TP53基因突变及WT1基因在多发性骨髓瘤中的表达及其临床意义

  TP53基因突变及WT1基因在多发性骨髓瘤中的表达及其临床意义  【Summary】目的探讨初诊多发性骨髓瘤（MM）患者中TP53基因突变及WT1基因阳性表达的临床意义。 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 收集132例在我院2015-2019年初诊的MM患者临床资料，并对其骨髓标本行TP53基因荧光原位杂交（FISH）检测，聚合酶链式反应(PCR)技术行WTI基因检测。结果TP53基因突变阳性的患者，在初诊MM患者中共检测出13例，阳性率为9.85%。TP53基因突变与WT1基因阳性表达有关，与性别、年龄大小、分型、ISS分期、血小板数值、乳酸脱氢酶、血沉快慢、骨髓浆细胞比例、白蛋白、球蛋白、β2-微球蛋白计数无关(P<0.05)；初诊MM患者中出现WT1基因阳性共44例，阳性率3.33%，与患者血清肌酐、β2-微球蛋白有关(P<0.05)。TP53基因突变患者的治疗有效率低于TP53基因未突变患者，且TP53基因突变的MM患者的OS与未突变患者相比明显缩短(P<0.05)。在TP53基因突变的MM患者中，含有来那度胺治疗组的患者疗效比不含来那度胺组患者疗效好。结论TP53基因突变阳性的MM患者更易出现WT1基因表达。TP53基因突变可作为MM患者预后不良的独立影响指标；WT1基因阳性表达也可作为评估MM预后不良的另一个参数，预测MM患者病情的进展及预后，加用来那度胺治疗TP53基因突变阳性的MM患者有望提高有效率，延长患者的生存期。Keys：多发性骨髓瘤；TP53；基因突变；WT1TP53genemutationandWT1geneexpressioninmultiplemyelomaandtheirclinicalsignificanceWANGMeng,CHENXiaofeng,ZHUFangbing,ZHOULili,LIZhongyu,ZHANGPingpingLIJiajia(DepartmentofHematology，TheFirstAffiliatedHospitalofBengbuMedicalCollege,Bengbu,233000,China)【Abstract】ObjectiveThesubjectofthestudyconcernsaclinicalchangeintheTP53geneandtheWT1geneinanumberofnewsubjects.MethodsTheclinicaldatawerecollectedfrom132patientswithmultiplemyelomainourhospitalfrom2015to2019,andtheirbonemarrowsamplesweretestedforTP53genebyFISHandPCRtechnologyforWTIgenedetection.ResultsInthirteennewlydiagnosedmultiplemyelomapatients,TP53genemutationwaspositivewithapositiverateof9.85%.TP53genemutationwasassociatedwithWT1geneexpression,butnotwithgender,age,typing,ISSstaging,platelet,albumin,globulin,lactatedehydrogenase,ureanitrogen,erythrocytesedimentationrate,myelomacellratio,2-microglobulin,whilethehighexpressionofWT1geneisrelatedtothevalueofcreatinineandβ2-microglobulin.ThetherapeuticefficacyofpatientswithTP53genemutationwaslowerthanthatofpatientswithoutTP53genemutation.Meanwhile,AmongMMpatientswithmutationsintheTP53gene,patientsinthetreatmentgroupwithlenalidomidehadbetterefficacythanthoseinthetreatmentgroupwithoutlenalidomide.ForpatientswithTP53genemutation,theoverallsurvival(OS)ofmultiplemyelomapatientswithTP53genemutationissignificantlyshorterthanthatofpatientswithoutTP53genemutation(P<0.05).ConclusionPatientswithTP53genemutationstendtohaveaWT1geneexpression.TP53genemutationcanbeusedasanindependentindicatorofpoorprognosisofMMpatients;positiveexpressionofWT1genecanalsobeusedasanotherparameterforevaluatingpoorprognosisofMM,predictingtheprogressionandprognosisofpatientswithmultiplemyeloma,andaddingnallidomidetotreatTP53Patientswithpositivegenemutationsareexpectedtoincreasetheeffectiverateandprolongthesurvivaltimeofpatients.【Keywords】:Multiplemyeloma;TP53;Genemutations;WT1多发性骨髓瘤（Multiplemyeloma，MM）是一种终末期血液系统恶性肿瘤，与浆细胞的分化相关，患者的典型表现为大量单克隆浆细胞在骨髓中增殖，血清和/或尿液中有单克隆蛋白，可引起骨质破坏、贫血、高钙及肾功能损害［1］。化疗是治疗MM的基本手段，传统化疗效果差，新型药物的应用及技术手段的问世可能会改善患者生存期［2］。近年来随着分子生物学技术的高速发展，传统的检测技术用于评价MM后分层技术，如球蛋白技术、β2-微球蛋白等已经逐步被取代，现在新的NCCN指南更多的推荐使用荧光原位杂交（Fluorescenceinsituhybridization，FISH）、聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction,PCR)、染色体等检查技术用于评估患者的分期、分组及预后积分系统。因浆细胞特有的生物学性质，MM患者的分子遗传学比起其他实体肿瘤更容易出现基因突变或出现新的基因表达，与MM的疾病进展、治疗及预后具有相关性。TP53基因突变在MM中出现被认为是一种预后不良的高危特征[3-4]，而WT1基因位于11p13染色体，有研究发现在在MM中具有原癌活性[5]，但两者在MM中的相关性较少有报道。在本研究中探讨了我院收治的132例MM患者的遗传特性，并总结了TP53基因突变患者及WT1基因阳性表达在MM患者中的临床意义。1. 材料 关于××同志的政审材料调查表环保先进个人材料国家普通话测试材料农民专业合作社注销四查四问剖析材料 与方法1.1病例资料回顾性 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 132例在2015年1月至2019年12月蚌埠医学院第一附属医院血液科收治的初治MM患者的病例资料，其中男性73例，女性59例，年龄在34岁至68岁，中位年龄63岁。治疗前所有MM患者均签署化疗同意 书 关于书的成语关于读书的排比句社区图书漂流公约怎么写关于读书的小报汉书pdf 。MM的诊断及疗效标准遵循2020版《中国多发性骨髓瘤诊治指南》［6］。疾病分期使用多发性骨髓瘤ISS分期标准。收集132例患者的基本临床信息，具体资料见表2,并记录患者的治疗方案及疗效。所有患者在初诊时均行骨髓穿刺，行骨髓细胞学、骨髓流式细胞学、骨髓病理及免疫组化等，并行血清及尿游离轻链、免疫固定电泳等检查，将患者骨髓标本送至我科实验室进行WT1基因PCR检测，步骤如下：RT-PCR反应引物由上海申友生物技术有限责任公司合成（RNAPQ-PCR），按照PCR反应试剂盒进行操作，PCR反应条件如下：42℃反应37min，96℃反应5min，94℃下持续15秒，60℃下持续60秒，共40次循环。结束后在37℃下保持1min，反应完毕后收集数据处理。同时将患者骨髓标本送至合肥金域医学检验实验室有限公司金域公司行TP53基因突变FISH检测，位点特异性GIP探针检TP53缺失。具体实验步骤如下：将探针在75℃恒温水浴中温育5min，0℃双链DNA探针变性,50℃中烤片2-3h,浸润在70-75℃70%的甲酰胺/2×SSC的溶液中,冰乙醇脱水，干燥。37℃过夜，约12-18小时。50%甲酰胺溶液/2×ssc，1×SSC溶液中洗涤，干燥，复染。在可见光视野中找到具有分裂象的视野，打开荧光激发器，观察荧光探针染色情况，与正常分裂相对比。计数500个，计算异常分裂相比例。1.2随访所有患者每3个月采用门诊、电话等方式进行随访，随访时间截止到2019年12月31日或患者出现任何原因的死亡，中位随访时间为20（10-38.25）个月。总生存(Overallsurvival，OS)：患者从确诊MM到出现死亡或失访、随访截止时间。1.3疗效评估：本研究MM疗效评估采用的指标为总缓解率（OverallResponseRate,ORR）；ORR：经过联合化疗后患者病情达到完全缓解和部分缓解的总例数，将此病人总例数与总的可以评价得病例数所占的比例。1.4统计学方法所有的数据使用SPSS22.0软件进行统计分析。采用Mann-WhitneyU检验来统计非正态分布的计量资料，数据以中位数（范围）表示；采用卡方检验或者Fisher精确概率法进行差异性分析分类资料;Kaplan-Meier法绘制生存曲线。双侧检验P＜0.05是差异统计学意义。2结果2.1TP53基因突变情况及WT1基因检出率分析：对132例MM患者进行分析，TP53基因突变（见图1A）患者13例，阳性率9.85%，WT1基因阳性（见图1B）患者44例，阳性率3.33%（见表1）表1各基因缺失检出率Table1Detectionrateofdeletionofeachgene基因类型阳性例数阳性比例TP53基因突变139.85%WT1突变443.33%图1A红色荧光标签TP53(17p13.1)探测器,当绿色荧光标签CEP17探针,正常的信号模式2G2R(红色信号R,G为绿色信号)。Figure1ARedfluorescentlabelTP53(17p13.1)detector,whilegreenfluorescentlabelCEP17probe,normalsignalmode2G2R(redsignalR,Gforgreensignal).图1B1为ABL基线，2为WT1基WT1曲线高于ABL基线时，判定为阳性。Figure1B1isABLbaseline,and2isWT1-basedwhenWT1curveishigherthanABLbaseline,itisdeterminedtobepositive.2.2临床指标分析：TP53基因突变与年龄、性别、ISS分期、白细胞、血红蛋白多少、血小板数值、骨髓瘤浆细胞比例、白蛋白、球蛋白、LDH、β2-微球蛋白、血沉、总钙离子、肌酐等无关，WT1基因表达与肌酐、β2-微球蛋白有关（见表2）。表2TP53、WT1基因正常与异常值的临床特征比较Table2ComparisonofclinicalcharacteristicsofnormalandabnormalvaluesofTP53andWT1genes特征TP53基因突变阳性（n=119）TP53基因突变阴性（n=13）统计值PWT1基因阴性（n=88）WT1基因阳性（n=44）统计值P年龄61.71±9.760±7.520.54161.93±9.7060.75±9.130.502性别男6851.6550.19846270.9810.322女5184217分期(ISS)Ⅰ603.1860.203512.3940.302Ⅱ311248Ⅲ82125935实验室指标白细胞计数（×１０９／Ｌ）6.03±5.584.67±1.750.4380.3865.99±6.405.71±2.021.3460.776血红蛋白（ｇ／Ｌ）84.24±24.8581.00±19.244.0980.38685.69±24.2380.36±24.370.5670.237血小板（×１０９／Ｌ）151.98±84.06174.92±76.60.0210.585154.96±88.40152.82±73.200.8250.89骨髓浆细胞比例（％）31.33±19.9744.15±18.80.0030.02933.45±19.9330.86±20.720.0350.495白蛋白（ｇ／Ｌ）32.94±7.3635.37±7.210.0460.26033.19±7.3133.17±7.510.100.991球蛋白（ｇ／Ｌ）55.08±30.2455.43±30.470.96855.2±30.7554.95±29.260.0060.964血肌酐（umol/l）162.62±212.72202.54±295.922.200.539124.77±130.94250.11±321.941.04710.016血钙（ｍｍｏｌ／Ｌ）2.35±0.4419.03±60.0845.5180.3374.74±23.112.49±0.441.7600.519乳酸脱氢酶230.78±216.44172.54±66.20.9430.338213.42±128.57248.3±310.532.5020.364血β２－微球蛋白（ｍｇ／Ｌ）7.63±6.9910.72±9.595.8720.2795.87±5.5012.17±8.6728.931＜0.001血沉(mm/1h)76.9±42.7882.46±36.442.1870.65375.02±42.9482.3±40.431.0020.3512.3TP53基因突变与WT1基因表达之间的关系：TP53基因突变与WT1基因表达有关系，TP53基因突变的MM患者WT1基因阳性率高（见表3）。表3TP53基因突变与WT1基因突变的关系Table3TherelationshipbetweenTP53genemutationandWT1genemutation特征TP53基因突变阳性TP53基因突变阴性PWT1基因阴性8350.023WT1基因阳性3682.4患者方案选择及疗效：对于本研究收集的13例TP53基因突变MM患者中，含有来那度胺治疗组患者比不含来那度胺组患者ORR好（见表4）；所有MM患者治疗1个疗程后评估，TP53基因突变患者ORR较TP53基因未突变组ORR差（见表5）。表4来那度胺治疗TP53基因突变患者疗效比较Table4ComparisonoftheefficacyoflenalidomideinpatientswithTP53genemutation分组例数总缓解情况ORR含来那度胺组5360%不含来那度胺组8450%表5TP53基因突变患者与无TP53基因突变患者疗效比较Table5ComparisonofefficacybetweenpatientswithTP53genemutationandpatientswithoutTP53genemutation分组例数总缓解情况ORRTP53基因突变患者13753.8%不含TP53基因突变患者1197865.5%2.5患者生存分析：TP53基因突变患者OS较TP53基因未突变患者预后差，同时WT1基因阳性患者OS也是缩短的（见图2）。图2TP53基因突变和WT1基因与总生存的相关性分析Figure2CorrelationanalysisofTP53genemutationandWT1genewithoverallsurvivalA:TP53基因突变与总生存。B:WT1基因和总生存率。3.讨论MM仍是不能彻底治愈的恶性血液肿瘤且具有异质性，现有的治疗方法包括化疗、放疗、免疫、CAR-T、造血干细胞移植等，但是有效率低，因此选择适当的指标正确的评价患者的预后，可能在精准治疗及患者生存期上起到关键作用[7]。现有的明确MM预后指数有肾功能[8]、TP53突变[9]、乳酸脱氢酶[10]等，但精准的预后分层仍在探索中，需要寻找更多的指标来进行预后评估并选择相应的分层治疗。在本项研究中，对132例MM患者进行遗传学异常的结果进行分析，结果提示TP53基因突变患者预后较差，与2018版mSMART3.0危险分层[11]一致。TP53基因是一个位于17号染色体短臂的抑癌基因，此基因一旦出现17p13的缺失，就会出现基因的突变，是MM患者的预后不良的高危指标之一[12,13]，与骨髓瘤细胞多个部位的浸润、髓外疾病的存在和较短的生存期有关[14,15]。本研究中TP53缺失的检出率为9.85%,和CigdemA等人报道研究［16］的TP53基因突变在MM中的检出率为12.3%基本一致。在PerumalGovindasamy等人的研究中[17]，同样提示了TP53基因突变的MM患者预后不良。我们知道，WT1基因在急性白血病中的表达可以预测患者的疾病进展及预后的判断[18]，本研究统计了MM患者的WT1基因的表达情况，1990年HABER等[19]人首次发现WT1基因，是最早发现与Wilms’瘤发生发展相关的基因，编码一个具有锌指结构的转录因子，位于11p13染色体上，具有抑癌和原癌双重活性[20,21]。本研究中WT1基因阳性率为3.33%，与李静等人[22]研究报道基本一致，在研究中发现WT1基因的表达与MM患者的血肌酐、β2-微球蛋白有统计学意义，提示WT1基因阳性的MM患者更容易出现血肌酐升高、β2-微球蛋白升高，肾功能损害。同时本研究还提示了TP53基因突变MM患者WT1基因阳性率高，但样本量少，目前国内未见文献报道其两者之间关系的分析，有待我们继续收集更多的数据去研究佐证。在本研究中，比较含来那度胺治疗组与不含来那度胺治疗组TP53基因突变阳性MM患者的疗效，含来那度胺治疗组的总体有效率高，且不良反应相对较少，对于年龄较大患者耐受性更好。有部分研究证实，联合使用免疫调节剂可提高MM患者的疾病缓解率，如来那度胺、蛋白酶体抑制剂硼替佐米等药物，可延长患者生存时间［23］，在初治及复发难治MM患者中使用来那度胺或硼替佐米联合传统化疗药物均可取得较高的缓解率，现已被批准用于初治MM患者[24]，方案推荐可以选择来那度胺联合地塞米松、硼替佐米联合地塞米松等两药联合方案，但我们的研究结果表明，对于TP53基因突变阳性的MM患者可能使用硼替佐米、来那度胺及地塞米松三药联合组患者疗效更好，可以取得更高的缓解率，延长患者生存时间。IFM2009的研究中表明［25］，来那度胺等免疫调节剂的使用联合自体造血干细胞移植组的MM患者的微小残留病变（minimalresidualdisease，MRD）阴性率及PFS较单纯来那度胺化疗组均有显著改善，尽管患者的OS没有显著性差异。4.结论：随着新的诊断技术的发展，MM患者的诊断更加精准化，分子遗传学为患者的合理用药提供有力证据，TP53基因突变患者疗效欠佳，总体预后差；MM患者中伴有WT1基因表达,会影响患者肾功能的恢复，可以作为独立的预后评判指标；新药的不断问世，如来那度胺、CD38单抗等，给患者的治疗方案选择提供了多样性，可延长部分患者生存期。Reference[1]KumarSK,RajkumarV,KyleRA,etal.Multiplemyeloma. NatRevDisPrimers.2017;3:17046.[2]FranssenLE,MutisT,LokhorstHM,etal.Immunotherapyinmyeloma:howfarhavewecome?[J].TherapeuticAdvancesinHematology,2019,10:1-16.[3]THAKURTAA,ORTIZM,BLECUAP,etal.Highsubclonalfractionof17pdeletionisassociatedwithpoorprognosisinMultipleMyeloma[J].Blood,2019,133(11):1217-1221.[4]KIMM,JUYS,LEEEJ,etal.AbnormalitiesinChromosomes1qand13IndependentlyCorrelateWithFactorsofPoorPrognosisinMultipleMyeloma[J].AnnLabMed,2016,36(6):573-582.[5]ZhangL,LiY,LiX,etal.RegulationofHtrA2onWT1geneexpressionunderimatinibstimulationanditseffectsonthecellbiologyofK562cells[J].OncologyLetters,2017,14(3):3862.[6]中国医师协会血液科医师分会,中华医学会血液学分会,中国医师协会多发性骨髓瘤专业委员会.中国多发性骨髓瘤诊治指南（2020年修订）［J］.中华内科杂志,2020,59（5）:341-346.[7]MikhaelJR，DingliD，RoyV，etal．Managementofnewlydiagnosedsymptomaticmultiplemyeloma:updatedMayoStratificationofMyelomaandRisk－AdaptedTherapy(mSMART)consensusguidelines2013．MayoClinProc,2013;88(4):360-376.[8]张天琰,张鹂,吴秋慧,等。多发性骨髓瘤合并肾功能损害临床特征及其影响患者预后的相关因素[J]。西部医学，2020，6（32）：887-891.[9]SMangiacavalli,LPochintesta,FCocito,etal.Correlationbetweenburdenof17pl3.1alterationandrapidescapetoplasmacellleukaemiainmultiplemyeloma[J].BritishJHaematol,2013,162：555-558.[10]ChimCS,SimJ,TamS,etal.LDHisanadverseprognosticfactorindependentofISSintransplant-eligiblemyelomapatientsreceivingbortezomib-basedinductionregimens[J].EurJHaematol,2015,94(4)：330-335.[11]陈金花,李微微,姚晓麓,等.以梅奥骨髓瘤分层及风险调适治疗共识指南分层的中高危多发性骨髓瘤患者遗传学特点及预后影响因素分析[J].白血病·淋巴瘤,2019，5:257-261.[12]WalkerBA,MavrommatisK,WardellCP,etal.Ahigh-risk,Double-Hit,groupofnewlydiagnosedmyelomaidentifiedbygenomicanalysis. Leukemia.2019，33(1):159-170.[13]ThanendrarajanS,TianE,QuP,etal.Thelevelofdeletion17pandbi-allelicinactivationof TP53 hasasignificantimpactonclinicaloutcomeinmultiplemyeloma[J]. Haematologica.2017；102(9):e364-e367.[14]RajanAM,RajkumarSV.Interpretationofcytogeneticresultsinmultiplemyelomaforclinicalpractice[J].BloodCancerJ.2015，5(10):e365.[15]TalleyPJ,ChantryAD,BuckleCH.Geneticsinmyeloma:genetictechnologiesandtheirapplicationtoscreeningapproachesinmyeloma[J]. BrMedBull.2015，113(1):15-30.[16]AydinC,UlasT,HangulC,etal.ConventionalCytogeneticsandInterphaseFluorescenceInSituHybridizationResultsinMultipleMyeloma:ATurkeyLaboratoryAnalysisof381Cases[J]. IndianJHematolBloodTransfus.2020，36(2):284-291. [17]GovindasamyP,SharchilC,MohanN,etal.TP53GeneAlterationsincludingCodon72PolymorphisminPatientswithMultipleMyeloma[J].JournalofClinicalandDiagnosticResearch,2018,12(2):GC01-GC05.[18]窦翠云,张继磊,黄倩,等.急性白血病患者WT1基因定量监测与预后的关系[J].中国实验血液学杂志,2018,26(06):62-66.[19]HABERDA,BUCKLERAJ,CLASERT,etal．Anintemaldeletionwithinan11p13zincfingergenecontrihutestothedevelopmentofWilms'tumor[J].Cell,1990,61(7):1257-1269.[20]RAMPALR,FⅠGUEROAME.Wilmstumor1mutationsinthepathogen-esisofacutemyeloidleukemia[J].Haematologica,2016,101(6):672-679.[21]TOSKAE,ROBERTSSG.MechanismsoftranscriptionalregulationbyWT1(Wilms'tumour1)[J].BiochemJ,2014,461(1):15-32.[22]李静,王立立,杨涛,等.WT1基因多态性与多发性骨髓瘤易感的相关性[J].中国肿瘤生物治疗杂志,2019,026(002):225-229.[23]Norbert,Grzasko,Marta,etal.OptimizingtheTreatmentofPatientsWith MultipleMyelomaandRenalImpairment[J].ClinicalLymphomaMyeloma&Leukemia,2015.15(4):187-198.[24]RajkumarSV,KumarS.Multiplemyeloma:diagnosisandtreatment[J].MayoClinProc,2016,91(1):101-119.[25]AttalM,Lauwers-CancesV,HulinC,etal.Lenalidomide,Bortezomib,andDexamethasonewithTransplantationforMyeloma[J].NEnglJMed,2017,376(14):1311-1320.1.基金项目：2019年度安徽高校自然科学研究项目（KJ2019A0358） - 全文 企业安全文化建设方案企业安全文化建设导则安全文明施工及保证措施创建安全文明校园实施方案创建安全文明工地监理工作情况 完-