2009酶（蛋白质）工程Ch4

null第四章 酶的生物合成法生产第四章 酶的生物合成法生产第一节 酶生物合成法生产的概述 第二节 微生物发酵产酶 第三节 植物细胞培养产酶 第四节 动物细胞培养产酶第一节 酶生物合成法生产的概述第一节 酶生物合成法生产的概述一、酶的生物合成法生产的定义 经过预先 设计 领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计 ，通过人工操作，利用微生物细胞、植物细胞或动物细胞的生命活动而获得人们所需要酶的技术过程，是目前运用最广泛的酶的生产 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 。 二、酶的生物合成法产生的方式和类型 微生物发酵产酶 植物细胞培养产酶 动物细胞培养产酶 第一节 酶生物合成法生产的概述第一节 酶生物合成法生产的概述三、酶生物合成法生产的主要过程 S1.制备优良的产酶细胞 S2.在适宜的培养基中培养，在一定的工艺条件下通过细胞的生命活动进行酶的生物合成 S3.经过分离纯化得到所需的酶1. 获得优良的产酶细胞1. 获得优良的产酶细胞细胞是生物合成法产酶的重要条件，优良细胞不仅能提高酶制剂的产量和培养原料的利用率，而且还与增加品种、缩短生产周期、改进产酶工艺等密切相关。 目前，优良的产酶细胞的获得有三条途径： 从自然界分离筛选 物理和化学方法诱变 基因重组（重组酶）与细胞融合技术 然而不管是诱变，还是用基因工程方法都必须有细胞（微生物）作为 材料 关于××同志的政审材料调查表环保先进个人材料国家普通话测试材料农民专业合作社注销四查四问剖析材料 ，而细胞（微生物）来源于自然界，因此优良产酶细胞的分离筛选是基础。 null酶的产量要高：优良的产酶细胞要具有高产的特性，才能较好的开发应用价值，可以通过筛选、诱变或采用基因重组、细胞融合等技术获得。 容易培养和管理：优良的产酶细胞必须容易生长繁殖，适应性强，易于控制，便于管理。 产酶稳定性好：优良的产酶细胞在正常的生产条件下，要能稳定地生长和产酶，不易退化，一旦发现退化现象，通过适当的处理，可以使其恢复原有的产酶特性。 利于酶的分离纯化：要求产酶细胞和其他杂质容易与酶分离，以便获得所需纯度的酶以满足使用要求。 安全可靠，无毒性：要求产酶细胞及其代谢产物安全无毒，不会对人体和环境产生不良影响，也不会对酶的应用产生其他不良影响。 用于酶的生产的细胞必须具备的条件null 常用于生物合成法制酶的微生物null在实验工作中，为使产酶微生物的筛选达到事半功倍的效果，总的说来可从以下几个途径进行收集和筛选： 向菌种保藏机构索取有关的菌株，从中筛选所需菌株； 由自然界采集样品，如土壤、水、动植物体等，从中进行分离筛选； 从一些发酵制品中分离目的菌株，如从酱油中分离蛋白酶产生菌，从酒酿中分离淀粉酶或糖化酶的产生菌等。该类发酵制品经过长期的自然选择，具有悠久的历史，从这些传统产品中容易筛选到理想的菌株。 菌株的分离和筛选一般可分为采样、富集、分离、产物鉴别几个步骤。 获得这些常用产酶微生物的途径null普通微生物菌种保藏管理中心（CCGMC） 中国科学院微生物研究所，北京（AS）：真菌、细菌 中国科学院武汉病毒研究所，武汉（AS-IV）：病毒 农业微生物菌种保藏管理中心（ACCC） 中国科学院土壤肥料研究所，北京（ISF） 工业微生物菌种保藏管理中心（CICC） 中国食品发酵工业研究所，北京（IFFI） 兽医微生物菌种保藏管理中心（CVCC） 农业部兽医药品监察所，北京（CIVBP） 医学微生物菌种保藏管理中心（CMCC） 中国医学科学院皮肤病研究所，南京（ID）：真菌 卫生部药品生物制品检定所，北京（NICPBP）：细菌 中国医学科学院病毒研究所，北京（IV）：病毒 抗生素菌种保藏管理中心（CACC） 中国医学科学院抗菌素研究所，北京（IA） 四川抗菌素工业研究所，成都（SIA）：新抗菌素菌种 华北制药厂抗菌素研究所，石家庄（IANP）：生产用抗菌素菌种 国内主要微生物保藏单位由自然界采集微生物由自然界采集微生物自然界含菌样品极其丰富，土壤、水、空气、枯枝烂叶、植物病株、烂水果等都含有众多微生物，种类数量十分可观。但总体来讲土壤样品的含菌量最多。土壤由于具备了微生物所需的营养、空气和水分，是微生物最集中的地方。从土壤中几乎可以分离到任何所需的菌株，空气、水中的微生物也都来源于土壤，所以土壤样品往往是首选的采集目标。 土壤有机质含量和通气状况 土壤的酸碱度和制备状况 地理条件 季节条件 由自然界采集微生物由自然界采集微生物还可以根据微生物生理特点来进行选择性采样。 根据微生物营养类型（微生物营养需求和代谢类型与其生长环境有关） 根据微生物的生理特性（特殊生理性质的微生物需要到相应的地点采集） 在特殊环境下采样 局部环境条件对微生物分布的影响（寒冷地区的温泉和堆肥、海洋的局部环境：高盐、高压、低温等） 极端环境条件下的微生物（高温、低温、高酸、高碱、高盐、高压、高辐射） 优良产酶菌种的自然选育利用微生物在一定条件下产生自发突变的原理，通过筛除衰退型菌株，选择维持原有酶生产水平的菌株的纯种选育的方法。优良产酶菌种的自然选育优良产酶菌种的人工诱变选育优良产酶菌种的人工诱变选育以人工诱变手段诱发微生物基因突变，改变遗传结构和功能，通过筛选，从变异体中找出产量高、性状优良的突变株，并找出其最佳培养基和最佳培养条件，使其在最适的环境条件下合成目标酶。通过重组DNA操作获得优良产酶菌通过重组DNA操作获得优良产酶菌以体外重组DNA的技术手段诱发微生物基因突变，改变遗传结构和功能，通过筛选，从重组转化子中找出能够酶生产产量高、性状优良、品种新颖的重组产酶工程菌。 目的基因的获得 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 达载体的选择和构建 重组转化子的筛选1.目的基因的获得1.目的基因的获得目前获得目的基因的方法主要有： 基因组DNA分离 化学合成 聚合酶链式反应扩增 cDNA文库null从基因组获得目的酶基因nullPCR扩增目的酶基因nullcDNA文库制备目的酶基因null原核高效表达载体null优良产酶重组菌的筛选平板划线null 常用于生物合成法制酶的植物细胞null 常用于生物合成法制酶的动物细胞动物细胞培养主要用于疫苗、抗体、激素、多肽和酶等功能蛋白质的生产，到目前为止，通过动物细胞培养生产的酶不多，主要有组织纤溶酶原激活剂（tPA）、胶原酶、尿激酶等 用于产酶的动物细胞主要有人黑色素瘤细胞，中国仓鼠卵巢细胞（CHO）、小鼠骨髓瘤细胞、牛内皮细胞等。产酶细胞的保存产酶细胞的保存细胞保藏的原理 根据细胞生理、生化特点人工创造条件，使细胞的代谢处于不活泼，生长繁殖受抑制的休眠状态。这些人工造成的环境主要是低温、干燥和缺氧三者，在此种条件下，使细胞株（菌株）很少发生突变，以达到保持纯种的目的。 细胞保藏的方法 传代保藏 矿物油中浸没保藏 砂土管保藏法 真空冷冻干燥保藏 超低温保藏 null生产用细胞种子库系统2. 培养基的配制2. 培养基的配制培养基（culture medium）是指人工配制的用于细胞培养和发酵的各种营养物质的混合物。 培养基根据其水分含量和形状的不同，可以分为： 液体培养基 半固体培养基 固体培养基（平板培养基、斜面培养基） 培养基按照培养对象可以分为： 微生物培养基 动物细胞培养基 植物细胞培养基 2. 培养基的配制2. 培养基的配制培养基根据组成成分的不同，可以分为： 天然培养基 （普通牛肉汤、蒸熟的马铃薯、血清） 合成培养基 （察式培养基、DMEM培养基） 半合成培养基（在天然有机物的基础上适当添加无机盐类、或在合成培养基的基础上添加某些天然成分） 培养基的基本成分 I.碳源 II.氮源 III.无机盐 IV.生长因子 I.碳源I.碳源碳源（Carbon source）是指能够为细胞提供碳素化合物的营养物质。在一般情况下，碳源也是为细胞提供能量的能源，也是构成细胞的主要元素之一，是酶的重要组成元素。 选择原则 细胞营养要求和代谢调节 来源是否充裕、价格是否低廉 对发酵工艺条件和酶的分离纯化是否有影响 常用的碳源 葡萄糖、乳糖、麦芽糖、糊精、淀粉水解糖（微生物） 蔗糖（植物细胞） 葡糖糖、谷氨酰胺、谷氨酸（动物细胞）II.氮源II.氮源氮源（Nitrogen source）是指向细胞提供氮元素的营养物质，氮元素是细胞中蛋白质、核酸等组分的重要组成元素之一，是细胞生长、繁殖和酶生产不可缺少的营养物质。 氮源的分类 有机氮（各种蛋白质及其水解物，如酪蛋白、蛋白胨、酵母膏、牛肉浸膏、蛋白水解液、多肽、氨基酸、豆饼粉、花生饼粉等） 无机氮（各种含氮的无机化合物，如氨水、硫酸铵、磷酸铵、硝酸铵、硝酸钾、硝酸钠等铵盐和硝酸盐）II.氮源II.氮源氮源的选择原则 动物细胞（氨基酸、蛋白胨等有机氮源） 植物细胞（铵盐、硝酸盐等无机氮源） 异样型微生物细胞（有机氮源） 自养型微生物细胞（无机氮源） 氮源使用的注意事项 在使用无机氮源时，铵盐和硝酸盐的比例很重要 碳氮比（C/N），对酶的产量由显著影响 微生物常用无机氮源和有机氮源的混合氮源III.无机盐III.无机盐无机盐（Inorganic salt）的作用是提供细胞生命活动必不可缺的各种无机元素，并对细胞内外的pH、氧化还原电位和渗透压起调节作用;其中以一些还是酶的组成和活性调节的主要成分。 细胞所需的无机元素 大量元素（P、S、K、Na、Ca、Mg、Cl等） 微量元素（Cu、Mn、Zn、Co、Br、I、Mo等） 无机盐的添加方式 通过添加水溶性的硫酸盐、磷酸盐、盐酸盐和硝酸盐，提供大量元素 有些微量元素在配制培养基所使用的水中已经足量，不必再添加IV.生长因子IV.生长因子生长因子（Growth factor）是细胞生长繁殖所必需的微量有机化合物，常见的包括氨基酸、嘌呤、嘧啶、维生素、生长激素等。 氨基酸是蛋白质的组成成分； 嘌呤和嘧啶是核酸和某些辅酶和辅基的组分； 维生素主要起辅酶作用； 动、植物生长激素则分别对动物细胞和植物细胞的生长、分裂起调节作用。 有的细胞可以通过自身的新陈代谢合成所需的生长因素；有的细胞属于营养缺陷型，本身缺少合成某一种或某几种生长因素的能力，需要在培养基中添加所需要的生长因子，细胞才能正常生长和繁殖。null 产酶培养基的配制原则不同的细胞对培养基的要求不同; 同一种细胞用于生产不同物质时,所要求的培养基有所不同; 有些细胞的生长阶段与发酵阶段所要求的培养基也不一样。在酶的生物合成法生产过程中，处于不同时段的产酶细胞，由于细胞状态各有不同，因此也就需要不同的营养环境。也就在同一细胞生产的不同时期出现了不同功能和用途的培养基，包括：保藏培养基、种子培养基、生长培养基、发酵培养基和产酶培养基等。 在实际生产中，需要根据不同的，灵活地选择和更换。3. 产酶工艺条件及其调节控制3. 产酶工艺条件及其调节控制在酶的生物合成法生产中，对产酶工艺条件的优化控制，是满足细胞生长、繁殖和产酶的核心步骤。 产酶工艺条件中的关键调控点 I.细胞的活化与扩大培养 II.pH的调节控制 III.温度的调节控制 IV.溶解氧的调节控制酶生产的工艺 流程 快递问题件怎么处理流程河南自建厂房流程下载关于规范招聘需求审批流程制作流程表下载邮件下载流程设计 I.细胞活化与扩大培养I.细胞活化与扩大培养为了保持细胞的生长、繁殖和产酶的特性，优良产酶细胞的种子可以通过冷冻、真空冷冻干燥、传代、矿物油中浸没、沙土管等方式保藏等。 在应用过程中，保藏的细胞种子必须接种于新鲜培养基上，在一定条件下进行培养，使细胞的生命活性得以恢复，这个过程称为细胞活化。 活化的细胞进一步接种于适当的培养基，并在最适生长的培养条件下，使细胞生长得又快又好，这一过程称为扩大培养。 培养基中，氮源丰富，碳源可以相对少一点； 温度、pH、溶解氧等培养条件，应尽量满足细胞生长和繁殖； 扩大培养的时间以培养到细胞对数生长期为宜； 接种入如发酵罐的种子量一般为下一工序培养基总量的1%~10%。 II. pH的调节控制II. pH的调节控制培养基的pH与细胞的生长繁殖以及产酶关系密切，除了在起始培养基中调节到适宜的pH以外，在产酶过程中必须根据变化的情况进行必要的调节控制。 不同细胞，其生长繁殖的最适pH有所不同； 细胞产酶的最适pH与生长最适pH往往有所不同，细胞生产某种酶的最适pH通常接近该酶催化反应的最适pH； 通过控制培养基的pH，改变能够产生若干酶的同种细胞的产酶种类，及各种酶之间的产量比例； 随着细胞的生长繁殖和新陈代谢产物的积累，培养基的pH往往会发生变化。 在产酶过程中调节pH的方法有： 改变培养基的组成或其比例 使用缓冲液来稳定pH 通过流加适宜的稀酸或稀碱溶液 通过改变细胞培养的操作方式 III. 温度的调节控制III. 温度的调节控制培养温度对细胞的生长繁殖和发酵产酶有重要影响，只有在一定的温度范围内，细胞才能正常生长、繁殖和维持正常的新陈代谢。 不同的细胞有各自不同的最适生长温度 有些细胞产酶的最适温度与细胞生长最适温度有所不同（往往低于生长最适温度），需试验优化，可采用分段温度变化 细胞的生长和产酶过程中，会不断放出热量，使培养基的温度升高；同时，由于热量的不断扩散，又会使培养基的温度不断降低 在产酶过程中，必须经常及时地对温度进调节控制，使培养基的温度维持在适宜的范围内，一般的调节方法有： 热水升温 冷水降温 IV. 溶解氧的调节控制IV. 溶解氧的调节控制溶解氧是指溶解在培养基中的氧气，在培养基中培养的细胞一般只能吸收和利用溶解氧。在细胞培养过程中，培养基中原有的溶解氧很快就会被细胞利用完，需根据细胞对溶解氧的需求量，通过供给无菌空气来使培养基中的溶解氧保持在一定水平。 细胞对溶解氧的需求量可以用耗氧速率KO2来表示：KO2为耗氧速率，指单位体积培养液中的细胞在单位时间内所消耗的氧气量 QO2为细胞呼吸强度，指单位细胞量在单位时间内的耗氧量 CC为细胞浓度，指单位体积培养液中细胞的量null氧气的溶解速度又成为溶氧速率或溶氧系数，用Kd来表示：Kd为溶氧速率，指单位体积的培养液单位时间内所溶解的氧的量 [溶氧速率与通气量、氧气分压、气液接触时间、气液接触面积以及培养液的性质等密切相关]细胞所需氧气量不足，酶产量降低溶氧量过高，不仅浪费，而且会抑制酶的生产溶液中溶氧量保持平衡，满足生长和产酶需求null调节溶解氧的常规方法调节通气量 增大通气量，可以提高溶氧速率；减少通气量，则使溶氧速率降低 调节氧的分压 增加氧的分压，能够增加氧的溶解度，提高溶氧速率 措施：增加通入生物反应器中空气压力、增加通入空气中的氧含量 调节气液接触时间 延长气液接触时间，能提高溶氧速率 措施：增加液层高度、降低气流速度、在反应器中增设挡板延长空气流动距离 调节气液接触面积 增大气液接触面积，能提高氧气的溶解度，提高溶氧速率 措施：使通过培养液的空气尽量分散成小泡、装设搅拌装置和挡板 改变培养液的性质 培养液黏度大，在气体通过培养液时，高速搅拌会产生大量气泡，而影响溶氧 措施：改变培养液配方或浓度、添加消泡剂nullnull第二节 微生物发酵产酶第二节 微生物发酵产酶微生物的研究历史较长，而且微生物具有种类多、易培养、代谢能力强等特点，所以微生物的工业发酵法在酶的生产中被最广泛使用。 酶的发酵生产根据微生物培养方式的不同，可以分为： 固体发酵 液体深层发酵 游离细胞发酵 固定化细胞发酵 固定化原生质体发酵null固体培养发酵 在固体或半固体的培养基中，接种微生物，在一定条件下进行发酵，以获得所需酶的发酵方法； 传统生产酒曲、酱油曲的方法，多用于生产淀粉酶类和蛋白酶类，特别适用于各种霉菌的培养和发酵产酶； 设备简单、操作方便、产酶浓度高，但是劳动强度大、原材料利用率低，生产周期长。 液体深层发酵 在液体培养基中接种微生物，在一定条件下，进行发酵，生产所需得到的酶的发酵方法； 机械化程度高、技术管理较严格、酶的产率高、质量较稳定，产品回收率高； 是目前酶发酵生产的主要方式，也可以用于动、植物细胞产酶。null固定化细胞发酵 将微生物细胞采用各种方法固定在载体上，在一定条件和空间范围内进行固定化细胞的培养，以获得所需酶的发酵方法； 细胞密度大，产酶能力高；发酵稳定性好，可以反复使用或连续使用；细胞固定在载体上，流失细胞少，可以在高稀释率的条件下连续发酵，利于连续化、自动化生产；发酵液中含菌体少，利于产品分离纯化，提高产品质量。 多适用于胞外酶的生产 固定化原生质体发酵 将除去细胞壁后由细胞膜及细胞质组成的原生质体采用各种方法固定在载体上，在一定条件和空间范围内进行固定化细胞的培养，以获得所需酶的发酵方法； 除去了细胞壁这一扩散屏障，利于胞内酶的生产，可以直接从发酵液中得到所需要的酶发酵产物利于氧气和其他营养物质的传递和吸收，可以提高酶的产率。 胞内酶生产的新方法。 一、微生物游离细胞液体深层发酵产酶一、微生物游离细胞液体深层发酵产酶学习内容 1.微生物游离细胞液体深层发酵的基本步骤和工艺流程 2.发酵条件的控制 3.发酵动力学与发酵工艺的优化null1.微生物游离细胞深层发酵的步骤及工艺工程第一步：种子培养基和发酵培养基的配制 第二步：培养基、发酵罐以及辅助设备的消毒灭菌 第三步：将经过细胞活化、扩大培养得到有活性的纯菌株以一定量转接到发酵罐中 第四步：将接种到发酵罐中的菌株控制在最适条件下生长并生物合成酶 第五步：将产物抽提并进行精制，以得到合格的产品 第六步：回收或处理发酵过程中产生的废物和废水第一步：培养基的配置第一步：培养基的配置液体试管培养基固体斜面培养基液体摇瓶固体平板培养基第二步：湿热法消毒灭菌第二步：湿热法消毒灭菌[条件]：121℃、98kPa、20min第三步：细胞活化、扩大培养及接种细菌筛选和活化多级扩大培养2%~10%接种入发酵罐第三步：细胞活化、扩大培养及接种第四步：过程控制第四步：过程控制null2.发酵条件的控制培养基的优化 （碳源、氮源、无机盐、生长因子、pH） 细胞活化和扩大培养 （1%~2%） pH的调节控制（细胞和放线菌生长[6.5~8.0]；霉菌和真菌[4~6]） 温度的调节控制（枯草杆菌34~37℃、黑曲霉28~32 ℃ ） 溶氧量的调节和控制 微生物发酵中提高酶产量的措施*提高酶产量的措施*提高酶产量的措施*添加诱导物 在诱导酶的发酵过程中，添加适宜的诱导物，在一定的条件下，就可以加速酶的生物合成，从而显著提高酶的产量。常用的诱导物有： 酶的作用底物 酶的反应产物 酶作用底物的类似物 控制阻遏物的浓度 阻遏物能够引起某些酶的生物合成停止或者减速，在酶的生产过程中，为了提高酶的产量，必须设法解除阻遏物引起的阻遏作用。 产物阻遏 分解代谢阻遏 添加表面活性剂 如果在培养基中添加表面活性剂，就可以与细胞膜相互作用，增加细胞的通透性，有利于胞外酶的分泌，从而提高酶的产量。常用非离子型（Tween、Triton） 添加产酶促进剂 产酶促进剂是能够提高酶的产量，但作用机制不明的物质。产酶促进剂对不同细胞、不同酶的作用效果各不相同，现无规律可循，需试验确定产酶促进剂的种类和添加量。实例1：通过添加诱导物提高酶的产量实例1：通过添加诱导物提高酶的产量大肠杆菌生长在以葡萄糖为单一碳源的培养基中，每个细胞平均只含有1分子β-半乳糖苷酶。若将该细胞转移到含有乳糖而不含葡萄糖的培养基中，2min后开始大量产生β-半乳糖酶，平均每个细胞产生3000分子β-半乳糖苷酶。 异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）对β -半乳糖苷酶的诱导效果比乳糖高几百倍，蔗糖甘油单棕榈酸酯对蔗糖酶的诱导效果比蔗糖高几十倍等。 半乳糖醛酸是果胶酶催化果胶水解的产物，它却可以作为诱导物，诱导果胶酶的产生 实例2：控制阻遏物的浓度能提高酶的产量实例2：控制阻遏物的浓度能提高酶的产量枯草杆菌碱性磷酸酶受其反应产物无机磷酸的阻遏，当培养基中无机磷含量在1.0μmol/mL以上时，该酶的合成完全受阻。当培养基中无机磷含量在0.01μmol/mL以下时，该酶大量产生。所以，为了提高碱性磷酸酶的产量，必须限制培养基中无机磷的含量。 β -半乳糖苷酶受葡萄糖引起的分解代谢物阻遏作用。在培养基中有葡萄糖存在时，即使有诱导物存在， β -半乳糖苷酶也无法大量产生。只有在不含葡萄糖的培养基中，或在葡萄糖被细胞利用完后，诱导物的存在才能诱导该酶大量生成。 实例3：添加表面活性剂能提高酶的产量实例3：添加表面活性剂能提高酶的产量利用木霉发酵生产纤维素酶使，在培养基中，添加1%的吐温，可使纤维素酶的产量提高1~20倍。 实例4：添加产酶促进剂提高酶的产量实例4：添加产酶促进剂提高酶的产量添加植酸钙镁可使霉菌蛋白酶和橘青霉磷酸二酯酶的产量提高1~20倍。 添加聚乙烯醇（Polyvinyl alcohol）可提高糖化酶的产量。 聚乙烯醇、醋酸钠等对提高纤维素酶的产量也有效果等。null3.酶发酵动力学发酵动力学是研究发酵过程中细胞生长速度、产物生产速度、基质消耗速度以及环境因素对这些速度的影响的学科 在酶的生产过程中，研究酶发酵动力学（包括细胞生长动力学和产酶动力学），对于了解酶的生物合成模式、发酵工艺条件的优化控制、提高酶的产率等方面均有重要意义。I.酶生物合成的模式I.酶生物合成的模式细胞在一定条件下培养生长，其生长过程一般经历调整期、生长期、平衡期和衰退期等4个阶段。 通过分析和比较细胞生长与酶产生的关系，可以把酶生物合成分为四种模式： 同步合成型 延续合成型 中期合成型 滞后合成型酶生物合成的4种模式酶生物合成的4种模式同步合成型中期合成型延续合成型滞后合成型A.同步合成型的酶A.同步合成型的酶该类酶的生物合成伴随着细胞的生长而开始；在细胞进入旺盛生长期时，酶大量的生成；当细胞生长进入平衡期后，酶的合成随即停止，也被称为生长偶联型。大部分组成酶的生物合成都属于同步合成型，有部分诱导酶也按照此种模式进行生物合成 该型酶的特点： 该型酶的生物合成可以由其诱导物诱导生成，但是不受分解代谢物的阻遏作用，也不受产物的反馈阻遏作用； 该类酶的mRNA很不稳定 含有单宁或没食子酸的培养基内B.延续合成型的酶B.延续合成型的酶该类酶的生物合成在细胞的生长阶段开始，在细胞生长进入平衡期后，酶还可以延续合成。属于该类酶的可以是组成酶，也可以是诱导酶。 该型酶的特点： 该类酶的生物合成可以受诱导物的诱导； 该类酶的mRNA相当稳定； 该类酶中一部分的生物合成可以受到分解代谢物阻遏，因此在培养基中有阻遏物时，转为滞后合成型。 含有半乳糖醛酸的培养基内null延续型合成滞后型合成C.中期合成型的酶C.中期合成型的酶该类酶的生物合成在细胞的生长一段时间以后才开始，而在细胞生长进入平衡期以后，酶的生物合成也随着停止。该型酶的特点： 该类酶的mRNA稳定性较差； 该类酶的生物合成受到产物的反馈阻遏作用或分解代谢物阻遏作用。 含有磷的培养基内D.滞后合成型的酶D.滞后合成型的酶该类酶的生物合成在细胞的生长进入平衡期以后才开始并大量积累，也被称为非生长偶联型。许多水解酶的属于该类 该型酶的特点： 该类酶的mRNA稳定性很好； 该类酶的生物合成受到产物的反馈阻遏作用或分解代谢物阻遏作用。当培养基中无阻遏物时，该类酶的合成可以转为延续合成型。 含有阻遏物质的培养基内nullnull影响酶生物合成模式的主要因素*酶的mRNA的稳定性 mRNA稳定性好的，可以在细胞生长进入平衡期以后，继续合成所对应的酶； mRNA稳定性差的，就随着细胞生长进入平衡期以后而停止酶的生物合成； 培养环境中是否有阻遏物的存在 不受培养基中所对应的某些物质阻遏的，可以伴随细胞生长而开始酶的合成； 受到培养基中所对应的某些物质阻遏的，则要在细胞生长一段时间甚至到平衡期后，酶才开始合成并大量积累。 null提高mRNA稳定性除去阻遏作用提高mRNA稳定性并除去阻遏作用同步合成型中期合成型滞后合成型延续合成型II.细胞的生长动力学II.细胞的生长动力学细胞生长动力学主要研究细胞生长速率以及外界环境因素对细胞生长速率影响的规律。 采用1950年莫诺德提出的动力学方程，认为：在培养过程中，细胞生长速率与细胞浓度成正比例。比生长速率 与细胞种类、培养温度、pH、培养基组成和限制性基质浓度等因素相关。 null细胞分批培养过程中不同阶段的比生长速率细胞的分批培养是一种间歇的培养方式，在培养时，除了不断进行通气（好气培养）以及调节培养液一定的pH，需加入酸碱溶液外，培养系统除了排出废气外，与外界没有其他的物料变换。在指数生长期的减速阶段，随着细胞的大量繁殖，培养基中的营养物质迅速消耗，假设培养基中只有一种限制性基质，并且培养液中没有限制性因素时，比生长速率如如下Monod方程。当限制性基质浓度不断降低，营养物质消耗，细胞浓度不再增大，细胞生长进入静止期。nullnull流加式培养null细胞连续培养与连续全混流生物反应器在培养过程中，不断向反应器流加培养基，同时以相同流量从反应器中取出培养液，这种操作方式就是连续培养。在进行连续培养之前，通常要先进行一段时间的分批培养，当反应器中的细胞浓度达到一定程度后，以恒量的流量向反应器中流加培养基，同时以相同流量取出培养液，使反应器内培养液的体积保持恒定。 同时在生物反应器中进行充分搅拌，以保证培养液中各处的组分相同，并且也与流出液的组成成分相同。null所以在游离细胞连续发酵过程中，必须根据情况控制好稀释速率，使之与特定的细胞的比生长速率相等时，才能使发酵液中的细胞浓度恒定在某个数值，从而保证发酵过程的正常运转。III.产酶动力学III.产酶动力学产酶动力学主要研究细胞产酶速率以及各种环境因素对产酶速率的影响规律。分为宏观产酶动力学和微观产酶动力学。 在酶的发酵过程中，酶的产量的高低，是发酵系统中群体细胞产酶的集中体现，即主要是宏观产酶动力学 宏观产酶动力学的研究表明，产酶速率与细胞比长速率、细胞浓度以及细胞产酶模式有关，可以用产酶动力学方程是表示：null产酶动力学模型（产酶动力学方程式）二、固定化微生物细胞发酵产酶二、固定化微生物细胞发酵产酶学习内容 1.固定化细胞发酵产酶的优点 2.固定化细胞发酵产酶的工艺条件控制 3.固定化细胞发酵产酶的发酵动力学null1.固定化细胞发酵产酶的优点固定化细胞就是指采用各种方法固定在载体上，在一定的空间范围内进行生长、繁殖和新陈代谢的细胞。固定化细胞发酵产酶与游离细胞发酵产酶相比，具有许多显著的特点： 提高产酶量（细胞密度大） 可以反复使用或连续使用较长时间（固定化细胞不易脱落） 稳定性好（固定化的细胞受载体保护） 缩短发酵周期，提高设备利用率（每批发酵周期短，且可使用高稀释度连续发酵） 产品容易分离纯化（发酵液中细胞含量很少） 适用于胞外酶的生产（载体限制了固定化细胞的活动空间） null2.固定化细胞发酵产酶的工艺条件控制与游离细胞发酵的工艺条件基本相同，但在其工艺条件控制方面有些问题要特别加以注意： 固定化细胞的预培养（转入前先进行一轮分批发酵） 溶解氧的供给（增通气量、改载体、添富集氧或利氧传递物质、共固定化过氧化氢酶、降低培养基浓度和黏度） 温度的控制（高稀释度连续培养时应预热新鲜培养基） 培养基组分的控制（营养方面与游离细胞发酵相同，但应考虑培养基对细胞的结构稳定性和供氧）null3.固定化细胞发酵产酶的发酵动力学A.固定化细胞发酵产酶的细胞生长动力学 固定化细胞在适宜的培养基和培养条件下培养，固定在载体上的细胞以一定的速率生长，在达到平衡期后的相当长时间内，固定化细胞的浓度保持恒定，同时，随细胞的生长和繁殖，有一些细胞泄露到培养液中，这些泄露细胞则是游离细胞，它们也在培养液中繁殖。 在固定化细胞的培养系统中，细胞生长的动力学方程为：nullnullB.固定化细胞发酵产酶的产酶动力学 在固定化细胞发酵过程中，固定在载体上的细胞和培养液中的游离细胞都可以产酶，产酶动力学方程为： 研究表明，上述方程中， 比 小，说明固定化细胞产酶效率较游离细胞高。研究表明，固定化细胞的产酶模式可以视为非偶联型；而游离细胞的产酶速率依据细胞的产酶模式的不同而不同，固定化枯草杆菌细胞 （角叉菜胶载体）nullC.固定化细胞连续发酵产酶的发酵动力学 在固定化细胞连续发酵过程中，如反应器内是全混流态，在整个反应体系中物质是均一的，则细胞生长动力学方程为： 在连续发酵过程中，稀释率只会影响游离细胞的浓度，所以固定化细胞发酵能采取高稀释度连续发酵。 当处于此平衡连续发酵体系是，产酶动力学方程为：null二、固定化微生物原生质体发酵产酶二、固定化微生物原生质体发酵产酶固定化原生质体是指固定在载体上，在一定的空间范围内进行生命活动的原生质体。 原生质体是除去细胞壁后又细胞膜及胞内物质组成的微球体，不稳定，容易受到破坏。通过凝胶包埋法等固定化方法制备得到的固定化原生质体稳定性显著提高，由于除去了细胞壁这一扩散屏障，有利于胞内外物质的交换，可以用于胞内酶的生产。 固定化原生质体发酵产酶与游离细胞发酵产酶的工艺条件基本相同，但在工艺控制方面需要注意： 渗透压的控制（添加渗透压稳定剂） 防止细胞壁再生（添加青霉素） 保证原生质体的浓度（固定化前应保证原生质体浓度达一定水平）第三节 植物细胞培养产酶第三节 植物细胞培养产酶植物细胞培养产酶是20世纪80年代发展起来的技术，该技术首先从植物体外植体中获得植物细胞，再经过筛选、诱变、原生质体融合或基因重组等手段选育得到优良的产酶细胞，然后再人工控制条件的反应器中进行细胞培养，而获得所需的酶。 植物细胞培养产酶应注意的问题： 植物细胞培养的特点 植物细胞培养的工艺条件及其控制 植物细胞培养产酶的过程一、植物细胞培养产酶的特点一、植物细胞培养产酶的特点通过植物培养生产酶，具有如下显著特点。 产率高（植物细胞培养的产率均达到或者超过完整植株，有的高达830倍） 周期短（植物细胞倍增时间一般为12~60h，一般生产周期为15~30天，这比起微生物来是相当长的时间，但是与完整植物的生长周期比较，却是大大地缩短了生产周期） 易于管理，减轻劳动强度（在生物反应器中生产，不受地理、气候等因素的影响，同时自动化控制，大大减轻了劳动强度） 产品质量高（与整体植株比，主要产物的产率高，杂质少，而且质量可控的生产过程，减少了各种污染和病虫害侵蚀，因此产物易分离，产品品质高） 与微生物产酶比，对剪切力敏感、生产周期长，需改进反应器以提供植物光照。二、植物细胞培养的工艺条件及其控制二、植物细胞培养的工艺条件及其控制植物细胞培养产酶过程中的工艺控制主要有： 温度的控制（植物细胞培养一般控制在室温范围，通常不能低于20℃，也不能高于32℃，有些细胞最适生长温度与产酶最适温度不同） pH的控制（植物细胞培养的pH一般控制在5~6的微酸性范围，培养基配制一般为5.5~5.8，培养过程中变化不大） 溶解氧的调节控制（适当提供溶解氧，通风和搅拌不可太强烈） 光照的控制（大多数的植物细胞的生长及产酶都要求一定波长的光的照射，在产酶过程中，应根据细胞和酶产物的不同选择不同的照射条件） 前体的添加（适当添加细胞目的代谢物代谢途径上游的物质，能够提高植物细胞培养生产次级代谢物的产量） 刺激剂的应用（在植物细胞培养中，添加适当的刺激剂，能显著提高某些刺激代谢物的产，常用刺激物有微生物细胞壁碎片、果胶酶、纤维素酶等微生物胞外酶） 三、植物细胞培养产酶的过程三、植物细胞培养产酶的过程植物细胞产酶的技术过程大致可以分为三步 S1. 植物体愈伤组织的诱导 S2. 植物细胞的悬浮培养 S3. 酶的分离纯化 例如以大蒜组织培养生产超氧化物歧化酶 第四节 动物细胞培养产酶第四节 动物细胞培养产酶动物细胞培养技术是20世纪60年代发展起来的技术，用动物细胞培养产酶首先应获得产酶动物细胞（经过筛选、诱变、细胞融合或基因重组等手段选育），然后再人工控制条件的反应器中进行细胞培养，而获得所需的酶。 动物细胞培养产酶应注意的问题： 动物细胞培养的特点 动物细胞培养的工艺条件及其控制 动物细胞培养产酶的过程一、动物细胞培养产酶的特点一、动物细胞培养产酶的特点通过动物培养生产酶，具有如下显著特点。 动物细胞的生长较慢（动物细胞倍增时间为15~100h） 为防止微生物污染，在培养过程中，需要添加抗生素（常用青霉素50~100U/ml和链霉素50~100U/ml） 动物细胞体积大，无细胞壁保护，对条件敏感（必须严格控制温度、pH、渗透压、通风搅拌等条件） 具有贴壁依赖性生长和悬浮生长 培养基成分复杂 原代细胞传代50代后，会退化死亡，需要重新分离细胞 二、动物细胞培养的工艺条件及其控制二、动物细胞培养的工艺条件及其控制动物细胞培养产酶过程中的工艺控制主要有： 温度的控制（动物细胞培养一般控制在36.5 ℃ ，允许波动范围在0.5 ℃ 之内） pH的控制（动物细胞培养的pH一般控制在7.0~7.6的微碱性范围，通常动物细胞在7.4的条件下生长最好） 渗透压的控制（培养液中的渗透压应与细胞内渗透压平衡，一般控制在260~320mOsm/kg） 溶解氧的控制（不同动物细胞以及处于不同生长阶段的同种动物细胞对氧的要求有所差别，应适时监控并调整；一般通过调节进入生物反应器的混合气体的比例来实现） 三、动物细胞培养产酶的过程三、动物细胞培养产酶的过程动物细胞产酶的技术过程大致可以分为三步 S1. 单细胞悬液的制备 S2. 动物细胞的体外培养 S3. 酶的分离纯化 例如以人黑色素瘤细胞培养生产组织纤溶酶原激活剂和尿激酶纤溶酶原激活剂。 null