酵母双杂交系统的原理及发展

第 3卷 第 4 期 漯河职业技术学院学报(综合版) Vol. 3 No14 2004年 12 月 Journal of Luohe Vocational and Technical College ( Comprehensive) Dec12004 收稿日期: 2003- 07- 27 作者简介:张 胜( 1962- ) ,男,河南新蔡县人,漯河职业技术学院高级讲师。 酵母双杂交系统的原理及发展 张 胜 (漯河职业技术学院, 河南 漯河 462002) 摘要:酵母双杂交系统是研究蛋白质相互作用的一种有效方法。本文主要介绍酵母双杂交系统的原理和新的发展, 对其应用及存在的问题也作简要阐述。 关键词:酵母双杂交;蛋白质;相互作用 中图分类号: TS26 文献标识码: A 文章编号: 1671- 7864(2004)04- 0006- 03 分子生物学技术的发展和人类基因组 计划 项目进度计划表范例计划下载计划下载计划下载课程教学计划下载 的完成,使人 类对基因的结构和功能的认识日益加深。但基因的功能最 终由其编码的蛋白质来体现,蛋白质之间的相互作用是生命 现象的基础 ,因而, 以研究蛋白质功能为目的的蛋白质组计 划越来越得到重视。酵母双杂交( yeast two hybrid)技术是利 用酵母遗传学方法分析蛋白质之间的相互作用, 其可行性、 有效性在验证已知蛋白质之间的相互作用或筛选与靶蛋白 特异作用的候选蛋白的研究中已被证实, 并被推广到了诸如 细胞周期调控、信号传导、肿瘤基因 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 达等多个研究领域。 1 酵母双杂交技术的原理和应用 酵母双杂交技术由 Fields等人[ 1]于 1989年提出,该技术 利用了酵母转录因子 GAL4 性质。GAL4 包括两个彼此分离 但功能上必需的结构域, 一个是位于 N端 1- 174 位氨基酸 残基区段的 DNA 结合域(DNA Abinding domain, DNA- BD) , 另 一个是位于 C端 768- 881 位氨基酸残基区段的转录激活域 (Activation domain, AD)。DNA- BD能够识别 GAL4 效应基因 ( GAL4 ) responsive gene) 的上游激活序列 (Upstream activating sequence, UAS) ,并与之结合。而 AD则通过与转录机器( tran2 scription machinery)中的其他成分之间的作用, 启动 UAS下游 的基因进行转录。DNA- BD和 AD单独作用均不能激活转 录反应, 只有当二者在空间上充分接近并呈现完整的 GAL4 转录因子活性时,方可激活 UAS下游启动子。 Fields等人根据 GAL4 的上述性质建立了一个双杂交系 统[1]。该系统中转录激活的条件是蛋白质作为一个整体起 作用,分别经分子克隆技术在同一细胞中表达的 BD 和 AD 多肽不会彼此间发生作用。但 BD和 AD分别可以同其他蛋 白质X 或 Y 结合形成杂种蛋白, 如果 X、Y 之间可以形成蛋 白 ) 蛋白复合物,使 GAL4两个结构域重新构成 AD和 BD 成 为一体,启动特异基因序列的转录。他们利用 Snfl与 Snf4 的 相互作用,将 Snfl与 DB融合, Snf4 与 AD融合,构建在穿梭质 粒上。其中 Snfl是一种依赖于丝氨酸、苏氨酸的蛋白激酶, Snf4是它的一个结合蛋白。研究者将这两种穿梭质粒转化 成酵母 GGY- 171 菌株, 该菌株含有 LacZ 报告 软件系统测试报告下载sgs报告如何下载关于路面塌陷情况报告535n,sgs报告怎么下载竣工报告下载 基因, 并已去 除相应转录因子基因。实验结果由于 Snfl和 Snf4 相互作用 使得AD和 BD在空间上接近,激活了报告基因 LacZ的转录。 一般地,将 DB- X的融合蛋白称作诱饵( bait) , X 往往是已知 蛋白, AD- Y称作猎物( prey) , 能显示诱饵和猎物相互作用的 基因称报告基因,通过对报告基因的检测, 反过来可判断诱 饵和猎物之间是否存在相互作用。根据这一原理, 双杂交系 统通过简便的酵母遗传分析, 对报告基因表型进行检测, 即 可实现对于蛋白质间相互作用的研究。 作为一种分析蛋白质与蛋白质之间相互作用的简便而 有效的研究体系, 酵母双杂交的最大的优点是不需要分离 纯化蛋白质,整个过程只是对核酸进行操作;同时充分利用 酵母生长速度快、易于操作的特点。它主要应用在以下几个 方面: ¹ 用于验证通过其他方法发现的蛋白质之间是否有相 互作用; º 确定已知有生理作用的蛋白间的作用位点或结构 域; » 筛选文库以得到与已知蛋白质存在特异相互作用的候 选蛋白质。双杂交体系自身所具有的特点使其从 cDNA 文库 和基因文库中直接筛选出蛋白质间相互作用由此而鉴定的 各种受体、转录因子、蛋白激酶、磷酸化酶、细胞骨架蛋白以 及参与细胞周期调控、肿瘤发生等恶性疾病的蛋白质已不胜 枚举[3- 8]。 2 双杂交系统的缺陷 尽管酵母双杂交系统已被证实是分析蛋白与蛋白间相 互作用的有效和快速的方法, 有着多方面的应用, 但仍存在 一定的局限性。首先, 它并非对所有蛋白质适用, 这是由其 原理所决定的。双杂交系统分析蛋白间的相互作用定位于 核内 ,而许多蛋白间的相互作用依赖于翻译后加工, 如糖基 化、二硫键形成等,这些反应在核内无法进行。另外,有些蛋 白的正确折叠和功能有赖于其它非酵母蛋白的辅助, 这限制 了某些细胞外蛋白和细胞膜受体蛋白等的研究。虽然目前 已经在表达质粒中插入了核定位序列, 但也不能排除有些必 须在胞质中进行翻译后加工修饰的蛋白, 尤其是胞外蛋白不 第 4期 张 胜:酵母双杂交系统的原理及发展 7 能进入核内 ,有时也会因产生错误构象而影响筛查结果[ 9]。 其次, 是假阳性的发生。Vidalain 等人将筛库过程中遇到的 假阳性分为两类[ 10] :一类是/ 生物学0上的假阳性, 即蛋白质 与蛋白质的相互作用在酵母细胞中发生, 但是在其生物体细 胞内并不发生相互作用。这主要是因为两种蛋白不同时表 达或者二者根本不在同一组织中。这种假阳性, 我们如果对 所研究的蛋白质的生物学特性没有深入了解的话, 是很难排 除的。另一类是/ 技术上0的假阳性, 即由于双杂交技术上的 局限而鉴定出的蛋白质与蛋白质间的相互作用。这类假阳 性包括筛库过程中自发升高的 BD- Y 融合蛋白自我激活导 致的假阳性、AD- Y融合蛋白与多个 BD融合蛋白的表达均 可激活报告基因转录导致的假阳性、BD- Y融合蛋白不存在 的情况下AD- Y融合蛋白单独激活报告基因导致的假阳性 以及酵母中其他蛋白质作用引起的假阳性等[ 11]。有时, 由 于在某些酵母菌株中大量表达外源蛋白质 ,常会带来毒性作 用,影响菌株生长和报告基因的表达。而在培养中添加 3- AT( 3- Aminotriazole)或 6- Azauracil可抑制背景表达, 但这些 添加物对菌株也有一定毒性,从而使一些蛋白质间较弱的相 互作用可能会因此而被掩盖[ 12]。应该注意的是, 虽然双杂 交系统可筛选出大量蛋白质相互作用, 但其中部分蛋白质在 生理状态下可能不发生相互作用,双杂交只是反映蛋白质间 能发生作用的可能性, 这种可能性还必须经过其他实验验 证,尤其要与生理功能研究相结合, 否则可能会误入歧途。 3 酵母双杂交体系的新发展 近年来,双杂交系统在被广泛应用中不断得到改进, 其 灵敏度和特异性得到了显著提高。这些发展主要体现在以 下几个方面。 ( 1)根据酵母的营养缺陷, 发展了多重筛选机制。位于 报告基因上游的启动子是决定报告基因表达灵敏性和特异 性的最重要因素,酵母双杂交系统最初仅采用 p) 半乳糖苷 酶这一单一的报告基因体系,常常不能十分严谨地控制报告 基因的表达,灵敏度也不高。容易产生假阳性, 随后,大多数 酵母双杂交系统利用酵母营养缺陷特点引入额外的报告基 因,如较早发展起来的 Y190[ 13]就采用了 GALl- HIS3、GALl- LacZ双重报告基因, 其中启动子 GALl由包含转录因子 Gal4 的 BD 特异识别位点的上游激活序列 UAS 和基础启动子 (minimaipromoter)组成。营养筛选适宜作为初筛处理大量筛 查对象;颜色筛选则可对杂合蛋白复合体转录激活功能作进 一步验证,易于排除部分假阳性。 ( 2)有性生殖过程中涉及两种配合类型: a 接合型和›接 合型。这两种单倍体之间接合能形成二倍体细胞。根据酵 母有性生殖这一特点, Bendixen等人[ 14]将酵母接合型引入双 杂交体系, 将文库质粒转化成›接合型酵母细胞, / 诱饵0 表 达载体转化, a 接合型细胞, 分别铺筛选平板使待长成菌苔 后,将这两种菌苔复印到同一三重选择平板上, 只有诱饵和 靶蛋白发生相互作用的二倍体细胞方能在此平板上生长, 单 倍体细胞或 DB融合蛋白和 AD 融合蛋白不相互作用的二倍 体细胞都被淘汰,阳性克隆经 B- 半乳糖苷酶活力进一步鉴 定,既简化了实验操作, 也提高了筛选效率。Fromont- Racine 等人[ 15]则直接把这两种细胞在滤膜上混合后铺选择性平 板,避免了繁琐的复印操作, 进一步提高了工作效率。 ( 3)表达载体构建的改进。首先, 双杂交体系中不同载 体原来均采用氨苄抗性作为选择标志, 现在已被改进成具有 耐氨苄、卡那霉素或氯霉素等不同耐药基因的载体[16] , 使得 原来繁琐的从酵母中提取出单一质粒的工作变得轻松快捷。 其次 ,将融合蛋白置于一些可被诱导的启动子调控之下, 使 其表达量能根据需要进行调控[ 17]。再者, 双杂交中一般将 BD或AD与作用蛋白质的 C端及作用蛋白质的 N端连接, 由 于蛋白质的N 端和其活性也有很大关系,对于常规连接找不 到作用蛋白的对象,也可改用 N端连接[ 18]。 (4)筛选文库的优化。用于双杂交筛选的文库除了有代表 每一基因的足够丰富的多样性以外, 由于蛋白质间发生作用的 位点可能为蛋白质多肽链的任意位置, 因而对每一基因而言,还 应当提供尽可能多的与AD连接的位点[11]。为了尽量避免非特 异结合所导致的假阳性的增多,插入的片段也不宜过大, 选用更 适宜的限制性内切酶以构建适用于双杂交体系的文库,这是综 合提高双杂交技术的一个重要方面。 ( 5)逆双杂交系统( reverse two- hybrid system)的出现。在 实际工作中,有时需要通过突变加抑制剂等手段破坏蛋白质 间的相互作用,来研究蛋白质的结构功能特点和作用方式。 Vidal等人的逆双杂交系统[ 19]就是适应这一要求而建立的。 该技术的关键是报道基因 URA3 的引入, URA3 编码尿嘧啶 合成过程中的一种关键酶,此酶可将 5- 氟乳清酸( 5- FOA) 转化为对细胞有毒的物质, 因而在系统中起到反选择的作 用。Vidal等人在URA3 基因的启动子内引入 Gal4 的结合位 点,改造后的酵母菌株在缺乏尿嘧啶的选择性培养基上, 只 有当/ 诱饵0和/ 猎物0相互作用激活URA3基因的表达才能生 长;而在含有 5- FOA的完全培养基上, /诱饵0和/猎物0的相 互作用会抑制细胞的生长。如果目的蛋白发生突变或因外 加药物的干扰不再相互作用, URA3基因不表达, 细胞则能在 含有 5- FOA的完全培养基上生长。因此, 可通过筛选 5- FOA 抗性克隆从随机突变库中鉴定阻断蛋白相互作用的突 变体。通过这种方法, Vidal等人筛选到了丧失 DPI蛋白的结 合能力但仍可结合阳的转录因子 E2F1 的突变物, 并发现了 E2F1 的新 DPI结合位点。 (6)将蛋白的相互作用场所从核内移至细胞膜。为了克服 双杂交系不能研究大量非核内蛋白,如膜受体、细胞外分泌蛋白 等的局限。Aronheim等人[ 20]构建了Sos恢复系统(Sos recruitment system, SRS) ,将蛋白间相互作用场所从核内转移到酵母细胞膜 上。人的鸟苷酸交换因子( guanyl nucleotideexchangefactor, GEF) - Sos蛋白是一种胞质蛋白,而酵母的对应物 cdc25蛋白是膜蛋白, 可将相关受体信号传递给 Ras蛋白。酵母的一种温度敏感- ras 途径突变体由于缺乏 cdc25,不能将外来信号传递给Ras蛋白,在 36e 的温度下不能存活。引入正常的 GEF(Sos蛋白) ,并使其能 与Ras蛋白足够接近,可以补偿该缺陷。为此, Aronheim等人将 GEF蛋白与蛋白X融合,将蛋白Y与豆蔻酰化信号相连,使Y定 位于膜上,若X与Y结合,X连接的蛋白(GEF)就会定位于膜上, 从而得以靠近膜上的Ras蛋白,激活 Ras途径,完成Sos过程,在 36e 情况下生长。该系统大大扩展了经典杂合系统的探索领 域。Aronheim等利用这一系统找到了 c- Jun的两个新的作用蛋 白 JDP1和 JDP2。 ( 7)初步建立了哺乳动物细胞双杂交系统。为了更好地 研究蛋白质生物学功能,需要有一个类似于生理环境的蛋白 质合成、加工及反应体系, 这种需求使双杂交体系扩展到哺 乳动物细胞。在哺乳动物细胞双杂交系统中, 用单纯疱疹病 毒的 VPl6编码区取代 GAL4的 AD 区段, 同时又引入一个含 有氯霉素乙酰转移酶 ( chloramphenicol acetyltransferanse, CAT) 报告基因的表达载体, 其活性可以在细胞提取物中检测, 采 用磷酸钙共沉淀法, 转入 HeLa细胞中进行培养[ 21]。研究者 8 漯河职业技术学院学报 2004 年 运用哺乳动物双杂交系统成功地验证了小鼠 P53 蛋白与 SV40大 T 抗原间蛋白质的相互作用[ 22] , 也检测了 FRAP 与 FKBP12 两种蛋白质之间的相互作用[ 23]。 ( 8)三杂交系统的产生。三杂交系统 ( three - binding hy2 brid system)用于分析蛋白和 RNA间的相互作用, 由 Senguptaxi 等首先报道[ 24] , 其基本原理是将一已知的 RNA 结合蛋白与 转录因子的 DNA 结合 domain(如 LexA)构建第一个融合蛋 白,待选的 RNA结合蛋白与转录激活结构域构建融合蛋白。 此外, 构建和表达含有两个不同的结合位点的杂合 RNA。 RNA与两个 RNA结合蛋白的结合位点的相互作用可激活报 告基因的转录和表达。该系统提供了快速、多用的体内检测 RNA- 蛋白间相互作用的新方法。应用此系统可以分析确 定RNA- 蛋白作用的精确结构域和单个核苷酸或氨基酸残 基。通过构建杂交 RNA库, 可筛选与特定蛋白结合的 RNA。 鉴定和克隆识别结合有重要生理功能 RNA(如转录、定位、 RNA病毒包装和感染等)的蛋白质, 可用于调控的机理研究、 疾病的防治以及抗病毒药物的研制开发。 4 结束语 细胞或组织的蛋白质间的相互作用和相互协调是细胞 进行一切代谢活动的基础,病原体蛋白和机体蛋白质之间的 相互作用则是疾病发生、发展的物质基础。认识生物体系中 纷繁复杂的蛋白质间的联系是蛋白质组研究的重要课题, 迅 速发展的双杂交体系提供了一个获得这些生物学信息的新 途径。随着该体系的不断完善、提高和在应用及处理结果方 面经验的不断积累,以双杂交系统为基础建立的一系列方法 不仅会为生命科学的发展起到积极的推动作用, 同时也将对 揭示某些疾病的发病机制、寻找新的可能的治疗方法做出 贡献。 参考文献: [ 1] Fields S, Song O. A novel genetic system to detect protein- protein interactions. Nature 1989: 245- 246. [ 2] Keegan L, Gill G, Ptashne M. Separation of DNA binding from the transcription- activating function of a eukaryotic regulatory protein. Science, 1986; 231: 699. [ 3] Makela TP, Tassan JP, Nigg EA et al. A cyclin associated with the CDK- activating kinase MOl5. Nature 1994; 371: 254- 7. . [ 4] Bemis, LT, Geske, FJ, and Strange, R. Use of the yeast two- hybrid system for identifying the cascade of protein interactions resulting in apoptotic cell death. Methods Cell Bioi, 1995; 46: 139. [ 5] Kamine J, Elangovan B, Subramanian T, Coleman D, Chinnadurai G. Identification of a cellular protein that specifically interacts with the essential cysteine region of the HIV- 1 Tat transactivator. Virology 1996; 216: 357- 366. [ 6] Spaargaren, M. , Martin, GA, McCormick, F. , Fernandez, SM and Bischoff, J. R ( 1994) . The Ras- related protein R- Ras inter2 acts directly with Raf- 1 in a GTP- dependent manner . Biochem. J 300, 303- 307. [ 7] Mireille Rossignol, lsabelle Kolb- Cheynel, and Jean- Marc Egly Substrate specificity of the cdk- activating kinase (CAK) is altered upon association with TFIIH EMBO J. 1997 16: 1628- 1637. [ 8] Shi ST, Polyak SJ, Tu H, Taylor DR, Gretch DR, LaiMN. Heptitis C vires NS5A colocalizes with the core protein on lipid droplets and interacts with apolipoproteins. Virology 2002; 292: 198- 210. [ 9] Allen JB, WalbergMW, EdwardsMC and Elledge SJ. 1995. Finding prospective patterns in the library: the two- hybrid system and phage display find a match. TIBS 20: 511- 516. [ 10] Vidalain PO, BoxemM, Ge H, Li SM and VidalM. Increasing speci. city in high- throughput yeast two- hybrid experiments. Methods (2004) 32: 363- 370. [ 11] Brent R, Ptashne A eukaryotic transcriptional activator bearing the DNA specificity of a prokaryotic repressor. Ce! l, 1985; 43: 729- 736. [ 12] James P, Halladay J, Craig EA. Genomic libraries and a host strain designed for highly efficient two- hybrid selection in yeast. Genet2 ics 1996; 144: 1425- 1436. [ 13] Harper JW, Adami GR, Wei N, Keyomarsi K, Elledge SJ. The p21 Cdk- interacfing protein Cipl is a potent inhibitor of G 1 cyclin- dependent kinases. Cell. 1993 Nov 19; 75(4) : 805- 16. [ 14] Bendixen C, Gangloff S, Rothstein R. A yeast mating- selection schen}e for detection of protein- protein interactions. Nucleic Acids Res 1994; 22: 1778- 1779. [ 15] Fromont- Racine M, Rain JC, Legrain P. Toward a functional analysis of the yeast genome through exhaustive two- hybrid screens. Nature Genet 1997; 16: 277- 282. [ 16] Watson, M. ; Buckholz, R. ; Weiner, M. Biotechniques 1996, 21, 255- 259[17] Gyuris J et al. Vectors encoding alternative antibi2 otic resistance for use in the yeast two- hybrid system. Biotechniques. Ceil, 1993 ; 75(4) : 791. [ 18] Fields, S. and Sternglanz, R. The two- hybrid system: an assay for protein- protein interactions. Trends in Genetics 1994, 10: 286- 292. [ 19] Vidal M, Brachmann R K, Fattaey A, Hodow E, Boeke JD. Reverse two- hybrid and one- hybrid systems to detect dissociation of protein and protein- DNA interactions. Proc Natl Acad Sci USA 1996; 93: 10315- 10320. [ 20] Aronheim A, Zandi E, Hennemann H, Elledge SJ, Karin M. Isolation of an AP- 1 repressor by a novel method for detecting protein- protein interactions. Mol Cell Biol 1997; 17: 3094- 3102. [ 21] VidalM, Braun P, Chen E, Boeke JD, Harlow E. Genetic characterization of a mammalian protein- protein interaction domain by us2 ing a yeast reverse two- hybrid system. Proc Natl Acid Sci USA 1996; 93: 10321- 10326. [ 22] Chiu M, KatzH, Berin V. RAPTI. a mammalian homolog of yeast Tor, interacts with the FKBP12/ rapamycin complex. Proc Natl Acid Sci USA 1994; 9 i: 12574- 12578. [ 23] Rossi F, Chariton CA, Blau HM. Monitoring protein- protein interactions in intact eukaryotic cells by a- galactosidase compleme nta2 tion. Proc Natl Acad Sci USA 1997; 94: 8405- 8410. [ 24] Sengupta, DJ, Zhang, B. , Kraemer, B. , Pochart, P. , Fields, S. , Wickens, M. (1996) A three- hybrid system to detect RNA- protein interactions in vivo. Proc. Natl Acad. Sci. USA 93, 8496 8501. [责任编校 吴保奎]