【doc】 调心方活性部位对皮质酮抑制大鼠海马脑片CA1区诱发长时程增强的作用

【doc】 调心方活性部位对皮质酮抑制大鼠海马脑片CA1区诱发长时程增强的作用 调心方活性部位对皮质酮抑制大鼠海马脑 片CA1区诱发长时程增强的作用 中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第36卷第1期2005年1月?65? 药理与临床 调心方活性部位对皮质酮抑制大鼠海马脑片CA1区诱发 长时程增强的作用 乔海法,杨胜,周文霞.,张永祥 (军事医学科学院毒物药物研究所,北京100850) 摘要:目的以长时程增强(LTP)为指标,研究调心方(TXR)活性部位A(TXR—A)对皮质酮抑制大鼠海马脑片 LTP作用的影响.方法将脑片分为正常对照组,皮质酮组,皮质酮 ,皮质酮+不同浓度TXR—A组,记 +TXR组 录前脑片用含药人工脑脊液(ACSF)孵育1h, 记录 混凝土 养护记录下载土方回填监理旁站记录免费下载集备记录下载集备记录下载集备记录下载 时用相同ACSF灌流.采用细胞外微电极记录技术,记录大鼠 海马脑片CA1区诱发群峰电位(PS),然后施以100Hz,100个脉冲的强直刺激HFS诱发LTP.结果与正常脑 脊液组相比,皮质酮(2mol/L)孵育海马脑片1.5h以上,强直刺激后PS增幅显着降低,提示皮质酮对海马 LTP具有抑制作用.用不同浓度的TXR—A+皮质酮孵育脑片1.5h以 上,强直刺激后高浓度TXR—A组的PS平 均幅度显着提高,且作用优于TXR.提示TXR—A可以对抗皮质酮对 LTP的抑制.结论该活性部位可能是发挥 TXR改善皮质酮抑制大鼠海马CA1区诱发LTP作用的主要成分之 一,拮抗皮质酮对LTP的抑制是其益智作用 的机制之一. 关键词:调心方;长时程增强(LTP);皮质酮;海马脑片 中图分类号:R285.5文献标识码:A文章编 号:0253—2670(2005)01—0065—04 EffectofactivefractionofTiaoxinRecipeoillong-termpotentiation inhibitedbycorticosteroneinareaCA1ofrathippocampalslices QIA0Hai—fa,YANGSheng,ZHOUWen—xia,ZHANGYong—xiang (InstituteofPharmacologyandToxicology,AcademyofMilitaryMedicalScience,Beijing100850,China) Abstract:ObjectiveToinvestigatetheeffectofactivefractionA(TXR—A)ex tractedfromTiaoxin Recipe(TXR)oninhibitionofcorticosteroneonlong—termpotentiation(LT P)inducedbyhighfrequency stimulation(HFS)inrathippocampalslices.MethodsTheslicesweredividedintocontrol,corticos— terone,corticosterone+TXR,andcorticosterone+differentconcentrationofTXR—Agroups,thenwere incubatedwithartificialcerebrospinalfluid(ACSF)addedbydrugsfor1hbeforerecordingandwereper— fusedwiththesameACSFduringrecording.Populationspike(PS)wasrecordedfromstratumpyramidale ofareaCA1usingextracellularrecordingfollowingstimulationofSchaffercollateralsinrathippocampal slices.Thena1OOHz,1OOpulsesHFSwasusedtoinduceLTP.ResultsPSamplitudewasdecreasedsig— nificantly’usthatinthecontrolgroup,whenthesliceswerepre—incubatedin ACSFaddedbycorticosterone (2~.mol/L)over1.5h,meaningthatLTPwasinhibitedbycorticosterone.However,PSamplitudeofthe slicespre—incubatedinACSFaddedbycorticosterone(2p.mol/L)andhighconcentrationTXR—Awasin— creasedsignificantly’usthatofcorticosteronepre—treatingslices,meaningt hathighconcentrationTXR—A enhancedLTPinhibitedbycorticosterone.Furthermore,increasedLTPamplitudeinhighconcentration TXR—AwasmuchmorethanthatinTXR.ConclusionTXR—Aisoneofmai nTXRactiveingredients whichfacilitateLTPinhibitedbycorticosteroneinareaCA1ofrathippocampalslices.Theantagonist effectoncorticosteroneinhibitiononLTPisoneofthemechanismstobenefitt heintelligence. Keywords:TiaoxinRecipe(TXR);long—termpotentiation(LTP);corticosterone;hippocampalslice 糖皮质激素(glucocorticoids,GCs)过度分泌 与海马的增龄性认知机能障碍及阿尔茨海默病 (AD)所表现的海马机能损伤关系密切.前期研究 表明,ip皮质酮(corticosterone)可明显抑制整体 收稿日期:2004—05—08 基金项目:国家自然科学基金重点项目(39830450) 作者筒介:乔海法(1967一),男,山东青岛人,教授,医学博士,现为军事 医学科学院总后优秀人才科研工作站研究人员,主要从事中药及 神经药理学研究.Tel:(01O)66931627E—mail:haifaqiao@163.com *通讯作者 Tel:(01O)66931625Fax:(01O)68211656E—mail:Zhouwx@nic.bmi.ac.cn ?66?中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第36卷第1期2005 年1月 大鼠海马齿状回诱发长时程增强(1ong—termpo— tentiation,LTP)?;皮质酮也可以抑制海马脑片 CA1区诱发LTP,由党参,桂枝,茯苓,菖蒲,远志和 炙甘草等中药组成的调心方(TXR)则可以明显对 抗这一作用嘲.为深入探讨TXR发挥益智作用的 物质基础,笔者通过药理和化学研究方法,获得了几 个部位,其中,部位A中含总皂苷7O以上,初步 动物实验结果表明,该部位对p一淀粉样蛋白(p— AP)诱导的痴呆模型大鼠的空间学习记忆障碍具 有明显改善作用,提示该部位可能是TXR发挥益 智作用的活性部位之一.为进一步探讨其发挥益智 作用的机制,本研究采用细胞外微电极记录技术,首 先观察皮质酮对脑片LTP诱发的抑制作用,然后 观察调心方活性部位A(TXR—A)对皮质酮抑制大 鼠海马脑片CA1区诱发LTP的影响,并与TXR 全方对抗皮质酮抑制LTP诱发的作用进行比较. 1材料与方法 1.1动物:二级Wistar大鼠,雌性,体重160, 200g,由军事医学科学院动物中心提供. 1.2药品与试剂:TXR为水提醇沉制成的水溶液, 含生药7.45g/mL;TXR—A则采取水煎,醇沉,进 而以乙醚,正丁醇提取的工艺进行提取,TXR—A (配方中远志的总皂苷>50)配成含生药7.45g/ mL的溶液;均由上海中医药大学老年医学研究所 提供.皮质酮购于美国GibcoBRL公司;其他试剂 均为国产 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 纯. 1.3海马脑片制备:将大鼠在乙醚麻醉下断头取 脑,于大脑半球腹内侧分离出双侧海马,在4?供 氧条件下,用振动切片机(VibrosliceMA752, CampdenIns,英国)沿与海马长轴垂直的方向将其 切成厚为400m的脑片,全部脑片置于不断通入 氧混合气体(95%0.+5oACO)的人工脑脊液 (artificialcerebrospinalfluid,ACSF)中,在室温 (21,26?)下孵育1.5h以上.ACSF的组成为 (mmol/L):NaC1124,KC15,KH2PO41.2,MgSO4 1.3,NaHCO326,CaC122.5,D—glucose10,调pH值 至7.3,7.4. 1.4群峰电位(populationspike,PS)记录:将孵 育后的脑片置于海马浴槽中并固定,不断通入氧混 合气,用蠕动泵持续灌流ACSF(1.5,2mL/min), 使海马脑片全浸于液面下.整个实验过程用恒温器 将浴槽温度控制在(3O?1)C.双极刺激电极置于 由海马CA3区锥体细胞发出而投射于CA1区的 Schaffer侧支上,玻璃微电极(内充4mmol/L NaC1溶液,阻抗3,7MI2)置于海马CA1区锥体 细胞层,由刺激器(SEN一7203,日本)输出刺激信号 经隔离器(SS一104J,日本)至刺激电极.记录细胞外 诱发PS,则通过微电极放大器(Axoclamp2A,Ax— onIns,美国)与计算机相联,由Pclab2.2软件(北 京微信斯达科技发展有限公司)进行采样处理. 1.5LTP的诱发:实验开始时,先用中等强度的单 刺激(间隔60S,持续200s)诱发出特征性的基 础PS,稳定记录10min,使PS达到稳定,调节PS 幅度至最大幅度的5O,6O,再稳定记录15 min,然后给予Schaffer侧支纤维一个频率为100 Hz的100个脉冲的高频刺激(HFS),此时可以记 录到增大的PS,HFS后连续记录60min. 1.6观测指标和测量方法:实验中以PS幅度相对 值(%)为观测指标,并观察其增幅情况.具体测定 方法:每5个连续时间点即连续5min采集的5个值 (1个/min)进行平均得一个值,以HFS之前15min 内的PS均值为100%,每5个时间点平均得到的值 分别除以HFS之前的PS均值,得各时间点的PS幅 度相对值().整体的平均增幅则是将HFS后6O minPS幅度均值除以HFS前的PS均值. 1.7给药方法:将TXR及TXR—A溶液离心,并 用ACSF分别稀释.其中,TXR稀释1000倍,使其 含生药7.45mg/mL;TXR—A溶液则分别稀释 2000,1000,500倍,使其含生药分别为3.75, 7.45,14.9mg/mL.当观察药物对海马脑片基础突 触传递的影响时,先采用通常的ACSF灌流脑片并 记录正常的PS,然后采用含药ACSF灌流脑片,观 察其是否发生变化;当观察皮质酮对海马脑片LTP 的抑制作用及TXR或TXR—A对抗皮质酮的这种 作用时,则分别在实验前用含皮质酮(2t~mol/L) 及皮质酮(2t~mol/L)+TXR(含生药7.45mg/ mL)或皮质酮+不同质量浓度TXR—A的ACSF 孵育脑片1.5h以上,并在整个实验记录过程中均 用此含药ACSF灌流脑片. 1.8数据处理:采用Origin6.0软件(Microca[ Software,美国)及SAS软件包(Release6.12, SasInstituteInc,美国)对数据进行分析和统计学 处理.定量资料数据用x+s表示.两组数据比较采 用配对StudentSt检验;LTP的动态变化采用具 有一个重复测量的两因素方差分析(two—way ANO—VA);而1h平均PS幅度相对值则采用单因 素方差分析(one—wayANOVA);多组比较用SNK 检验. 中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第36卷第1期2005年1 月67 2结果 2.1皮质酮对大鼠海马脑片诱发LTP的抑制作 用:首先用通常的ACSF灌流海马脑片,记录正常 的PS,将PS调至最大幅度的50,60,稳定记 录10min后,灌流含2/2mol/L皮质酮的ACSF,观 察其对脑片基础PS的影响.结果发现,所记录的7 例脑片在灌流后30min内PS的形状,幅度没有发 生明显变化(图1).提示皮质酮并不影响大鼠海马 脑片的基础突触传递. 预先用含2/2mol/L皮质酮的ACSF孵育海马 脑片1.5h以上,再观察LTP的诱发情况.结果发 觋,LTP的幅度受到明显的抑制,与对照组即正常 ACSF组相比,HFS后不同时间点PS增幅及60 min内的平均PS幅度也明显降低(表1,图2),提示 j掣200 ‘ 罂 墨100 表1TXRA对皮质酮抑制大鼠海马脑片CA1区诱发Ps幅度的影响 (?,,l一6) Table1EffectofTXR—AonPSinhibitedbycorticosteroneinCA1areaofrath ippocampalslices(土,,l一6) 对照一 皮质酮一 皮质酮+TXR7.45 皮质酮+TXR—A3.75 7.45 】4.9 与对照组比较:一P<O.01;与皮质酮组比较:P<O.05P<O.01;与皮质酮+TXR组比较:P<O.05;与皮质酮+TXR—A (3.75,7.45mg/mL)组比较:P<O.05P<O.01 一P<O-01VScontrolgroup;P<O.05P<O.017)5corticosteronegroup; ?P<O.05VScorticosterone+TXRgroup:?P<O.05 P<O?01VScorticosterone+TXR—A(3.75,7.45mg/mL)groups 诱发PS幅度的影响:预先分别用含皮质酮+TXR 及皮质酮+不同浓度TXR—A的含药ACSF孵育海 马脑片1.5h以上,然后在记录脑片PS以及随后诱 发LTP的过程中一直采用同样的含药ACSF灌流, 观察TXR—A对皮质酮抑制脑片诱发PS及LTP幅 度的影响.结果显示,HFS后14.9mg/mLTXR—A 组不同时间点的PS幅度明显高于皮质酮模型组 (P<0.O1)(表1).7.45和14.9mg/mLTXR—A 组脑片HFS后60rain内的平均PS幅度相对值明 显高于模型组(P<0.O1),并表现出一定的量效关 系,14.9mg/mLTXR—A组的作用优于TXR(P< 0.05)(图2).提示高浓度TXR—A可明显改善皮质 酮对不同时间点PS幅度及整个LTP维持的抑制 作用. 3讨论 皮质酮是肾上腺皮质分泌的主要GCs,具有抗 炎,抗免疫和介导应激等重要作用,其分泌受控于下 丘脑一垂体一肾上腺(HPA)功能轴,血浆皮质酮水平 升高可作用于下丘脑糖皮质激素受体而反馈性抑制 HPA轴功能,减少肾上腺皮质分泌皮质酮,并使血浆 皮质酮保持在一个较为稳定的水平.临床研究表明, AD患者HPA轴功能亢进,GCs水平明显高于正常 水平-3].皮质酮过量分泌可损伤中枢神经系统,尤 其对海马神经细胞具有选择性毒性[.AD患者中, ? ? ? *## *#4# 0Ji9l ?????? 76O06O4 113 士士士士士士 3O0;6 96O0656 5nu610J5 }! ? ? ? *## *## 68O18O ?????? 235697 112 士士+一士士士 i298 ?????? 957O0O09 5O6124 }! ? ? ? *## *### O04O712 ?0J {12士士+一士士士 969O043 々,0J々,D 5O6134 ;! ? ? *## *### i3O02 ?????? 953831 {2 士士士士士士 O0O6161 675O065 5O6133 ;! ? ? *## *### 764422 ?????? 722724 {2+一+一士士士士 75Oi ?_????4i32 5O6133 ;! ? ? *## *### 3675O2 ?????? 323418 {2 士士士士士士 O7O6O06 ??????394O93 5nu620J2 ;1 中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第36卷第1期2005年1月 300 玉 毒20() 望 l()0 露 23456 1一对照2一皮质酮3一皮质酮+TXR4一皮质酮+TXR—A (375mg/mL)5-皮质酮+TXR—A(7.45mg/mL)6-皮质 酮+TXR—A(14.9mg/mL)与对照组比较一P<0.01;与 皮质酮组比较tP<0.01;与TXR组比较:P<0.05;与皮 质酮+TXR—A(3.75mg/mL)组比较:P<005 1一control2-corticosterone3-corticosterone+TXR4一corti— costerone+TXR—A(3.75mg/mL)5-corticosterone+TXR—A (7.45mg/mL)6-corticosterone+TXR-A(14.9mg/mL) P<0.01vscontrolgroup;P<0.01vscorticosterone group;P<0.05vsTXRgroup;P<0.05vscorticosterone+ TXR-A(3.75mg/mL)group 图2TXR—A对皮质酮抑制大鼠海马脑片CAI区 诱发LTP平均PS幅度的影响(,l一6) Fig.2EffectofTXR—AonmeanPSofLTP inhibitedbycorticosteroneinCA1area ofrathippocampalslices(,l一6) 与学习记忆功能存在高度相关性的海马的损伤程度 同其认知能力衰退具有明显的相关性,前期研究表 明,快速老化小鼠海马中的皮质酮含量呈增龄性升 高[8;皮质酮可显着抑制整体大鼠海马齿状回及离体 海马脑片CA1区LTP的诱发及维持[1],这与文献 报道一致[9,1o3. 本实验以LTP为观测指标,首先观察了皮质酮 对大鼠海马脑片LTP的抑制作用,并在此基础上研 究了TXR—A对皮质酮抑制大鼠海马脑片LTP的影 响.结果表明,皮质酮并不影响大鼠海马脑片的基础 突触传递,加入TXR—A也没有改变.相同于或2倍 于TXR浓度的TXR—A可以增强被皮质酮抑制的 LTP幅度,并具有一定的量效关系,两倍浓度的作用 明显优于TXR.因此,TXR的该活性部位可能是发 挥原方对抗皮质酮抑制大鼠海马脑片诱发LTP的主 要成分之一,它拮抗皮质酮抑制LTP的作用可能也 是其益智的机制之一.然而,在正常脑片上的实验表 明,不但与TXR相同浓度的TXR—A对LTP的促 进作用不如TXR,即使2倍浓度的TXR—A作用也 不如TXR(结果另文发表),这又提示TXR—A发挥 益智作用与受试对象的机能状态有关,其对改善皮质 酮损害LTP具有特异性.由于皮质酮抑制海马LTP 的诱发和维持与Ca及一些与LTP关系密切的蛋 白激酶的磷酸化有关,因此,该活性成分可能是通过 改善皮质酮的这种抑制作用来促进LTP的诱发并发 挥益智作用的. References: [1]ZhouJz.ZhangYX,LiuCH,etalInhibitoryeffectof [2] [3] [4] [5] [6] [7] [8] [9] [1o] corticosteroneontheformationofLong—termpotentiationin rathippocampaldentategyrus[J].ChinJPharmacolToxi— col(中国药理学与毒理学杂志),1999,i3(4):241—244. WanQ,ZhangYX.EffectofTiao—Xin—Fangonlong—term potentiationinrathippocampalslices[J]ChinJExpTradit MedForm(中国实验方剂学杂志),2002,8(6):22—25. 0’BrienJT,AruesD,SchweitzerI,eta1.Enhancedadrenal sensitivityofadrenocorticotrophichormone(ACTH)isevi— denceofHPAaxishyperactivityinAlzheimer’sdisease[J]. PsycholMed,1996,26(1):7—14. MagriF,LocatelliM,BaizaG,eta1.Pathologicalbrain aging[J].ChronobiolInt,1997,14(4):385—396. BalldinJ,BlennowK,GottfriesCG,eta1.Relationship betweenmentalimpairmentandHPAaxisactivityindemen— tiadisorders[J]Dementia,1994,5(5):252—256 SapolskyRM.Amechanismforglucocorticoidtoxicityin thehippocampus;increasedneuronalvulnerabilityto metabolicinsults[J].JNeurosci,1985,5#i228—1240. SapolskyRM.PulsinelliW.Glucocorticoidspotentiate ischemicinjurytoneurons#therapeuticimplication[J]. Science,1985,229:1397—14O1. ZhouJZ,ZhangYX.IncreasedcorticosteroneLeveLsin plasmaandhippocampusandtheirrelationshipwithhip— pocampalATPdepletioninsenescenceacceleratedmice[J]. ChinJPharmacolToxicol(中国药理学与毒理学杂志), 1998,12(1)12—15. BodnoffSR,HumphreysAG,LehmanJC,eta1.Enduring effectsofchroniccorticosteronetreatmentonthespatial learning,synapticplasticity,andhippocampalneuropathoLo— gyinyoungandmid—agedrats[J].JNeurosci,1995,15 (1):61—69. MaQ,WangFZ,ZhaoT,eta1.Effectofcorticosteroneon longtermpotentiationinrathippocampalslices[J].ChinJ ApplPhysiol(中国应用生理学杂志),2003,19(1)96—97.