础。,,,,基因在部分肿瘤细胞中表达，并在高转移性肿瘤细胞中高表达，提示,,,,基因可能并与肿 摘要瘤的转移有关。在小鼠小脑切片中，慢病毒转染干扰,,,,基因表达后，浦肯野细胞树突发育受到影响。,,,,基因表达蛋白质中具有,,,结构，,,,对钙依赖性蛋白质问的相互作用是非常重要的，,,,,基因的表达可能跟小鼠小脑浦肯野细胞迁移排列相关。关键词: ,,,,基因浦肯野细胞慢病毒,,,,,组织切片培养 ,,,,,,,, ,,,,;,,,, ,,,, ,,,,,,,,, ,,,,,, ,, ,,,,,,,,, ,,,, ,,,, ,,,, ,,,, ,,,,,,,,,, ,,, ,;,,,,,, ,, ,,,,,，,,, ,,,, ,,, ,,,, ,煎;,,,, ,,硭妊,, ,,;,,, ,,, , ,,, ,,,,,,,,,,,,;,,, ,, ;,,,?簦颍酰悖?,,,,,,,,, ,,,,,,,,,,(，, ,,,,, ,, ,,,,,,,,,,, ,,, ,,,;,,,, ,, ,,,,,,,, ,,, ,,, ,,,,,,,,,,,, ,,,,,,, ,,,, ,,,, ,,, ,,, ,;;,,,,,;,(,,,,,,,,,,, ,,,,,,,,，,, ,,,,,,, ,,, ,,,,,,,,,, ,, ,,,, ,,,, ,, ,, ,,,,, ,,,,,,, ;,,;,, ,,,,,,,,,(弧, ,,,,,,,,,, ,, ,,,, ,,,, ,,, ,,, ,,,,,,,,,,, ,, ,,,,,,,, ;,,,, ,, ,,,,;,,,,,,,, ,,,, , ,,,,(,,,,,,,(,,, ,,,, ,,,,,,, ,,;,,,,, , ,,, ,,,,,,(啊,, ,,,,,,,, ,, ,,,, ,,,,,,,,, ,, ,,, ,,,,,,;,,,, ,, ;,,;,,,—,,,,,,,,, ,,,,,,,,(,,,,,,,,,,,,,,,, ,, ,, ,,,,,,,, ,,, ,,,,,,,,,,, ,,, ,,,,, , ,,,,,,,,,;, ,, ,,, ,,,,,,,,,, ,,,,, ,,;,,, ,,,, ,, ,,,, ,, ,,,,, ,,,,,,(,,, ,,,,,,;,,,,,,,,,,, ,,,,,,,, ,,,;,,,,,,;,,, ,,, ,,, ,,;,,, ,,,, ,, ,,,, ,,,,,, , ,,,,,,,西,,,,,,,, ,,;,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,,,,,(,，,,,, ;,,,, ,,, ,,(,,,,,,,;,,, ,, ,,, ,,,,,,,, ,,,, ,,,,, ,,,,,, ,,,,,,,,,, ,,;,,,,,,,, ,, ,,,,,(,,,,, ,,, ,, ,,,,,;,,, ,,,, ,,,,,,, ,,,,, ,,,,,,, ;,,;,, ,,,, ,,,,, ,,,, ,,,, ,,,, ;,,,,,,, ,, ,,,,,(,,,, ,,, ,,,,,,,,,, ,,,,,?, ,, ;,,;,,, ,,, ,,(,,, ,, ,,,,, ,,,, ,,,,,(,, ,,,,, ,,, ,,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,,, ,,, ,,, ,,;,,,,, ;,,,,, ,, ,,,,,,,, ;,,,, ,, ,,,,, ;,,,,,,,,, ,,,,, ,,,,,,,,,,,,, ,, ,,,, ,,,, ,, ,,,,,,,,,,(,,, ,,,,, ,, ,,,,, ;,,,,,,,, ,,,,,, ,,,;,;,,,,,, ,, ,,,,, ,, ,,,,,,,,,,,。,,,,,,,,,, ,,,, ;,,,,,,,,,,,,,, ,, ,,,,,,,, ,, ,,,,,,,,,,:;,,,, ,, ;,,,,,,, ,,,;, ,, ,, ,,,,, ;,,,,,,,,, ,, ,,,,,,,,, ,,,, ,,, ,,,, ,,,,,,,,,,,,,, ,, ,,,,, ;,,,, ,, ;,,,,,,,,, ,,,,,,(,,,,,,, ,,, ,,,,, ,,,,,,,,,,, ,,氇,,,, ,,,, ,,,,,,,,,, ,,,,,,,,, ,, ,,,,,,,,(,, ,,,,,,,,,, ,,,, ,,, ,,,,,, ,,,,,,,,,,,,,,,,, ,,;,,,,, ,,, ,,;,,, ,,,, ,, ,,,, ,, ;,,,,,,;,,,(, ,, ,,,,,,,,,,,,,,, ,,,, ,,,,,,, ,,,, ,,, ,,,,,, ;,,,, ,,, ,,,,,,,;,,,矾氇, ,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, ,, ,,,,,,,,,,,(,,, ,,,, ,饿;,,,, ,,,,, ,,,,,,,, ,, ,,,,;,,, ,,;,,,,,,;, ,,, ,,,,,,, ,,,,,,,,,,,,,,,。,,, ,,,, ,,, ,,,,,,,,,, ,,,,,, ,,,,,,,,,,, ,,, ,,(,,, ,,,,,,,,,, ,, ,,,, ,, ,,,,;,,, ,, ,,,,,,,,, ,, ,,,,，,,,,,，,?龋校 罚罚 龋保玻梗梗 樱牵?,,,，,,,,，,,,,,，,,,,，,,,,一,,,，,,,,,，,,,(,,(,,,(,,, ，～， ,,,,,,;,,,,,,,,,,,,,,, ,, ,,,, ,, ,,,,, ,, ,,,, ,,,,, ,, ,,,,,，, , ,,,，,,,,，,,,,,,,,，,,,,,，,,,—,,,,,,，,,, ,,,,, ,, ,, ,,, ;,,,,,,, ,, ,,,,,,,, ,,,,,(,,,,,,,,;, ,，,,,,, ,, ,,,,,,,,,, ,, ,,,, ,,,, ,, , ,,,,, ,, ,,,,,,;,,, ,,,, ;,,;,, ,,,,,(,,,,,,,,谢, ,,,,, ,,,,,,,,,; 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( ,,,,(,,,,,,(,,,,,,,,,: , ,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,(,? ,,,,(,,,,,,(,,,,,: ,?(,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,兀,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,;;,,,,,,,,,? ,,,,(,,,,,,(,,,,,,,,,: ,?(,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,不,,,,,,,，?,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,(,? ,,,,(,,,,,,(,,,,,: ,?(,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,;;,,,,,,,一,? ,,,,(,,,,,,(,,,,,,,,, ,?,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,订,,,,,,,,,,,,,,(,? ,,,,(,,,,,,(,,,,,: ,?(,不,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,，,,,,,,,,,,,,,,,,,,,?，,，,，？?,,,,,,,,;;,,,,,,,一,? ,,,,(,,,,,,(,,,,,,,,,: ,?,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,,,下,,,,,,,,,,,不,,,,,,,,,,,,,?,,,? ,,,,(,,,,, ,,,,,,,,(,,,,,: ,?,,,,,;;;,,,;;;,,,,，,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,;;;,,,,,,,,,,,,,,,, ,,,,,,;;,,,,,,,,,? , 第,章小 鼠,,,,高效率,,,,,筛选以及,,,,,,,,,慢病毒系统构建 ,,,,(一,,,,, ,,,,,,,,?,,,,,,,,,: ,?,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,;;;,,,;;;,,,,,,,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,,;;;,,,,,,,,,,,? 各正义链,?端加,,,,(,,,,,,)，,,,,(,,,,,,)酶切位点修饰。 (,)测序引物 ,,,,,,;,,,,,,贝,〕序引物为,,启动子:,?(,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,(,? 基因转移质粒,,,,,,,,,,上游测序引物:,?,;,,,,,,,,;,,;,,;,,,,;,,,(,,? 基因转移质粒 ;,,,, 上游测序引物: ,?(,,?,,,,,,?,觚,,,,,,,,,,，,,,,(,? (,)小鼠,;,,(,,,,,,,,)引物 ,;,, ,,,,,: ,”,,,, ,,, ,,, ,,, ,,, ,,, ,,,(,、 ,;,, ,,,,,,,,,: ,、一,,, ,,, ,,, ,,, ,,, ,,, ,,,(,? 目的片段大小,,,,,,(,(,细胞株 (,),,,,,,,(”本实验室保存，于,,,,培养基(含,,,胎牛血清)，,,?，,,,,,,条件下常规培养。 (,),，,,,,: 本实验室保存，于,,,,培养基(含,,,胎牛血清)，,,”,，,,,,,,条件下常规培养。,(,(,质粒及菌株 (,)质粒:第三代慢病毒包装系统,,,,,(基因转移质粒)、,,,,,,(包装外壳蛋白质粒)、,,,, , ,,(, ,,,教授惠赠;,,(包装结构基因质粒)由美国加州理工学院,,,,,, , ,干扰用基因转移质粒;,,,,由本实验在,,,,,基础上改建;,,,,,,;,,—,,质粒由本实验室,,,,,,,,, ,,,,,,在,,,,,,公司,,, ,,,;,,,(,,,,,质粒基础上改建。 (,)菌株:大肠杆菌(,,;,,,,;,,, ;,, ,，,(;,, ,),,, ,菌株、,,,,,菌株，由本实验室保存。,(,(,主要试剂 (,)生化酶制剂:限制性内切酶:,,,, ，、,,, ，、,,, ，、,,, ，购自,,,,,,,公司(,,, ,,,,,,,); (,)试剂盒:,,,,,,?,,,,,,; ,,, ,,,,,,;,,,,, ,,,(,,,,,,,公司，,,,(,,,,,)，,，,,,,,, ,,,,质粒小提试剂盒(天根生化科技有限公司，,,,(,, , ,,)，,,,,,,,, ,,,,,,,, ,,,,,,;,,,,, ,,,(,,,,,,公司，,,,(, ,,,,)，,，,,, ,， , 第,章小鼠,,,,高效率,,,,,筛选以及,,,,,,,,,慢病毒系统构建,,, ,,,,,;,,,, ,,,(,,,,,,公司，,,,(,,,, ,)，,,, ,,,,,,,, ,,,,,,,,,,,,,,(,,,,,,公司，,,,(,,,,,)，,,,,, ,,,,,, ;,,, ,,,,,,,,, ,,,(,,,,,,,,,公司，,,,(,,,,,)。 (,)总,,,抽提试剂:,,，,,, ,,,,,,,(，,,,,,,,,,公司，,,,(,,,,,,,,) (,)细胞、组织培养及转染试剂:,,,,，新生牛血清，胎牛血清，,,,,,,;,,,,,,,,,, ,,,,,,,(，,,,,,,,,,公司，,,,(, , ,,,)，,(,, ,,,,,，,,,,,(,,,, ,,,，,,,,, ,,,,，,(,,, ,,,,,,,，,, ,(,,)，丁酸钠(,,,,,,,,,,,,,,)(,,,,,公司) (,) ,,培养基:,,液体培养基(,,胰化蛋白胨(,,,,,公司)，,(,,酵母提取物(,,,,,公司)，，,,,,，，,,,(,)。高压灭菌备用。 ,,固体培养基(,,胰化蛋白胨(,,,,,公司)，,(,,酵母提取物(,,,,,公司)，，,,,,，，,,琼脂糖，,,,(,) (,),,,,,,、,,,试剂: ,,,,, ,,, ,,,,,,,,,(,，,,,,,公司，,,,(,,,,,)，,,,, ,,, ,,,,,,，,,,,, ,,, ,,,,,,、, ,,,？ ,,, ,,,,,,,,,(,，,,,,,公司)，,,,,,,,,, ,,,,,, ,,,,,, ,,,,,,(,,)(碧云天公司，,,,(,,,,,)，高保真,,,聚合酶(,,,,,,公司，,,,(,,,, ,,)，,,,,(,,,,,公司)。 (,),,,,,,,印迹相关材料及试剂: 硝酸纤维素膜 (,,,,,,,,公司) 预染标准蛋白 (,,,,,,,,,公司,,,(,,,,,,) 脱脂奶粉(,,,) (光明乳业) 兔来源,,,抗体 (碧云天公司,,,(,,,,,) 鼠(,,,,,)抗兔,,,,,单克隆抗体(,,，,,,，,,公司,,,(,,,,(,) 山羊抗兔，,,,,,,,,,标记二抗 (,,;,,,,,公司,,,(,, ,—,,,(,,,) ,，,, ,,,,, ,,,,,,(,,,,, ,,,,公司,,,(,,(,,,,,) ,,,(,,,,胶，配方见表,(,: 表,(, ,,,(,,,,胶配方 , 第,章小鼠,,,,高效率,,,,,筛选以及,,,,,,,,,慢病毒系统构建 其它常用试剂:,,,,,,(,,,电泳缓冲液，,,,,,(,,,,上样缓冲液，,,,(,,,,染色液，蛋白转移缓冲液，洗涤缓冲液(,,,,)，磷酸盐缓冲盐溶液，,,,,,,，,,,丙烯酰胺，封闭缓冲液，,,,,,,,，,(,, ,,,,?,,，(,, ,(,)， , ,”，,,,?,,，(,, ,(,)，,,,、,(,,,乙酸钠(,,,(,)等参照分子克隆实验指南配制。 (,)实验用,,,、,,,,,等常规缓冲液参照《分子克隆实验指南(第三版)》配置 (,)其它生化试剂均为国产 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 纯，购自上海国药集团有限公司。,(,(,(实验耗材,(,,,、,(,,,、,,,,、,,,, ,,管，,,;,,培养瓶，六孔板、,,孔板(,,公司),(,(,计算机生物信息学(,,,，) ,,,,,,,, ,,,,,, ,,, ,,,,,;,,,,,,, ，,,,,,,,,,,: (,,,,:,,,,,(,;,,(,,,(,,,(,,,,,,,,,,:,,,,:,,,,,(,;,,(,,,(,,,(,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,:,,,,:,,,,,(,;,,(,,,(,,,(,,,,,,,,,,,,,,,(,(,主要仪器和设备 细胞培养箱: ,,,，,公司 ,,,,,(,,,型净化工作台: 江南净化设备公司 ,,(,,型电热恒温水槽: 上海华连医疗器械有限公司 高压蒸汽消毒锅: ,,,,公司 ,,,(, , ,,型电热恒温鼓风干燥箱: 上海一恒科技有限公司 ,,,,水处理系统: ,,,,公司 超低温冰箱: ,,,, ,,,,, 台式离心机: ,,,,,,,,,公司 ,,,,,型高速冷冻离心机: ,,,,,,,,,公司 ,,(,恒温磁力搅拌器: 上海志威电器有限公司 ,,,,,,荧光倒置显微镜 ,,,,,公司 微量加样器: ,,,,,,,,,公司 ,,,仪,,,,,,, ,,, ,,,,,, ,,,,、,,,,: ,,,,,,, ,,,,,,,,,, 凝胶、蛋白电泳系统: ,，,(,,,公司 ,,(, ,多功能暗箱式紫外透射仪: 上海顾村电光仪器厂 ,,,(,,,型凝胶成像系统: ,,,,公司 , 第,章小鼠,,,,高效率,,,,,筛选以及,,,,,,,,,慢病毒系统构建 ,,,,,,,,,,,,,可见分光光度计: ,,,,,,,,,公司 ,,,,,型便携式酸度计 上海精密科学仪器有限公司 ,,(,,自动双重纯水蒸馏器 上海亚荣生化仪器厂 ,,,,,, ,,,,,, ,,,,,, ,;,,,,,,,; ，,,,,,,,,, ，,;(,(,(, ,, ,,,,,,,流式细胞仪 ,,公司 ,,,,,,,红外荧光扫描成像系统,，(,,,公司 ,,,,,,,,型酶标仪 ,,,(,,,公司 ,,,,,,,,,,,,电转仪 ,,,,,,,,,公司,(, 实验方法,(,(,小鼠基因组,,,抽提 采用,,,,,,,公司基因组,,,抽提试剂盒，按操作说明进行。 (,)小鼠腹主动脉取血,,,,,于,(,,,离心管，肝素抗凝。 (,)加入,,,,,细胞裂解液，上下颠倒离心管,次，充分混匀。室温静置,, 分钟，每隔,分钟混匀一次。 (,)室温,,,,,转离心,,秒，血白细胞即沉淀于管壁，弃去上清，剩余,,”,, ,,,,液体，涡旋振荡器重悬细胞。 (,)加入核酸裂解液,,,,,，移液枪充分吹打裂解白细胞至液体粘稠，如溶 液中仍有碎块未裂解，于,,?孵育至碎块完全裂解。加入,(,,, ,,,,,， 混匀，,,?孵育,,,,,。 (,)加入蛋自萃取液,,,,,，涡旋振荡器震荡,,,，室温,,,,,转离心,,,,。 将上清移至干净,(,,,离心管。 (,)加入,,,,,异丙醇，上下颠倒离心管，充分混匀，直至见到白色线状,,, 析出。室温,,,,,转离心,,,,，管底可见,,,白色沉淀。小心移去上 清，沿离心管壁缓缓加入,,,,,,乙醇，室温,,,,,转离心,,,,。 (,)移液枪轻轻移尽上清，离心管倒置于吸水纸上，室温干燥, ,,,,。 (,)取,,,,,,,溶解液加入离心管，,,?水浴,,,溶解,,,。,,,,,,,,,,,,, 分光光度计测量,,,浓度，一,,?冻存备用。,(,(,小鼠,,,,基因第二外显子扩增及,,,产物纯化(，),,,;,,,,, ,,,扩增小鼠,,,,基因第二外显子 ,,,,体系: , 第,章小鼠,,面高效率,,,,,筛进以及,,,,,,,,,慢病毒系统构建 ,,,,,,,, ,,,, ,,,,,,,,,,,; ,,,(,,,,,,,,) ,,, ,,,, ,,,,, ,,,,;, ,(,,, ,,,,,,,,,,,,, ,,;,,, ,(,,, ,,,,, ,,,, ,,,,, ,,,反应条件 ,,? ,,“,(,,?) ,;,;,,, ,,? 〕 ,,”,(,,”,) , ,, ;,;,,, ,,? 蛐,甍,詈撕,簧弧(宣训能 ,,,产物,,琼脂糖凝胶电泳,,,，,,,,,,，紫外凝胶透射仪下分离目的片段，利用,，,,,，， ,,,,,,,,;,,,,,,,(,,,,,,公司，,,, ,,,,,)回收目的片段， 洋细操作步骤见试剂说明书，文后涉及切胶回收均采用此方法。, ,(,质粒构建(,)各质粒结构示意图 ?醪…。 心, 一” ‖ ””,, , ,第,章小鼠,,,,高效率,,,,？,筛选以及嘣,,,,,慢病毒系统构建 ,?。缘;,,。。 ”蓼么一,,,,目 (,、 …丫一臻, ?参…、廖 。曼矽,?。…， , 、心赫 , ,,,:…“,,,。 毒… , 图, ，符质粒结构示意豳 , 第,章小鼠,,,,高效率,,,,,筛选以及,,,,,,,,,慢病毒系统构建(,)融合蛋白,,,,,,,,,,重组子构建 ,)双酶切反应:用,,, ，和,,,, ，在, ,”(,条件下分别对,,,,,基因,,, 产物和质粒,,,,,双酶切,小时，酶切后的产物经,,凝胶电泳后割胶 回收并定量。 反应体系:,,,,, ,,,,, ,,,产物 ,,,,,,,,, ,,, ,,, ,,,,,, ,,, ,,, ,,, ,,, ,,, ,,, ， ,,, ,,, .