amiRNAi-实现高效稳定的特异基因沉默新方法

书书书 中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１０，３０（８）：１１８１２５ 檪檪檪檪檪檪檪檪檪 檪 檪檪檪檪檪檪檪檪 檪 檪 殏 殏 殏 殏 综　　述 ａｍｉＲＮＡｉ实现高效稳定的特异基因沉默新方法 叶梅霞　刘军梅　李　昊　崔东清　王静澄　张志毅　安新民 （北京林业大学林木育种国家工程实验室 林木花卉遗传育种教育部重点实验室 国家林业局树木花卉育种与生物工程重点开放实验室　北京　１０００８３） 摘要　ＲＮＡ干扰技术（ＲＮＡｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ，ＲＮＡｉ）是实现基因沉默的有效工具。近年来，随着分子 生物学与生物技术的快速发展，在 ＲＮＡｉ基础上又发展出另一种特异性更高的基因沉默技术— ａｍｉＲＮＡｉ（ａｒｔｉｆｉｃｉａｌｍｉｃｒｏＲＮＡｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）。ａｍｉＲＮＡｓ是一类由内源 ｍｉＲＮＡ前体生成的长２１个 核苷酸的人工小ＲＮＡ分子，它能在不影响其他基因 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 达的情况下特异地介导单个或多个靶基因 高效稳定沉默。与普通的ＲＮＡｉ相比，ａｍｉＲＮＡｉ具有特异性高、稳定性强和沉默效应可预见等优 点。因而ａｍｉＲＮＡｉ可能成为基因功能 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 的最有效工具之一，同时 ａｍｉＲＮＡｉ对于基因负调控研 究和应用而言前景广阔。着重介绍了ａｍｉＲＮＡｉ技术的原理、优势及其潜在的应用价值。 关键词　ａｍｉＲＮＡｉ　ｍｉＲＮＡ　ｓｉＲＮＡ　基因沉默 中图分类号　Ｑ７５６ 收稿日期：２０１００３２３　　修回日期：２０１００５１２ 国家“８６３”计划（２００９ＡＡ１０Ｚ１０７）、教育部重点项目（１０８０１７）、国 家林业局项目（２００６４７２，ＬＹ０９０２）资助项目 通讯作者，电子信箱：ｘｉｎｍｉｎａｎ＠１６３．ｃｏｍ 　　在过去１０年中，ＲＮＡｉ已被广泛应用于基因敲除 的研究［１］，其作用机制是由互补的内源或外源 ＲＮＡ形 成的双链ＲＮＡ诱发基因沉默。双链 ＲＮＡ经 ＲＮａｓｅＩＩＩ 中Ｄｉｃｅｒ或Ｄｉｃｅｒｌｉｋｅ（ＤＣＬ）酶加工后形成长２０２６ｎｔ的 小ＲＮＡ（ｓｍａｌｌＲＮＡ，ｓＲＮＡ）。随后这些小 ＲＮＡ可直接 作用于Ａｒｇｏｎａｕｔｅ（ＡＧＯ）蛋白，构成ＲＮＡ诱导的沉默复 合体（ＲＮＡｉｎｄｕｃｅｄｓｉｌｅｎｃｉｎｇｃｏｍｐｌｅｘ，ＲＩＳＣ）效应物中 的核心成分。ＲＩＳＣ以 ｓＲＮＡ为导向，根据序列互补原 则作用于靶 ｍＲＮＡ上，从而导致靶 ｍＲＮＡ的断裂或翻 译抑制［２］。由转基因导致产生的反义 ＲＮＡ、反向重复 ＲＮＡ或病毒ＲＮＡ虽然已经成功应用于各生物体内源 基因的表达敲除，但是通过这些途径实现的基因沉默 存在着脱靶效应、沉默效率多变以及稳定性较差的问 题 快递公司问题件快递公司问题件货款处理关于圆的周长面积重点题型关于解方程组的题及答案关于南海问题 ［３４］。ａｍｉＲＮＡ首先在人类细胞研究中得到了应 用［５］，随后又报道了在拟南芥中 ａｍｉＲＮＡ的应用［６］。 ２００６年以来，陆续发表了利用内源ｍｉＲＮＡ自然前体人 工合成具有理想序列的 ｍｉＲＮＡ，并以此下调特定基因 表达的相关报道。而且认为在组成型、组织特异型或 诱导型启动子驱动下的 ａｍｉＲＮＡ都能有效表达。 ａｍｉＲＮＡ这种严格的时间上和空间上的表达被称为自 控效应（ａｕｔｏｎｏｍｏｕｓｅｆｆｅｃｔｓ）。已有研究表明，组织特异 型启动子驱动 ａｍｉＲＮＡ的非自控效应（ｎｏｎａｕｔｏｎｏｍｏｕｓ ｅｆｆｅｃｔｓ）即使存在，也极为有限［７］。无论内源基因还是 外源基因，都已证明ａｍｉＲＮＡ能使其高效沉默。这种通 过ａｍｉＲＮＡ实现可预见的特异基因高效稳定沉默是 ＲＮＡｉ发展进程中的又一重大突破，已经成为反向遗传 学研究的有力工具。 １　ａｍｉＲＮＡｉ与ｓｉＲＮＡｉ 　　作为非编码ＲＮＡ家族成员之一的ｓＲＮＡ是一类长 ２０～２４个核苷酸的调控性小分子ＲＮＡ（包括ｍｉＲＮＡ与 ｓｉＲＮＡ），它们可通过剪切 ｍＲＮＡ或抑制蛋白 翻译 阿房宫赋翻译下载德汉翻译pdf阿房宫赋翻译下载阿房宫赋翻译下载翻译理论.doc 的方 式负向调控靶基因的表达，从而导致基因沉默。在植 物中ｍｉＲＮＡ和 ｓｉＲＮＡ都由 ＤＣＬ酶作用于其前体加工 形成的。前者的前体是位于发夹状茎环结构茎部的一 段序列［８］，后者则来源于双链 ＲＮＡ（ｄｏｕｂｌｅｓｔｒａｎｄｅｄ ２０１０，３０（８） 叶梅霞 等：ａｍｉＲＮＡｉ实现高效稳定的特异基因沉默新方法 ＲＮＡ，ｄｓＲＮＡ）［９］，但两者有着相同的生化活性。在保 持发夹状ｍｉＲＮＡ茎环前体的结构和能量特征不变的条 件下改变碱基，也可产生与自然ｍｉＲＮＡ具有相同长度、 但与自然 ｍｉＲＮＡ序列完全无关的小 ＲＮＡ［５６，１０］，这种 小ＲＮＡ分子就是 ａｍｉＲＮＡ。ａｍｉＲＮＡ双体与 ｓｉＲＮＡ双 体及ｍｉＲＮＡ双体类似，ＡＧＯ蛋白优先与 ａｍｉＲＮＡ双体 中５′端不稳定的一条链结合形成ＲＩＳＣ复合体，这条链 通过碱基互补配对的方式作用于靶 ｍＲＮＡ。ａｍｉＲＮＡ 沿用了ｍｉＲＮＡ选择靶标时的各项参数标准［１１］，它的显 著特点就是在其３′端引入了１～２个错配［１２］，从而提高 了对靶标选择的特异性，它能在不影响其他转录本表 达的情况下特异性地沉默靶序列。但由反义 ＲＮＡ、病 毒ＲＮＡ、发夹式 ＲＮＡ（ｈａｉｒｐｉｎＲＮＡ，ｈｐＲＮＡ）所产生的 ｓｉＲＮＡ却不具备这个特点。 １．１　反义ＲＮＡ诱导的基因沉默 　　反义 ＲＮＡ介导的基因沉默是指将与特定 ｍＲＮＡ 互补的反向序列片段导入生物体内使目的基因沉默的 方法。Ｉｚａｎｔ等［１３］证明了动物细胞内反义 ＲＮＡ对其互 补的ｍＲＮＡ链的表达具有抑制作用。强启动子或外源 基因的表达以及在载体上呈反式排列的同源 ＤＮＡ都 是形成反义 ＲＮＡ的重要原因［１４］。迄今转基因与其 ! 源基因的沉默现象由ｓＲＮＡ介导已为我们所知，产生这 种ｓＲＮＡ的ｄｓＲＮＡ既可来自于反义 ＲＮＡ和与之互补 的ｍＲＮＡ链所形成的复合体，也可由作用于反义 ＲＮＡ 链的 ＲＮＡ依赖的 ＲＮＡ聚合酶 （ＲＮＡｄｅｐｅｎｄｅｎｔＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ，ＲｄＲｐ）合成［１５］。 １．２　 病毒诱导的基因沉默 　　目前已被广泛应用于植物基因功能研究的另一种 方法就是病毒诱导的基因沉默（ｖｉｒｕｓｉｎｄｕｃｅｄｇｅｎｅ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ，ＶＩＧＳ）。这种方法主要是将病毒ＲＮＡ中负责 编码 ＲｄＲｐ酶的基因连接到表达载体的启动子之 后［１６］。含有植物目的序列的病毒基因组侵染时大量复 制，期间在ＲｄＲｐ的作用下可合成 ｄｓＲＮＡ，ｄｓＲＮＡ也可 由病毒单链ＲＮＡ折叠形成。当 ＤＣＬ作用于 ｄｓＲＮＡ时 可得到能导致内源基因高效沉默的ｓｉＲＮＡ。ＶＩＧＳ是一 种瞬时表达体系，它不需要产生能够稳定表达沉默结 构的转化株后代［１７］，因而它不能稳定遗传。病毒对植 株一般都具有最佳的侵染时期，所以对于在最佳侵染 时期内不表达的基因来说，用该方法来研究其基因功 能就有局限性［１８］。 １．３　ｈｐＲＮＡ介导的基因沉默 　　另一种比单独引入正义或反义转基因片段更容易 实现基因表达抑制的途径—ｈｐＲＮＡ介导的高效基因沉 默途径，又被称为反向重复转录后基因沉默（ｐｏｓｔ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌｇｅｎｅｓｉｌｅｎｃｉｎｇ，ＰＴＧＳ）或 发 夹 ＲＮＡｉ （ｈａｉｒｐｉｎＲＮＡｉ，ｈｐＲＮＡｉ）［１９２０］。ｈｐＲＮＡ载体在构建时 引入了既彼此接近又被内含子隔开的反向重复片段， 转录时可形成茎部为 ｄｓＲＮＡ结构的发夹茎环结构。 ｄｓＲＮＡ经ＤＣＬ酶作用后能产生多个 ｓｉＲＮＡ。Ｋｈｒａｉｗｅｓｈ 等［２１］将这一方法用于小立碗藓（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａｐａｔｅｎｓ） 时，发现该途径介导的基因沉默并不稳定。另外，Ｄｉｃｅｒ 酶对ｍＲＮＡ的作用位点与 ｓｉＲＮＡ的５′端并非已知，因 此就难以预计出ｈｐＲＮＡ的靶ｍＲＮＡ。 １．４　转录水平的基因沉默 　　ｓｉＲＮＡ或ｍｉＲＮＡ与ｍＲＮＡ相互识别并配对的结果 是转录后基因沉默。当它与 ＤＮＡ结合时，由于 ｓｉＲＮＡ 是一些甲基化转移酶活化的起始信号，甲基化转移酶 在ｓｉＲＮＡ的作用下可使 ＤＮＡ发生甲基化。ＤＮＡ甲基 化主要发生在目的基因５′端的启动子区域［２２］，阻碍转 录因子与启动子的互作，进而影响 ＤＮＡ正常转录，最 终导致转录水平的基因沉默发生（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌｇｅｎｅ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ，ＴＧＳ）。这种通过启动子甲基化来获得基因沉 默的方式在植物中并不常见，因为 ｓｉＲＮＡｓ要求转录的 ｍＲＮＡ作为 模板 个人简介word模板免费下载关于员工迟到处罚通告模板康奈尔office模板下载康奈尔 笔记本 模板 下载软件方案模板免费下载 与其配对，而不是基因组 ＤＮＡ，只有基 因外区域（ｅｘｔｒａｇｅｎｉｃｒｅｇｉｏｎｓ）被偶然转录时才允许发生 转录水平的基因沉默即ＤＮＡ甲基化或染色质修饰［１２］。 ２　ａｍｉＲＮＡｉ的原理 　　植物中既没有自然的 ａｍｉＲＮＡ，也不能自然产生 ａｍｉＲＮＡ，它是由内源 ｍｉＲＮＡ前体加工形成、长为２１ｎｔ 的单链 ＲＮＡ。为达到特异沉默预定靶基因的目的， ａｍｉＲＮＡ需要根据自然ｍｉＲＮＡ选择靶基因时的参数来 设计。１０～１１位是断裂位点，不允许错配；２～１２位只 能有一个错配，该区域与靶ｍＲＮＡ的配对至关重要；１３ 位后的区域不允许有连续错配［１１］；至少要有完全配对 时自由能的７０％，而且绝对杂交能量范围介于３５～ ３８ｋｃａｌ／ｍｏｌ之间，最高不能超过３０ｋｃａｌ／ｍｏｌ［１１］；３′端和 ５′端同时存在错配，会影响 ｍｉＲＮＡ靶向瞄准 ｍＲＮＡ。 另外为了使ａｍｉＲＮＡ与自然ｍｉＲＮＡ相像，ａｍｉＲＮＡ还必 须达到三条标准（ｗｍｄ３．ｗｅｉｇｅｌｗｏｒｌｄ．ｏｒｇ）：（１）５′端相 对ａｍｉＲＮＡ不稳定，即５′端的ＡＵ含量与第１９位碱基 左右的３′端ＧＣ含量都高于 ａｍｉＲＮＡ，以便于 ＲＩＳＣ复 合体与之结合［２３２４］；（２）第１位核苷酸碱基为 Ｕ，第１０ 位为Ａ，因为有５０．９％的自然ｍｉＲＮＡ中第１位与１０位 ９１１ 中国生物工程杂志 ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．３０Ｎｏ．８２０１０ 碱基分别为 Ｕ与 Ａ［２５２６］。（３）为防止传递效应 （ｔｒａｎｓｉｔｉｖｉｔｙ）的产生，即防止沉默作用范围扩大， ａｍｉＲＮＡ还必须在 ３′端的 １８～２１位引入 １～２个错 配［７］。用于设计 ａｍｉＲＮＡ分子的 ＷＭＤ软件正是在此 基础上开发出来的。此外前体 ｍｉＲＮＡ区还必须经过 适当的修饰，使最终的 ａｍｉＲＮＡａｍｉＲＮＡ 双体与 ｍｉＲＮＡｍｉＲＮＡ双体的结构特征与能量特征都能保持 不变［７］。 ２．１　ａｍｉＲＮＡ分子设计及其克隆 　　２００９年６月 Ｗｅｉｇｅｌ等在 ｗｍｄ３．ｗｅｉｇｅｌｗｏｒｌｄ．ｏｒｇ上 发布了 ＷｅｂｍｉｃｒｏＲＮＡｄｅｓｉｇｎｅｒ３（ＷＭＤ３）以优化 ａｍｉＲＮＡ的自动设计。该软件可利用已公布的转录本 和ＥＳＴ数据库，分别为未作注释的转录本、外源基因以 及特异剪接形式的ｍＲＮＡ设计ａｍｉＲＮＡ；通过与数据库 中转录本序列进行比对，可识别出允许的非预期靶基 因。ＷＭＤ３在杂交能量计算与 ａｍｉＲＮＡ结果排序等方 面作了改进。 　　ＷＭＤ３可根据最终选定的 ａｍｉＲＮＡ自动设计出４ 条合适的引物序列。利用这 ４条引物可人工合成 ａｍｉＲＮＡ，进而导入受体中表达，使ａｍｉＲＮＡａｍｉＲＮＡ代 替ｍｉＲＮＡｍｉＲＮＡ。克隆过程需有含 ｍｉＲＮＡ前体的 载体，目前ＷＭＤ３中有ｐＲＳ３００，ｐＮＷ５５，ｐＣｈｌａｍｉＲＮＡ２， ｐＣｈｌａｍｉＲＮＡ３等载体。现以ｐＲＳ３００为例说明 ａｍｉＲＮＡ 的分子克隆原理。该质粒含有拟南芥 ｍｉＲ３１９ａ前体， 可作为ＰＣＲ模板。ａｍｉＲＮＡ前体可通过重叠延伸 ＰＣＲ 合成（图１）。第一轮 ＰＣＲ首先扩增出引物 ＡＩＶ，ＩＩ ＩＩＩ，ＩＢ的产物ａ、ｂ、ｃ片段，随后第二轮ＰＣＲ以Ａ、Ｂ为 引物，以 ａ、ｂ、ｃ３个片段为模板，合成覆盖整个前体的 片段ｄ，其中引物Ａ、Ｂ由模板质粒序列设计而来，序列 分别为：“ＣＴＧＣＡＡＧＧＣＧＡＴＴＡＡＧＴＴＧＧ ＧＴＡＡＣ”，“ＧＣＧＧＡＴＡＡＣＡＡＴＴＴＣＡＣＡＣＡＧＧＡＡＡＣＡ Ｇ”［２７］。引物Ａ、Ｂ均结合于 ｐＢＳＫ多克隆位点以外的 区域，以利于合成较大的ＰＣＲ产物。ｐＢＳＫ中的多克隆 位点可用来酶切释放ａｍｉＲＮＡ前体，常用的是前体５′端 的ＥｃｏＲⅠ和３′端的ＢａｍＨⅠ。将修饰后的 ａｍｉＲＮＡ前 体构建到植物表达载体中，转化植物使之超量表达。 ２．２　ａｍｉＲＮＡ的分子作用机制 　　含有目的基因ａｍｉＲＮＡ前体的载体导入植物体后， ａｍｉＲＮＡ区段序列与 ａｍｉＲＮＡ区段序列以及中间一段 间隔序列自动折叠形成发夹状的二级结构，这与反向 重复ＲＮＡ形成ｈｐＲＮＡ的过程十分类似。该二级结构 的茎部包含由 ａｍｉＲＮＡ序列与 ａｍｉＲＮＡ序列形成的 图１　ａｍｉＲＮＡ工程［７］ ｍｉＲＮＡ双体（蓝色部分）到 ａｍｉＲＮＡ双体（红色部分）的转变可 由片段ａ、ｂ、ｃ通过重叠延伸ＰＣＲ实现。（ａ）、（ｂ）、（ｃ）分别是引 物ＡＩＶ，ＩＩＩＩＩ，ＩＢ作用于ｍｉＲＮＡ前体模板的产物。转变过程 中，ａｍｉＲＮＡ保持了ｍｉＲＮＡ的结构特征与能量特征 Ｆｉｇ．１　ＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇｏｆａｍｉＲＮＡｓ Ｔｈｅｅｘｐｅｃｔｅｄ２１ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅａｍｉＲＮＡｄｕｐｌｅｘ（ｒｅｄ）ｗａｓｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ ｔｈｒｏｕｇｈｔｈｅｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇＰＣＲ ｏｎｔｈｅｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓｏｆｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｍｉＲＮＡｓ（ｂｌｕｅ）．Ｔｈｅｔｒａｎｓｉｔｉｏｎｗａｓａｃｈｉｅｖｅｄｂｙａ，ｂ，ｃｆｒａｇｍｅｎｔｉｎ ａｓｉｎｇｌｅｒｅａｃｔｉｏｎｗｉｔｈｐｒｉｍｅｒｓＡａｎｄＢ．Ｂｏｔｈｓｔｒｕｃｔｕｒａｌａｎｄｅｎｅｒｇｅｔｉｃ ｆｅａｔｕｒｅｓｏｆｍｉＲＮＡ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｗｅｒｅ ｒｅｔａｉｎｅｄ． ａ， ｂ， ｃ ａｒｅ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇｐｒｏｄｕｃｔｓｏｆｐｒｉｍｅｒＡＩＶ，ＩＩＩＩＩ，ＩＢ ｄｓＲＮＡ。 　　新形成的ａｍｉＲＮＡ双体部分在结构上继承了原有 ｍｉＲＮＡ双体中错配凸起的典型特征。不论凸起结构的 数量还是凸起结构在前体中的相对位置，两者都是相 同的，这种结构的相似性与能量的稳定性为 ＤＣＬ酶准 确加工 ａｍｉＲＮＡ前体创造了有利条件［２８］。因此， ａｍｉＲＮＡ前体经ＤＣＬ酶剪切产生的 ａｍｉＲＮＡ双体中的 ａｍｉＲＮＡ序列就正是具有目的设计特征的 ａｍｉＲＮＡ （图２）。 　　与普通小 ＲＮＡ的选择原理相似的是，ａｍｉＲＮＡ双 体也倾向于将其中５′端不稳定的一条链导入 ＡＧＯ蛋 白中，并形成ＲＩＳＣ复合体的核心组件［７］。该复合体中 ａｍｉＲＮＡ起引导作用，它能根据序列碱基互补原理，将 整个ＲＩＳＣ复合体带到靶ｍＲＮＡ上，从而导致靶 ｍＲＮＡ 的断裂或翻译抑制。对于多个靶基因来说，它们在序 列上可以完全一致，也可以有略微差异［１２］。根据上述 ａｍｉＲＮＡ分子设计时的各项错配参数可知，错配也可出 现不同的位置组合。在 ａｍｉＲＮＡ对靶基因表达的负调 控中，抑制ｍＲＮＡ的翻译只起次要作用［７］，ｍＲＮＡ断裂 引起的转录本降解是多数植物 ｍｉＲＮＡ或 ｓｉＲＮＡ的主 要作用方式，这一特点与自然小 ＲＮＡ一样。靶 ｍＲＮＡ 在距离ａｍｉＲＮＡ的５′端１０～１１个碱基处发生断裂。在 ａｍｉＲＮＡ过表达植株中，多数靶基因的转录本都大幅下 调，并引起靶基因沉默的表型变化。目前还没有开发 出利用多个ａｍｉＲＮＡ使同一靶基因沉默的技术，它将进 ０２１ ２０１０，３０（８） 叶梅霞 等：ａｍｉＲＮＡｉ实现高效稳定的特异基因沉默新方法 图２　ａｍｉＲＮＡ的分子作用机制示意图 （引自ｈｔｔｐ：／／ｗｍｄ３．ｗｅｉｇｅｌｗｏｒｌｄ．ｏｒｇ／ｃｇｉｂｉｎ／ ｗｅｂａｐｐ．ｃｇｉ，并略作修改） ａｍｉＲＮＡ表达盒中，发夹状茎环结构的 ａｍｉＲＮＡ前体转录后，在 ＤＣＬ酶的作用下形成 ａｍｉＲＮＡ双体，随后 ａｍｉＲＮＡ双体结合到 ＲＩＳＣ复合体中，最终引发目标ｍＲＮＡ的断裂 Ｆｉｇ．２　Ｔｈｅｓｃｈｅｍａｔｉｃｄｉａｇｒａｍｏｆｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆａｃｔｉｏｎｆｏｒａｍｉＲＮＡ ａｍｉＲＮＡｐｒｅｃｕｒｓｏｒｗｉｔｈａｈａｉｒｐｉｎｓｔｅｍｌｏｏｐｓｔｒｕｃｔｕｒｅｅｘｐｒｅｓｓｅｄｆｒｏｍ ｔｈｅａｍｉＲＮＡｃａｓｓｅｔｔｅｗｅｒｅｐｒｏｃｅｓｓｅｄｂｙＤＣＬｅｎｚｙｍｅｔｏｔｈｅａｍｉＲＮＡ ｄｕｐｌｅｘ，ｗｈｉｃｈｗａｓｓｕｂｓｅｑｕｅｎｔｌｙｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄｔｏｔｈｅＲＩＳＣ，ｔｒｉｇｇｅｒｉｎｇ ｔｈｅｃｌｅａｖａｇｅｏｆｔｈｅｍＲＮＡ 一步提高ａｍｉＲＮＡ的沉默效率。由于完全互补或只有 部分互补的 ｓｉＲＮＡ都能作用于目标 ｍＲＮＡ，最终导致 ｍＲＮＡ的断裂，所以多个 ｓｉＲＮＡ同时沉默同一靶基因 的情况对ｓｉＲＮＡ来说却是非常普遍［７］。 ２．３　ａｍｉＲＮＡ的沉默效率 　　大量研究表明，ａｍｉＲＮＡ靶基因的转录水平与 ａｍｉＲＮＡ水平呈明显的负相关关系，ａｍｉＲＮＡ过表达能 引起大多数靶基因转录水平的大幅下调，并出现相应 的表型变异，但各表型的变化程度不一致。同一 ａｍｉＲＮＡ的不同靶ｍＲＮＡ都可被成功下调，但下调程度 也不尽相同。ｍＲＮＡ在空间位阻较大以及二级结构较 紧密的条件下难以与ａｍｉＲＮＡ结合，这是导致沉默效率 差异的重要原因；另一种可能的原因就是靶基因受到 了强烈的负反馈调节［７］，无论ａｍｉＲＮＡ的数量和效率多 高，靶基因的转录水平都不会大幅下降。Ｋｈｒａｉｗｅｓｈ 等［２１］提出自然ｍｉＲＮＡ与ａｍｉＲＮＡ两者在与ＲＩＳＣ复合 体结合时可能存在竞争关系，因而造成不同ａｍｉＲＮＡ对 各个靶基因的调控程度不一。ａｍｉＲＮＡ常以数量方式 介导基因沉默，强启动子通常能诱导更高效的基因沉 默［７，２９］。如用ＭＬ１启动子与３５Ｓ启动子时靶基因的下 调程度有明显差异［７］。Ｗａｒｔｈｍａｎｎ等［３０］对水稻三个基 因（Ｓｐｌ１１，Ｐｄｓ，Ｅｕｉ１）分别采用了两种 ａｍｉＲＮＡ载体，结 果发现同一基因的两种 ａｍｉＲＮＡ载体沉默效率也存在 显著差别。目前 ａｍｉＲＮＡ高效表达载体的构建是 ａｍｉＲＮＡ技术应用领域研究的热点之一［２８，３１３２］。 ３　ａｍｉＲＮＡｉ技术的优势 ３．１　沉默效应的可预见性 　　ｓｉＲＮＡ由Ｄｉｃｅｒ酶切割长链 ｄｓＲＮＡ产生，但 Ｄｉｃｅｒ 酶在长链ｄｓＲＮＡ上的作用位点并不为人所知，而且作 为ｓｉＲＮＡ前体的长链ｄｓＲＮＡ可被 Ｄｉｃｅｒ切成多个具有 不同序列的 ｓｉＲＮＡ。这样 ｓｉＲＮＡ就能作用于不同的 ｍＲＮＡ，从而使ｓｉＲＮＡ介导的沉默效应变得难以预测。 ａｍｉＲＮＡ双体序列与 ｍｉＲＮＡ双体序列虽然相差甚远， 但两者在结构与能量上却有共性。所以ＤＣＬ酶对前体 的剪切位点能保持不变，与 ｓｉＲＮＡ前体相比，ａｍｉＲＮＡ 前体就具备了只产生一个 ａｍｉＲＮＡ的优势［３３］。 ａｍｉＲＮＡ与ｍｉＲＮＡ一样，只作用于特定的靶转录本，当 ａｍｉＲＮＡ负调控多基因表达时，其沉默效应的可预见性 得到了充分体现。拟南芥 ａｍｉＲＮＡ不论是介导单个靶 基因的沉默还是介导多个靶基因沉默，其成功率可达 到７５％［１２］。ＡＲＦ（ａｕｘｉｎｒｅｓｐｏｎｓｅｆａｃｔｏｒｓ）基因除了促进 花发育、维管发育、细胞生长之外，还可促进植物的侧 生器官分化为远轴组织。Ａｌｖａｒｅｚ等用 ａｍｉＲＮＡＡＲＦ沉 默拟南芥、烟草、番茄这三种植物的 ＡＲＦ２、ＡＲＦ３、ＡＲＦ４ 基因，结果发现所有这些植物中都有出现近轴组织变 为远轴组织的现象［２９］。Ｑｕ等对黄瓜花叶病毒 （ｃｕｃｕｍｂｅｒｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓ，ＣＭＶ）的沉默设计了阻遏２ｂ基 因的ａｍｉＲＮＡ，并以ｈｐＲＮＡ途径与之比较抗病效果，结 果发现ａｍｉＲＮＡ对 ＣＭＶ病毒的抵御能力是 ｈｐＲＮＡ的 两倍［３４］。因此 ａｍｉＲＮＡｉ技术可在不影响其他基因表 达的条件下，为基因功能的研究开辟一条便捷高效的 新途径。 ３．２　ａｍｉＲＮＡ作用的非传递性 　　ｓｉＲＮＡ不仅可以诱发靶转录本的断裂，还有充当 ＲｄＲｐ引物的可能。ｍＲＮＡ断裂产物中也有一些可充 当ＲｄＲｐ的引物，进而参与二级 ｓｉＲＮＡ的形成［３５］，而不 是被降解。其原因是ｓｉＲＮＡ能与靶转录本实现完全互 补［７］，这样，部分ｄｓＲＮＡ就可在该引物的作用下延伸形 成更长的ｄｓＲＮＡ，然后由Ｄｉｃｅｒ酶再次加工形成更多的 ｓｉＲＮＡ，并参与到沉默各个不同靶基因的过程中［３６］。 沉默作用范围扩大的过程被称为传递（ｔｒａｎｓｉｔｉｖｉｔｙ），或 者二级ＲＮＡｉ效应。 １２１ 中国生物工程杂志 ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．３０Ｎｏ．８２０１０ 　　ａｍｉＲＮＡ设计时在１８～２１位引入的１～２个碱基 错配［１２］，能大幅度减少ａｍｉＲＮＡ充当ＲｄＲｐ酶引物的可 能性。因此，ａｍｉＲＮＡｉ不会引起二级ｓｉＲＮＡ的产生［３７］， 不会扩大沉默作用范围。此外，ａｍｉＲＮＡ在引发预期靶 ｍＲＮＡ沉默的同时，也不会影响其他基因的正常表达。 ３．３　ａｍｉＲＮＡｉ的细胞自控效应 　　ｓｉＲＮＡ具有强大的细胞穿透能力，它可通过植物大 分子运输系统进行系统扩散传递［３８］，这种穿透不同类 型组织和细胞的现象就是系统性的 ＲＮＡ干扰。比如 病毒 ｓｉＲＮＡ可在远端引起整个植株的沉默，即使最初 只在局部接种病毒［３６，３９］。因而利用ｓｉＲＮＡ介导的基因 沉默途径来鉴定空间特异性表达的基因功能会产生适 得其反的结果。 　　ａｍｉＲＮＡ和自然 ｍｉＲＮＡ一样［７］，与 ｓｉＲＮＡ存在以 下两方面的差异，这两方面构成了ａｍｉＲＮＡ的细胞自控 效应（ｃｅｌｌａｕｔｏｎｏｍｏｕｓｅｆｆｅｃｔ）。首先，ａｍｉＲＮＡ能在诱导 型启动子驱动下表达，表现出时间特异性，即基因表达 的瞬时敲除。Ｓｃｈｗａｂ等采用乙醇响应诱导表达系统， 用乙醇处理转入 ａｍｉＲｗｈｉｔｅ１（抑制叶绿素的合成）和 ａｍｉＲｔｒｉｃｈｏｍｅ（抑制表皮毛的形成）的拟南芥幼苗，３ 天内表现出了预期表型。撤除乙醇后５天，幼苗新生 幼嫩部位又重新分别恢复成绿色和密被柔毛［７］。其 次，在组织特异型启动子控制下，ａｍｉＲＮＡ的沉默效应 仅仅局限于特异组织内。同样在 Ｓｃｈｗａｂ的实验中， ＡＰ１：ａｍｉＲｗｈｉｔｅ１株系仅出现花色变浅的表型变异。 ａｍｉＲＮＡ的细胞自控效应有时也存在不完全的情况，但 这种效应甚是微弱［７］。ＧＵＮ４基因可作为叶绿素合成 的一个辅助因子，当以该基因为靶标的ａｍｉＲｗｈｉｔｅ１在 表皮特异型启动子 ＭＬ１驱动下表达时，拟南芥幼苗同 样也出现了黄化现象。由于叶绿体只分布于表皮下叶 肉细胞中，由此可推断出ａｍｉＲｗｈｉｔｅ１能至少跨越一层 细胞。实验中还出现了叶缘部分颜色淡于叶中部的现 象。由于叶缘的细胞层数少于叶片的其他部位，因此 这也支持了ａｍｉＲＮＡ的非自控效应只可小范围移动的 结论。 ３．４　ａｍｉＲＮＡ过表达的遗传稳定性 　　转基因的目的是使外源基因能够在受体植物中世 代稳定遗传并改良某些性状，但转基因植物中有时也 可能存在外源转基因沉默的现象［４０］，转入 ｄｓＲＮＡ的植 物中就有这种情况。转入ｄｓＲＮＡ后会导致内源基因的 沉默和功能丧失［４１］，ａｍｉＲＮＡｉ能避免此现象的发生。 生物体内的ｍｉＲＮＡ及其前体一般不参与转录沉默［３３］， 所以受体植株在转入 ａｍｉＲＮＡ前体之后，ａｍｉＲＮＡ前体 不会发生自行沉默，其子代能产生相同的 ａｍｉＲＮＡ。 Ｍｏｌｎａｒ等为了探究 ａｍｉＲＮＡ是否能够避免靶基因的功 能丧失，测定了第５００代衣藻 ｐＣｈｌａｍｉＲＮＡ２转化株中 ＤＣＬ１基因沉默的稳定性，结果表明各转化株都保持了 高水平产生ａｍｉＲＮＡ的能力，也就是 ａｍｉＲＮＡ的过表达 能被稳定遗传。对小立碗藓的ＰｐＦｔｓＺ２１ａｍｉＲＮＡ株系 进行继代培养表明，一年后仍然没有一株恢复ＰｐＦｔｓＺ２ １基因的野生型性状［２１］。 ４　ａｍｉＲＮＡｉ技术的潜在应用 ４．１　ａｍｉＲＮＡｉ在基因家族研究中的应用 　　ａｍｉＲＮＡ能沉默多个靶基因已被多项研究证 明［７，２９，４２］。基因组进化过程中某些基因能通过复制形 成双拷贝或多拷贝，要实现这些基因同时沉默，ａｍｉＲＮＡ 技术的优势就显得尤为突出。许多功能相关的基因常 成套组合，如相互靠近的串联重复基因，它们会对遗传 筛选造成限制。基因家族中各成员由于具有功能相似 性，其他成员可弥补被敲除基因的功能，因而利用以往 的基因敲除技术来确定基因家族中特异基因的功能会 受到其他成员功能的干扰。ａｍｉＲＮＡ设计时由于充分 考虑到了多种错配，ａｍｉＲＮＡ与各靶基因之间的互补 位点并不一定要完全相同［１２］，比如基因家族中各成员 与同一ａｍｉＲＮＡ间的互补位点就并不完全一致，所以 ａｍｉＲＮＡ不仅允许序列上完全一致的靶基因同时沉默， 而且还能使靶序列上存在少数几个碱基差异的靶基因 同时沉默，解决基因家族的冗余问题。 ４．２　ａｍｉＲＮＡｉ在可变剪接研究中的应用 　　基因表达往往伴随着 ＲＮＡ的剪接过程，可变剪接 是调节基因表达和产生蛋白质多样性的重要机制，目 前人们对其调节机制还知之不多。拟南芥中约有１０％ 的基因具有多种剪接形式［４３］，由于靶 ｍＲＮＡ对 ａｍｉＲＮＡ的识别元件很短，所以 ａｍｉＲＮＡ可用于沉默特 异剪接形式的靶基因。ａｍｉＲＮＡ分子不具有传递性 （ｔｒａｎｓｉｔｉｖｉｔｙ），因此就不会发生二级 ｓＲＮＡ作用于多种 不同ｍＲＮＡ剪接异构体的情况，导致特异 ｍＲＮＡ剪接 形式的选择性沉默失败。 ４．３　ａｍｉＲＮＡｉ在反义ＲＮＡ功能研究中的应用 　　ＤＮＡ双链变性分开后，一条链转录成作为翻译蛋 白的模板即正义 ＲＮＡ，另一条链尽管不携带编码蛋白 的信息，但也能产生反义ＲＮＡ与正义ＲＮＡ互补。以往 普遍认为反义 ＲＮＡ没有利用价值，但现在发现它能阻 ２２１ ２０１０，３０（８） 叶梅霞 等：ａｍｉＲＮＡｉ实现高效稳定的特异基因沉默新方法 断其正义ＲＮＡ的表达，而且证实这种阻断不是 ＲＮＡｉ。 自然形成的反义转录本对相应的有义链可起重要调节 因子的作用，虽然目前尚无沉默反义转录本的技术，但 由于 ａｍｉＲＮＡ对靶标具有特异性［１２］，可以实现特异沉 默反义 ＲＮＡ或正义 ＲＮＡ，有利于分析正义 ＲＮＡ与反 义ＲＮＡ间的相互作用。 ４．４　ａｍｉＲＮＡｉ在植物抗病中的应用 　　ＲＮＡｉ不仅可以作用于植物的 ! 源基因，也可以使 外源的同源基因发生沉默。以往都是采用发夹式 ＲＮＡｉ来抵御病毒的侵扰。这种抗病策略而今可以被 ａｍｉＲＮＡ所取代，可根据病毒致病基因或病毒抑制蛋白 基因设计出 ａｍｉＲＮＡ转入植物，并诱发对病毒 ＲＮＡ的 降解［３４，４４］。芜菁黄花叶病毒（ｔｕｒｎｉｐｙｅｌｌｏｗｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓ ，ＴＹＭＶ）的 Ｐ６９和芜菁花叶病毒（ｔｕｒｎｉｐｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓ， ＴｕＭＶ）的ＨＣＰｒｏ是两个有名的基因沉默抑制子。有 研究者以Ｐ６９和ＨＣＰｒｏ的病毒ｍＲＮＡ序列为靶标，利 用拟南芥 ｍｉＲ１５９前体设计出了相应的 ａｍｉＲＮＡ，并通 过ａｍｉＲＮＡ的表达使其转化植株获得了抵御 ＴＹＭＶ和 ＴｕＭＶ病毒感染的能力［３４，４４］。 ５　展　望 　　随着越来越多的物种基因组测序工作的相继完 成，后基因组时代已经来临，探索基因功能、明确各基 因间的相互作用及其生物学机制已经成为生命科学研 究的焦点之一。以往鉴定基因功能所采用的基因敲除 技术，通常是以破坏基因结构或抑制基因表达的方式 来实现的，这种方式的鉴定速度远不及人们期望的那 么快。ａｍｉＲＮＡｉ技术的问世为开展相关工作提供了极 大的便利，它能高效特异地抑制目的基因的表达，加快 基因功能鉴定进程，而且使研究者对功能缺失表型进 行长期分析成为可能。ａｍｉＲＮＡｉ避免了普通 ＲＮＡｉ的 脱靶以及非特异性反应等问题，再加上具有方便、快 捷、高通量筛查等优点，因此备受许多研究者青睐。作 为一种新型的基因沉默技术，它的应用必将加快功能 基因组与反向遗传学的研究进程。随着基因工程的日 益发展，各种遗传转化技术的改进，以及 ａｍｉＲＮＡ载体 的开发，将使ａｍｉＲＮＡｉ的应用范围得到进一步拓展，如 为各种信号传导通路研究提供新的策略，研究ａｍｉＲＮＡｉ 定点基因治疗，以及生物性状的基因负调控等。总之， ａｍｉＲＮＡｉ技术的诞生和不断完善，不仅是在普通 ＲＮＡｉ 基础上实现的又一重大突破，而且还将成为揭示生物 体基因表达调控本质的又一新的里程碑。 参考文献 ［１］ＨａｎｎｏｎＧＪ．ＲＮＡｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ．Ｎａｔｕｒｅ，２００２，４１８（６８９４）： ２４４２５１． ［２］ＭｅｉｓｔｅｒＧ，ＴｕｓｃｈｌＴ．Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓｏｆｇｅｎｅｓｉｌｅｎｃｉｎｇｂｙｄｏｕｂｌｅ ｓｔｒａｎｄｅｄＲＮＡ．Ｎａｔｕｒｅ，２００４，４３１（７００６）：３４３３４９． ［３］ＢｉｒｍｉｎｇｈａｍＡ，ＡｎｄｅｒｓｏｎＥＭ，ＲｅｙｎｏｌｄｓＡ，ｅｔａｌ．３＇ＵＴＲｓｅｅｄ ｍａｔｃｈｅｓ，ｂｕｔｎｏｔｏｖｅｒａｌｌｉｄｅｎｔｉｔｙ，ａｒｅａｓｓｏｃｉａｔｅｄｗｉｔｈＲＮＡｉｏｆｆ ｔａｒｇｅｔｓ．ＮａｔＭｅｔｈｏｄｓ，２００６，３（３）：１９９２０４． ［４］ＣｈｉＪＴ，ＣｈａｎｇＨＹ，ＷａｎｇＮＮ，ｅｔａｌ．Ｇｅｎｏｍｅｗｉｄｅｖｉｅｗｏｆ ｇｅｎｅｓｉｌｅｎｃｉｎｇｂｙｓｍａｌｌｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇＲＮＡｓ．ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳ Ａ，２００３，１００（１１）：６３４３６３４６． ［５］ＺｅｎｇＹ，ＷａｇｎｅｒＥＪ，ＣｕｌｌｅｎＢＲ．Ｂｏｔｈｎａｔｕｒａｌａｎｄｄｅｓｉｇｎｅｄ ｍｉｃｒｏＲＮＡｓｃａｎｉｎｈｉｂｉｔｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｃｏｇｎａｔｅｍＲＮＡｓｗｈｅｎ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄｉｎｈｕｍａｎｃｅｌｌｓ．ＭｏｌＣｅｌｌ，２００２，９（６）：１３２７１３３３． ［６］ＰａｒｉｚｏｔｔｏＥＡ，ＤｕｎｏｙｅｒＰ，ＲａｈｍＮ，ｅｔａｌ．Ｉｎｖｉｖｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎｏｆ ｔｈｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ， ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ， ｅｎｄｏｎｕｃｌｅｏｌｙｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ， ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｒｅｌｅｖａｎｃｅｏｆｔｈｅｓｐａｔｉａｌｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｏｆａｐｌａｎｔｍｉＲＮＡ． ＧｅｎｅｓＤｅｖ，２００４，１８（１８）：２２３７２２４２． ［７］ＳｃｈｗａｂＲ，ＯｓｓｏｗｓｋｉＳ，ＲｉｅｓｔｅｒＭ，ｅｔａｌ．Ｈｉｇｈｌｙｓｐｅｃｉｆｉｃｇｅｎｅ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇｂｙａｒｔｉｆｉｃｉａｌｍｉｃｒｏＲＮＡｓｉｎＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ．ＰｌａｎｔＣｅｌｌ， ２００６，１８（５）：１１２１１１３３． ［８］ＢａｒｔｅｌＤＰ．ＭｉｃｒｏＲＮＡｓ：ｇｅｎｏｍｉｃｓ，ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ，ｍｅｃｈａｎｉｓｍ，ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｃｅｌｌ，２００４，１１６（２）：２８１２９７． ［９］ＭｙｅｒｓＪＷ，ＪｏｎｅｓＪＴ，ＭｅｙｅｒＴ，ｅｔａｌ．ＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＤｉｃｅｒ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙｃｏｎｖｅｒｔｓｌａｒｇｅｄｓＲＮＡｓｉｎｔｏｓｉＲＮＡｓｓｕｉｔａｂｌｅｆｏｒｇｅｎｅ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ．ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２００３，２１（３）：３２４３２８． ［１０］ＶａｕｃｈｅｒｅｔＨ，ＶａｚｑｕｅｚＦ，ＣｒｅｔｅＰ，ｅｔａｌ．Ｔｈｅａｃｔｉｏｎｏｆ ＡＲＧＯＮＡＵＴＥ１ｉｎｔｈｅｍｉＲＮＡｐａｔｈｗａｙａｎｄｉｔｓｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｂｙｔｈｅ ｍｉＲＮＡｐａｔｈｗａｙａｒｅｃｒｕｃｉａｌｆｏｒｐｌａｎｔｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．ＧｅｎｅｓＤｅｖ， ２００４，１８（１０）：１１８７１１９７． ［１１］ＳｃｈｗａｂＲ，ＰａｌａｔｎｉｋＪＦ，ＲｉｅｓｔｅｒＭ，ｅｔａｌ．Ｓｐｅｃｉｆｉｃｅｆｆｅｃｔｓｏｆ ｍｉｃｒｏＲＮＡｓｏｎｔｈｅｐｌａｎｔｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ．ＤｅｖＣｅｌｌ，２００５，８（４）： ５１７５２７． ［１２］ＯｓｓｏｗｓｋｉＳ，ＳｃｈｗａｂＲ，ＷｅｉｇｅｌＤ．Ｇｅｎｅｓｉｌｅｎｃｉｎｇｉｎｐｌａｎｔｓｕｓｉｎｇ ａｒｔｉｆｉｃｉａｌｍｉｃｒｏＲＮＡｓａｎｄｏｔｈｅｒｓｍａｌｌＲＮＡｓ．ＰｌａｎｔＪ，２００８，５３ （４）：６７４６９０． ［１３］ＩｚａｎｔＪＧ，ＷｅｉｎｔｒａｕｂＨ．Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｏｆｔｈｙｍｉｄｉｎｅｋｉｎａｓｅｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｂｙａｎｔｉｓｅｎｓｅＲＮＡ：ａｍｏｌｅｃｕｌａｒａｐｐｒｏａｃｈｔｏｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｃｅｌｌ，１９８４，３６（４）：１００７１０１５． ［１４］崔欣，陈庆山，杨庆凯，等．植物转基因沉默与消除．植物学通 报，２００２，１９（３）：３７４３７９． ＣｕｉＸ，ＣｈｅｎＱＳ，ＹａｎｇＱＫ，ｅｔａｌ．ＣｈｉｎｅｓｅＢｕｌｌｅｔｉｎｏｆＢｏｔａｎｙ， ２００２，１９（３）：３７４３７９． ［１５］ＪｏｒｇｅｎｓｅｎＲＡ，ＤｏｅｔｓｃｈＮ，ＭｕｌｌｅｒＡ，ｅｔａｌ．Ａｐａｒａｇｅｎｅｔｉｃ ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｏｎｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎｏｆＲＮＡｓｉｌｅｎｃｉｎｇｉｎｔｏｔｈｅｅｐｉｇｅｎｏｍｅ ３２１ 中国生物工程杂志 ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．３０Ｎｏ．８２０１０ ａｎｄｉｔｓｒｏｌｅｉｎｔｈｅｂｉｏｌｏｇｙｏｆｈｉｇｈｅｒｐｌａｎｔｓ．ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂ ＳｙｍｐＱｕａｎｔＢｉｏｌ，２００６，７１：４８１４８５． ［１６］ＷａｔｓｏｎＪＭ，ＦｕｓａｒｏＡＦ，ＷａｎｇＭ，ｅｔａｌ．ＲＮＡｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｐｌａｔｆｏｒｍｓｉｎｐｌａｎｔｓ．ＦＥＢＳＬｅｔｔ，２００５，５７９（２６）：５９８２５９８７． ［１７］曾晓珊，戴良英，刘雄伦，等．ｄｓＲＮＡ介导植物基因沉默及其 应用．生命科学，２００７，１９（２）：１３２１３８． ＺｅｎｇＸＳ，ＤａｉＬＹ，ＬｉｕＸＬ，ｅｔａｌ．ＣｈｉｎｅｓｅＢｕｌｌｅｔｉｎｏｆＬｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００７，１９（２）：１３２１３８． ［１８］傅达奇，朱本忠，赵晓丹，等．植物中病毒诱导基因沉默的研 究进展．中国生物工程杂志，２００５，（增刊）：６２６６． ＦｕＤＱ，ＺｈｕＢＺ，ＺｈａｏＸＤ，ｅｔａｌ．ＣｈｉｎｅｓｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ２００５，ｓｕｐｐｌ：６２６６． ［１９］ＷｅｓｌｅｙＳＶ，ＨｅｌｌｉｗｅｌｌＣＡ，ＳｍｉｔｈＮＡ，ｅｔａｌ．Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｄｅｓｉｇｎ ｆｏｒｅｆｆｉｃｉｅｎｔ，ｅｆｆｅｃｔｉｖｅａｎｄｈｉｇｈｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔｇｅｎｅｓｉｌｅｎｃｉｎｇｉｎ ｐｌａｎｔｓ．ＰｌａｎｔＪ，２００１，２７（６）：５８１５９０． ［２０］ＣｈｕａｎｇＣＦ，ＭｅｙｅｒｏｗｉｔｚＥＭ．Ｓｐｅｃｉｆｉｃａｎｄｈｅｒｉｔａｂｌｅｇｅｎｅｔｉｃ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅｂｙｄｏｕｂｌｅｓｔｒａｎｄｅｄＲＮＡｉｎＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ． ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ，２０００，９７（９）：４９８５４９９０． ［２１］ＫｈｒａｉｗｅｓｈＢ，ＯｓｓｏｗｓｋｉＳ，ＷｅｉｇｅｌＤ，ｅｔａｌ．Ｓｐｅｃｉｆｉｃｇｅｎｅ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇｂｙａｒｔｉｆｉｃｉａｌＭｉｃｒｏＲＮＡｓｉｎＰｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａｐａｔｅｎｓ：ａｎ ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅｔｏｔａｒｇｅｔｅｄｇｅｎｅｋｎｏｃｋｏｕｔｓ．ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ，２００８，１４８ （２）：６８４６９３． ［２２］ＡｕｆｓａｔｚＷ，ＭｅｔｔｅＭＦ，ｖａｎｄｅｒＷｉｎｄｅｎＪ，ｅｔａｌ．ＲＮＡｄｉｒｅｃｔｅｄ ＤＮＡｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎｉｎＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ．ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ， ２００２，９９Ｓｕｐｐｌ４：１６４９９１６５０６． ［２３］ＳｃｈｗａｒｚＤＳ，ＨｕｔｖａｇｎｅｒＧ，ＤｕＴ，ｅｔａｌ．Ａｓｙｍｍｅｔｒｙｉｎｔｈｅ ａｓｓｅｍｂｌｙｏｆｔｈｅＲＮＡｉｅｎｚｙｍｅｃｏｍｐｌｅｘ．Ｃｅｌｌ，２００３，１１５（２）： １９９２０８． ［２４］ＫｈｖｏｒｏｖａＡ，ＲｅｙｎｏｌｄｓＡ，ＪａｙａｓｅｎａＳＤ．ＦｕｎｃｔｉｏｎａｌｓｉＲＮＡｓａｎｄ ｍｉＲＮＡｓｅｘｈｉｂｉｔｓｔｒａｎｄｂｉａｓ．Ｃｅｌｌ，２００３，１１５（２）：２０９２１６． ［２５］ＲｅｙｎｏｌｄｓＡ，ＬｅａｋｅＤ，ＢｏｅｓｅＱ，ｅｔａｌ．ＲａｔｉｏｎａｌｓｉＲＮＡｄｅｓｉｇｎｆｏｒ ＲＮＡｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ．ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２００４，２２（３）：３２６３３０． ［２６］ＭａｌｌｏｒｙＡ Ｃ，ＲｅｉｎｈａｒｔＢＪ，ＪｏｎｅｓＲｈｏａｄｅｓＭ Ｗ，ｅｔａｌ． ＭｉｃｒｏＲＮＡ ｃｏｎｔｒｏｌｏｆＰＨＡＢＵＬＯＳＡ ｉｎ ｌｅａｆｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ： ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅｏｆｐａｉｒｉｎｇｔｏｔｈｅｍｉｃｒｏＲＮＡ５＇ｒｅｇｉｏｎ．ＥＭＢＯＪ，２００４， ２３（１６）：３３５６３３６４． ［２７］ＳｃｈｗａｂＲ．ＣｌｏｎｉｎｇｏｆａｒｔｉｆｉｃｉａｌｍｉｃｒｏＲＮＡｓ．２００５，ｈｔｔｐ：／／ｗｍｄ３． ｗｅｉｇｅｌｗｏｒｌｄ．ｏｒｇ／ｃｇｉ－ｂｉｎ／ｗｅｂａｐｐ． ［２８］ＺｈａｏＴ，ＷａｎｇＷ，ＢａｉＸ，ｅｔａｌ．Ｇｅｎｅｓｉｌｅｎｃｉｎｇｂｙａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｍｉｃｒｏＲＮＡｓｉｎＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ．ＰｌａｎｔＪ，２００９，５８（１）：１５７ １６４． ［２９］ＡｌｖａｒｅｚＪＰ，ＰｅｋｋｅｒＩ，ＧｏｌｄｓｈｍｉｄｔＡ，ｅｔａｌ．Ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓａｎｄ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃｍｉｃｒｏＲＮＡｓｓｔｉｍｕｌａｔｅ ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ， ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ， ａｎｄ ｌｏｃａｌｉｚｅｄｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｍｕｌｔｉｐｌｅｔａｒｇｅｔｓｉｎｄｉｖｅｒｓｅｓｐｅｃｉｅｓ．Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ，２００６，１８（５）：１１３４１１５１． ［３０］ＷａｒｔｈｍａｎｎＮ，ＣｈｅｎＨ，ＯｓｓｏｗｓｋｉＳ，ｅｔａｌ．Ｈｉｇｈｌｙｓｐｅｃｉｆｉｃｇｅｎｅ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇｂｙａｒｔｉｆｉｃｉａｌｍｉＲＮＡｓｉｎｒｉｃｅ．ＰＬｏＳＯＮＥ，２００８，３（３）： ｅ１８２９． ［３１］ＬｉｕＣ，ＺｈａｎｇＬ，ＳｕｎＪ，ｅｔａｌ．ＴｈｅａｒｔｉｆｉｃｉａｌｍｉｃｒｏＲＮＡｍｅｄｉａｔｅｓ ＧＵＳＧＦＰ ｇｅｎｅ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｕｓｉｎｇ ａｔｈｍｉＲ１６９ｄ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒａｓ ｂａｃｋｂｏｎｅ．ＬｉｆｅＳｃｉＪ，２００９，６（２）：１７． ［３２］ＨｕＴ，ＣｈｅｎＰ，ＭａＬ，ｅｔａｌ．Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆａｎａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｍｉｃｒｏＲＮＡｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒｆｏｒｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｏｆｍｕｌｔｉｐｌｅ ｇｅｎｅｓｉｎｍａｍｍａｌｉａｎｃｅｌｌｓ．ＩｎｔＪＭｏｌＳｃｉ，２００９，１０：２１５８２１６８． ［３３］ＭｏｌｎａｒＡ，ＢａｓｓｅｔｔＡ，ＴｈｕｅｎｅｍａｎｎＥ，ｅｔａｌ．Ｈｉｇｈｌｙｓｐｅｃｉｆｉｃｇｅｎｅ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇｂｙ ａｒｔｉｆｉｃｉａｌｍｉｃｒｏＲＮＡｓ ｉｎ ｔｈｅ ｕｎｉｃｅｌｌｕｌａｒａｌｇａ Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ．ＰｌａｎｔＪ，２００９，２００９，５８（１）：１６５ １７４． ［３４］ＱｕＪ，ＹｅＪ，ＦａｎｇＲ．ＡｒｔｉｆｉｃｉａｌｍｉｃｒｏＲＮＡｍｅｄｉａｔｅｄｖｉｒｕｓ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｉｎｐｌａｎｔｓ．ＪＶｉｒｏｌ，２００７，８１（１２）：６６９０６６９９． ［３５］ＨｏｗｅｌｌＭＤ，ＦａｈｌｇｒｅｎＮ，ＣｈａｐｍａｎＥＪ，ｅｔａｌ．Ｇｅｎｏｍｅｗｉｄｅ ａｎａｌｙｓｉｓｏｆｔｈｅＲＮＡｄｅｐｅｎｄｅｎｔＲＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ６／ＤｉｃｅｒＬｉｋｅ４ ｐａｔｈｗａｙｉｎＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｒｅｖｅａｌｓｄｅｐｅｎｄｅｎｃｙｏｎｍｉＲＮＡａｎｄ ｔａｓｉＲＮＡｄｉｒｅｃｔｅｄｔａｒｇｅｔｉｎｇ．ＰｌａｎｔＣｅｌｌ，２００７，１９（３）：９２６９４２． ［３６］ＶｏｉｎｎｅｔＯ．ＮｏｎｃｅｌｌａｕｔｏｎｏｍｏｕｓＲＮＡｓｉｌｅｎｃｉｎｇ．ＦＥＢＳＬｅｔｔ， ２００５，５７９（２６）：５８５８５８７１． ［３７］ＬｕＣ，ＴｅｊＳＳ，ＬｕｏＳ，ｅｔａｌ．ＥｌｕｃｉｄａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｓｍａｌｌＲＮＡ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｏｆｔｈｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００５，３０９（５７４０）： １５６７１５６９． ［３８］ＹｏｏＢＣ，ＫｒａｇｌｅｒＦ，ＶａｒｋｏｎｙｉＧａｓｉｃＥ，ｅｔａｌ．Ａｓｙｓｔｅｍｉｃｓｍａｌｌ ＲＮＡｓｉｇｎａｌｉｎｇｓｙｓｔｅｍｉｎｐｌａｎｔｓ．ＰｌａｎｔＣｅｌｌ，２００４，１６（８）： １９７９２０００． ［３９］ＪｏｎｅｓＬ，ＨａｍｉｌｔｏｎＡＪ，ＶｏｉｎｎｅｔＯ，ｅｔａｌ．ＲＮＡＤＮＡｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ａｎｄＤＮＡｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎｉｎｐｏｓｔｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌｇｅｎｅｓｉｌｅｎｃｉｎｇ．Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ，１９９９，１１（１２）：２２９１２３０１． ［４０］ＲｏｍａｎｏＮ，ＭａｃｉｎｏＧ．Ｑｕｅｌｌｉｎｇ：ｔｒａｎｓｉｅｎｔｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎｏｆｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎＮｅｕｒｏｓｐｏｒａｃｒａｓｓａｂｙｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｗｉｔｈｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．ＭｏｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌ，１９９２，６（２２）：３３４３３３５３． ［４１］ＲｏｈｒＪ，ＳａｒｋａｒＮ，ＢａｌｅｎｇｅｒＳ，ｅｔａｌ．Ｔａｎｄｅｍｉｎｖｅｒｔｅｄｒｅｐｅａｔ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒｓｅｌｅｃｔｉｏｎｏｆｅｆｆｅｃｔｉｖｅｔｒａｎｓｇｅｎｉｃＲＮＡｉｓｔｒａｉｎｓｉｎ Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ．ＰｌａｎｔＪ，２００４，４０（４）：６１１６２１． ［４２］ＣｈｏｉＫ，ＰａｒｋＣ，ＬｅｅＪ，ｅｔａｌ．Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｈｏｍｏｌｏｇｓｏｆ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓｏｆｔｈｅＳＷＲ１ｃｏｍｐｌｅｘｒｅｇｕｌａｔｅｆｌｏｗｅｒｉｎｇａｎｄｐｌａｎｔ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，２００７，１３４（１０）：１９３１１９４１． ［４３］ＩｉｄａＫ，ＳｅｋｉＭ，ＳａｋｕｒａｉＴ，ｅｔａｌ．Ｇｅｎｏｍｅｗｉｄｅａｎａｌｙｓｉｓｏｆ ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅｐｒｅｍＲＮＡｓｐｌｉｃｉｎｇｉｎＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａｂａｓｅｄｏｎ ｆｕｌｌｌｅｎｇｔｈｃＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ，２００４，３２ （１７）：５０９６５１０３． ［４４］ＮｉｕＱＷ，ＬｉｎＳＳ，ＲｅｙｅｓＪＬ，ｅｔａｌ．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｍｉｃｒｏＲＮＡｓｉｎ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ ｃｏｎｆｅｒｓｖｉｒｕｓ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ．ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２００６，２４（１１）：１４２０１４２８． ４２１ ２０１０，３０（８） 叶梅霞 等：ａｍｉＲＮＡｉ实现高效稳定的特异基因沉默新方法 ａｍｉＲＮＡｉ：ＡＮｅｗＡｐｐｒｏａｃｈｆｏｒＨｉｇｈｌｙＳｐｅｃｉｆｉｃａｎｄＳｔａｂｌｅＧｅｎｅＳｉｌｅｎｃｉｎｇ ＹＥＭｅｉｘｉａ　ＬＩＵＪｕｎｍｅｉ　ＬＩＨａｏ　ＣＵＩＤｏｎｇｑｉｎｇ　ＷＡＮＧＪｉｎｇｃｈｅｎｇ　ＺＨＡＮＧＺｈｉｙｉ　ＡＮＸｉｎｍｉｎ （ＮａｔｉｏｎａｌＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇＬａｂｏｒａｔｏｒｙｆｏｒＴｒｅｅＢｒｅｅｄｉｎｇ；ＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＧｅｎｅｔｉｃｓａｎｄＢｒｅｅｄｉｎｇｉｎＦｏｒｅｓｔＴｒｅｅｓａｎｄ ＯｒｎａｍｅｎｔａｌＰｌａｎｔｓ，ＭｉｎｉｓｔｒｙｏｆＥｄｕｃａｔｉｏｎ；ＴｈｅＴｒｅｅａｎｄＯｒｎａｍｅｎｔａｌＰｌａｎｔＢｒｅｅｄｉｎｇａｎｄＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆＳｔａｔｅＦｏｒｅｓｔｒｙＡｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ，ＢｅｉｊｉｎｇＦｏｒｅｓｔｒｙＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｂｅｉｊｉｎｇ　１０００８３，Ｃｈｉｎａ） 　　Ａｂｓｔｒａｃｔ　ＲＮＡｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ（ＲＮＡｉ）ｉｓａｎｅｆｆｉｃｉｅｎｔｔｏｏｌｆｏｒｇｅｎｅｓｉｌｅｎｃｉｎｇ．Ｄｕｅｔｏｅｎｏｒｍｏｕｓａｄｖａｎｃｅｏｆ ｍｏｌｅｃｕｌａｒｂｉｏｌｏｇｙａｎｄｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙａｃｈｉｅｖｅｄｉｎｒｅｃｅｎｔｙｅａｒｓ，ｉｔｈａｓｅｖｏｌｖｅｄｉｎｔｏａｎｏｔｈｅｒｅｘｃｅｌｌｅｎｔｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｆｏｒ ｇｅｎｅｓｉｌｅｎｃｉｎｇｗｉｔｈ ｈｉｇｈｅｒｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙｃａｌｌｅｄ ａｒｔｉｆｉｃｉａｌｍｉｃｒｏＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ（ａｍｉＲＮＡｉ）． ａｍｉＲＮＡ， ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ２１ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓｌｏｎｇ，ｗｈｉｃｈｃｏｕｌｄｂｅｇｅｎｅｒａｔｅｄｂｙｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓｍｉＲＮＡｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ，ｃａｎｍｅｄｉａｔｅｔｈｅ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇｏｆｓｉｎｇｌｅｏｒｍｕｌｔｉｐｌｅｇｅｎｅｓｔａｒｇｅｔｅｄｗｉｔｈｏｕｔａｆｆｅｃｔｉｎｇｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｏｆｕｎｒｅｌａｔｅｄｇｅｎｅｓ．Ｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｔｈｅ ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌＲＮＡｉ，ｔｈｉｓｎｏｖｅｌｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｈａｓａｄｖａｎｔａｇｅｓｏｆｈｉｇｈｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ，ｓａｔｉｓｆａｃｔｏｒｙｓｔａｂｉｌｉｔｙａｓｗｅｌｌａｓ ｐｒｅｃｉｓｅｐｒｅｄｉｃｔａｂｉｌｉｔｙｏｆｓｉｌｅｎｃｉｎｇｅｆｆｅｃｔ．ＴｈｕｓｔｈｅａｍｉＲＮＡｉｄｅｆｉｎｉｔｅｌｙｐｒｏｖｅｓｔｏｂｅｏｎｅｏｆｔｈｅｍｏｓｔｐｏｗｅｒｆｕｌｔｏｏｌｓ ｆｏｒｔｈｅｆｕｎｃｔｉｏｎａｌａｎａｌｙｓｉｓｏｆｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓｇｅｎｅｓ．Ａｌｓｏｉｔｐｒｏｍｉｓｅｓａｂｒｉｇｈｔｆｕｔｕｒｅｆｏｒｂｏｔｈｓｔｕｄｙａｎｄａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆｇｅｎｅｓ’ｎｅｇａｔｉｖｅｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ．ＴｈｅｖｅｒｙｐｒｉｎｃｉｐｌｅｏｆａｍｉＲＮＡｉｗａｓｒｅｖｉｅｗｅｄａｎｄｉｔｓｓｕｐｅｒｉｏｒｉｔｙａｎｄｐｏｔｅｎｔｉａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｗｅｒｅｄｉｓｃｕｓｓｅｄ． 　　Ｋｅｙｗｏｒｄｓ　ａｍｉＲＮＡｉ　ｍｉＲＮＡ　ｓｉＲＮＡ　Ｇｅｎｅｓｉｌｅｎｃｉｎｇ 慕尼黑上海分析生化展于北京召开新闻发布会 　　２０１０年８月５日，慕尼黑上海分析生化展项目组在北京召开了新闻发布会，即将召开的２０１０年慕尼黑上海分析生化展 最新情况。发布会由慕尼黑展览（上海）有限公司高级项目经理路王斌先生主持，慕尼黑展览（上海）有限公司董事总经理 毛大奔先生和安捷伦科技（中国）有限公司大中华区化学分析市场部经理何峻先生先后发言。毛大奔先生介绍了展会最新 情况：截止７月３１日，已有来自１９个国家和地区的４５０家企业报名参加２０１０年慕尼黑上海分析生化展，展会展览面积达 ２００００平方米，预计专业观众可达１５０００名。自从２００２年第一届慕尼黑