EM菌定向培养

EM菌定向培养 1.光合细菌 （1）培养基： 1）酵母膏 3 g/L 蛋白胨 3 g/L CaC12 0.3 g/L MgSO4 0.5 g/L PH自然 （保存用） 2）​ 酵母膏 0.1 g/L NH4C1 1.0 g/L NaAC 3.5 g/L MgC12 0.1 g/L CaC12 0.1 g/L KH2PO4 0.6 g/L K2HPO4 0.4 g/L PH7.2(富集用) 3）​ NaAC 2 g/L NaHCO3 1 g/L NH4C1 1 g/L NaC1 1 g/L KH2PO4 0.5 g/L K2HPO4 0.2 g/L MgSO4 0.2 g/L CaC12 0.01 g/L 蛋白胨 1 g/L 酵母膏 0.3 g/L PH7.2-7.6 （分离纯化用） (2) 定向培养： 1）富集培养 ：10mL/15×150mm试管， EM菌0.5mL石蜡封面。 28℃-30℃ 7-14天（10天） 连续光照（1000-3000lx），60w灯泡距离30-40cm. 颜色由浅呈桃红至棕红色。 重复一至二次，取富集液0.5mL在相同条件下定向富集. 2）​ 分离纯化： 梯度稀释： 10-4、10-5、10-6 双琼脂平板培养 半固体保存 半固体混菌 挑单菌落划线 典型单菌落 10mL/15×150mm试管 静置2-3h 穿刺接种 混匀.表面封无菌石蜡 注入上层半固体琼脂（0.8%） 同样条件下 连续光照28℃-30℃ 7-10天 连续光照 7-10天备用 颜色由浅至棕红色 28℃-30℃ 7-10天 EM菌中光合细菌平板培养，25-28℃ PH 6.5-7.6 8-14天 种类多菌落较大。 2. 乳酸菌 （一株浅黄边缘整齐，另一株灰白色边缘不整齐） （1）​ 培养基： 1）牛肉膏 10 g/L 蛋白胨 10 g/L 酵母膏 10 g/L 番茄汁20% 葡萄糖 10 g/L 吐温 0.05% CaCO3 20 g/L 溴甲酚绿 0.01% PH 6.0-6.5 2）酵母膏 7.5 g/L 葡萄糖 10 g/L 番茄汁 100 mL 蛋白胨 7.5 g/L KH2PO4 2.0 g/L 吐温 0.5 mL PH 6.0-6.5 3）​ 葡萄糖 20 g/L 酵母膏 10 g/L PH 6.0-6.5 4）蛋白胨 8- 10 g/L 酵母膏 3- 5g/L 葡萄糖 13- 15g/L KH2PO4 1.5- 2.0 g/L MgSO4 0.3-0.5 g/L MnSO4 0.2-0.25 g/L NaAC 3.0-5.0 g/L PH 5.5-6.5 5）蛋白胨 0.8- 1.0 g/L 糖蜜 3.0-5.0 g/L 酵母膏 3-5g/L 玉米浆0.5- 1.0g/L KH2PO4 0.1- 0.3 g/L MgSO4 0.3-0.5 g/L NaC1 3-5 g/L 葡萄糖 8- 10g/L PH5.5-6.5 （发酵或种子培养基） 6）MRS培养基  蛋白胨 10.0 g、牛肉膏 10.0g、 酵母膏 5.0 g、 柠檬酸氢二铵 2.0 g、 葡萄糖 20.0g、 吐温 80 1.0 mL、 乙酸钠 5.0 g、 磷酸氢二钾 2.0g、硫酸镁 0.58 g、硫酸锰 0.25 g、琼脂 18.0 g、 蒸馏水1L, pH 6.5。（分离培养基），当MRS培养基冷却至45～50℃时,加入已灭菌的碳酸钙, 充分混匀,倒平板。 （2）定向培养： 1）富集培养：150mL/250mL三角瓶密封培养，Em菌3%，30℃-35℃静置四天，重复一次，取富集液5mL在相同条件下培养. 经验结论：二天OD值增长快，PH值6.0-6.5迅速降至3.0-3.5，四天趋于平缓，随后逐渐上升，第六天稳定在PH7.0左右. 镜检大量杆（棒）状乳酸菌，菌体较大，还有少量椭圆酵母，一股酸甜气味 2） 分离纯化： 平板划线或混菌取一环单菌 转接斜面 梯度稀释 典型菌落 落梯度稀释 30℃-35℃ 混菌或涂布 （ 快 大） （10-4、10-5、10-6） 24h　 （ 10-4、10-5、10-6 ） 不同菌落 混菌培养 30℃-35℃ 30℃-35℃ 24-48h 24-48h 3. 酵母菌：（乳白色或红色，粘稠发亮 呈圆 或椭圆 黄瓜状，表面光滑，边缘整齐。液体培养基 生长生成沉淀或菌） （1）培养基： 1）麦芽汁培养基 1：4水60-65℃水浴3-4小时，4-6层纱布过滤，可加一个蛋清加水20 mL调均生泡沫，倒入糖化液中，煮沸过滤。 10-15波林 PH 6.0-6 .4 2）马铃薯 200 g(煮沸过滤补到1L) 葡萄糖 20 g/L PH 4.5-6.0（自然） 3）葡萄糖 100 g/L 蛋白胨 7 g/L 酵母膏 7 g/L KH2PO4 1 g/L MgSO4 0.5 g/L PH 6.5 4)葡萄糖 50 g/L 尿素 1 g/L （NH4）2SO4 1 g/L KH2PO4 2.5 g/L Na2HPO4 0.5 g/L MgSO4 1 g/L FeSO4 0.1 g/L 酵母膏 0.5 g/L 孟加拉红 0.03 g/L PH 4.5-5.0 （富集用） （2）定向培养 1)富集培养：100mL/500 mL 三角瓶，EM菌3%，28℃-30℃，150-200r/min三至四天，菌液混浊，产菌膜并有少量沉淀，重复一次，取富集液3-5mL相同条件下培养. 经验结论：生长快，三天OD值达顶峰，PH由5.5降至3.5-3.0. 镜检酵母细胞多，逐渐粘在一起，呈卵圆或椭圆形。 2) 分离纯化 梯度稀释 平板划线或混菌 转接斜面 10-4、10-5、10-6 不同单菌落分别划线 28℃-30℃ 涂布或混菌 28℃-30℃ 20-24h 28℃-30℃ 24-36h 石蜡封面 24-36h 4. 放线菌（涂布混菌划线均可） 菌落干躁 不光滑，菌丝细 与培养基结合较牢。 （1）培养基；改良高氏1号 可溶性淀粉 20g/L KH2PO4 0.5 g/L NaC1 0.5 g/L MgSO4 0.2-0.5 g/L KNO3 1 g/L FeSO4 0.01 g/L 重铬酸钾（3%） 3.3 mL/L PH 7.2-7.4 （2）定向培养： 1)富集培养：100mL/500mL三角瓶，Em菌8%，28℃-30℃，200r/min四至五天，重复一次，取富集液5mL在相同条件下定向培养 经验结论：开始生长缓慢，五天达到顶点，随后变缓，PH6.5-7.0基本不变，随着EM原液增大，OD值逐渐增高 镜检丝状（枝状）放线菌多，菌丝体缠绕一起，同时发现少量酵母和霉菌生长。 2) 分离纯化： 梯度稀释： 平板纯化（划线）或混菌 转接斜面 10-4、10-5、10-6 典型单菌落（快.大） 25℃-30℃ 混菌或涂布 不同菌落 5-7d 25℃-30℃ 7-14d 25℃-30℃ 7-14d 防止干裂可放在 （ 7d ） 加湿棉花烧杯中 土壤中放线菌分离：1g土/99mL无菌水，加10滴10%酚溶液,振荡静置5min.梯度稀释10-3、10-4、10-5 （1）放线菌菌落硬度大，干燥致密与基质结合紧密 ，不易挑取。 （2）培养箱中放置一杯水以增加湿度，平板相对厚些，避免过找干涸。 （3）如将材料干燥。高温。低温处理并改变培养温度和培养基成分，得到不同放线菌。 5. 丝状菌：混菌法 (主要曲霉菌) 绒状 棉絮状 网状 （1）​ 培养基： 1） PDA培养基 马铃薯一葡萄糖培养基（同酵母）并添加80%乳酸数滴（5mL/L）或0.05 %去氧胆酸钠以抑制细菌生长。 注：土壤适于马丁或马玲薯一葡萄糖培养基 河泥.生物膜适用于查氏或马丁培养基 2) 查氏 蔗糖 30 g/L FeSO4 0.01 g/L NaNO3 2.0 g/L MgSO4 0.5 g/L KC1 0.5 g/L K2HPO4 1.0 g/L PH 6.7-7.0 3) 马丁 葡萄糖 10 g/L 蛋白胨 5 g/L KH2PO4 1 g/L MgSO4 0.5 g/L 孟加拉红（0.1 % ）0.33mL灭菌后使用前加入 .PH自然 （2）定向培养： 1)富集培养：100mL/250mL三角瓶，EM菌3%，25℃-30℃，200r/min，三至七天，重复一次，取富集液3mL在相同条件下培养。 2) 分离纯化：（土壤10-3、10-4、10-5） 梯度稀释（10-4、10-5、10-6） 平板纯化（划线或混菌） 转接斜面 混菌或涂布 不同典型单菌落 25℃-30℃ 25℃-30℃ 25℃-30℃ 3-4天 3-5天 3-5天 注：a 据菌落质地、颜色是否纯培养物，若有杂菌重复纯化一次. b 对形成固定菌落，青霉、曲霉等混菌法纯化，若菌落不定型蔓延繁殖（如根、毛等）两菌落极而混杂，采用高梯度稀释或培养16-24h内生长菌丝接种。 6. 醋酸菌：（菌落呈圆形 湿润 隆起 乳白 较整齐） （1）​ 培养基： 1)葡萄糖 100 g/L 酵母膏 10 g/L CaCO3 20 g/L PH 6.8 2)乙醇 20 mL/L NaAC 5 g/l 酵母膏 1 g/L K2HPO4 0.4 g/L (NH4)2SO4 0.5 g/L MgSO4 0.2 g/L CaCO3 10 g/L PH 6.8-7.0 （2）定向培养： 1) 富集培养：Em菌 7% 28℃-30℃ 200r/min 四天 2) 分离纯化： 10-4、10-5、10-6 梯度稀释 平板混菌（涂布） 纯化（划线） 转接斜面 28℃-30℃ 28℃-30℃ 28℃-30℃ 24-36h 48h 48h 土壤中产醋酸菌种的分离筛选 分离上样中的大部分细菌的分离程序中无需进行富集，但对某些少数细菌则要求特殊的富集或选择技术才能很好地被分离培养。运用细菌的酶诱导性，在分离培养基中添加若干抗生素、复杂底物及生长因子的前体物质来激活细菌某一特殊基因组，可以建立若干富集技术。同样，富集可以促进抗性的产生并维持下来。 培养基与仪器 1．培养基： 牛肉膏蛋白胨培养基 2．仪器：全自动高压灭菌锅，培养箱，酸式滴定管   实验步骤 1. 确定 方案 气瓶 现场处置方案 .pdf气瓶 现场处置方案 .doc见习基地管理方案.doc关于群访事件的化解方案建筑工地扬尘治理专项方案下载 ：首先查阅资料，了解所需菌种的生长培养特性。 2. 采样：选取离地面5～15 cm处的土，用小铲子取样，将采集到的土样盛入聚乙烯袋或玻璃瓶中。 3. 增殖：称取0.5g土样（湿重），加到含10ml 25%无菌土样浸出汁的试管中，于26℃、150rpm条件下振荡培养25min，以适宜的样本稀释液系列稀释培养液。然后取0.1 m1涂布于已添加及未添加富集底物的土浸出汁平板。26℃下皿底朝上培养4—10天，将长出的菌落接入斜面，但应挑分离成单个的，以免不纯。 4. 分离：利用产物特性分离得到产目标产物的纯种。 初筛：将细菌接种到含有一定的碳酸钙的牛肉膏蛋白胨固体培养基中进行培养，如果细菌产酸则培养基出现混浊半透明状态，可以根据菌体产生酸溶解出现透明圈大小初步筛选出产酸高的菌种。 复筛：将初筛菌种在斜面培养纯化后，接到牛肉膏蛋白胨液体培养基中37℃深层培养24 h后。取出培养液5m1加入试管内，加0.1moL/LNaOH液中和，然后加氯化铁液2—3滴，摇匀，观察液色是否变为黄红色，如将试管放在火焰上煮沸，有无红褐色沉淀生出，根据所消耗的NaOH量确定产物醋酸的具体生成量。 实验结果 菌 株 1 2 3 4 5 6 NaOH的消耗量（ml） 醋酸的生成量（ml） 反应液颜色变化 如果培养中有其它种挥发酸共存，应采用什么方法来测定醋酸的生成量？ 附：土壤中四大微生物分离与纯化 土壤中细菌数量最多，其次霉菌和放线菌。放线菌一般在干燥偏碱性，有机质丰富土壤 中含量多，霉菌在有机质丰富 偏酸性 透气性好含量多，酵母菌含量较少（酒曲 果皮 果园土壤含量多）。分离与纯化时常制成不同选择培养基，分离放线菌时在土壤稀释液 中添加10%酚或在培养基添加抗生素，抑制细菌和霉菌， 四大微生物分离与培养　 样品来源 分离对象 分离方法 稀释度 培养基 培养温度 培养时间 土样 细菌 稀释分离 10-5、10-6、10-7 肉膏蛋白胨 30-37℃ 1-2d　 土样 放线菌 稀释分离 10-3、10-4、10-5 高氏合成1号 28℃ 5-7d 土样 霉菌 稀释分离 10-2、10-3、10-4 马丁 28-30℃ 3-5d 面肥酒曲 酵母菌 稀释分离 10-4、10-5、10-6 豆芽汁葡糖 28-30℃ 2-3d 分离平板 单菌落 划线分离 肉膏蛋白胨 30-37℃ 1-2d　 （细菌） 光合细菌分离纯化 一. 培养基： （1）酵母膏 0.5 g/L NH4C1 1.0 g/L NaAC 3.5 g/L MgCL2 0.1 g/L CaC12 0.1 g/L KH2PO4 0.6 g/L K2HPO4 0.4 g/L PH 7.2-7.4 （富集用） (2) 酵母膏 1.0 g/L 羟基丁二酸（苹果酸） 0.5 g/L NH4C1 1.0 g/L NaAC 3.0 g/L NaCL 1.0 g/L NaHCO3 1.5 g/L K2HPO4 0.2 g/L MgSO4 0.2 g/L PH 7.0-7.2 （ 专利 富集用） (3) 酵母膏 0.1 g/L NaAC 3.0 g/L (NH4)2SO4 1.0 g/L MgSO4 0.2 g/L NaC1 1.0 g/L KH2PO4 0.3 g/L K2HPO4 0.5 g/L CaC12 0.05 g/L PH 7.2-7.4 （分离纯化用） （4）酵母膏 2.0 g/L Na2CO3 2.0 g/L NaAC 3.0 g/L KH2PO4 0.5 g/L NH4C1 1.0 g/L NaC1 1.0 g/L MgC12 0.2 g/L PH 7.2-7.4(生产用) 注：可加促进剂黄腐酸0.1-0.3 g/L 乙醇3.0 g/L代替NaAC 作碳源 PH上升慢（专利）。 （5）酵母膏 3 g/L 蛋白胨 3 g/L NaC1 10 g/L MgSO4 0.5 g/L KH2PO4 0.25 g/L PH 7.2-7.4 （计数保存用） 二. 富集培养： （1）采样：淡水、海水、底泥、有机物污染、营养化虾池有光照的厌氧层等，装入无菌磨口瓶中备用。 （2）富集培养： 1-5g底泥 1mL水样 一层底泥 商品光合细菌 或15mL水样 10mL/15×150mm 试管 250mL/250mL 10mL/18×180mm 试管 200mL/250mL磨口瓶 带螺帽或橡胶塞 细口磨口瓶 0.4-0.5 mL菌液 石蜡封面 石蜡封面 装满扎好 石蜡封面 转接10-15mL 转接0.5-1.0ml菌液 转接1mL菌液 菌液于同样条件下培养 于同样条件下培养 于25mL/25mL小磨口瓶 25℃-30℃ 7-14天（海水1-3月） 连续光照（2000-3000lx）40-60w灯泡 距离20-50cm，培养基转为红色或紫色（棕红）。若不出现红色可在富集一 次，直到出现红色的培养液。 注意事项：转接时一定震荡均匀 底泥和水样经曝晒后使用 避藻措施：滤光片＞800nm，添加0.05%NaCL，绿色蓝色遮阴布遮阴. 含氯化物培养基优于硫酸盐 三. 分离纯化 紫色非硫菌：生长较快，七天左右移植合适，海水种慢（2-3周） 平板混菌 单菌落划线 半固体或液体石蜡封面保存 石蜡密封 二至三次 （带螺帽试管可不封蜡 富集菌液 连续光照 连续光照 连续光照 梯度稀释（10-4 10-5 10-6 10-7） 试管半固体培养 双平板纯化（固体） 二至三次 半固体或液 （0.6%-0.8%琼脂） 于底层平板划线 纯化（划线） 体保存 菌液混合均匀 静置二至三小时，倒 石蜡封面，橡胶塞封好扎紧 上层平板(固或半固)琼脂 28℃-30℃ 7-10天 28℃-30℃ 7-10天或 连续光照60w白炽灯泡. 增加一次穿刺接种,表面封蜡. 距离30-40cm。 连续光照 深层琼脂拄分离法： 10mL带螺旋盖的或胶塞试管，分别加入梯稀10-4 10-5 10-6 10-7 富集培养液，加入50℃半固体培养基约6mL混均待凝固后加入1mL无菌液体石蜡密封，并盖紧试管。28-30℃光照3-5天长出单菌落。 转接单菌落：长有单菌落试管表面灭菌，切断玻璃，取琼脂柱于无菌平皿，用无菌刀将单菌落解剖出来，再将单菌落穿刺接种于半固体培养基，加1mL无菌液体石蜡密封并盖紧试管。28-30℃光照3-5天后置冰箱保存。 镜检：挑单菌落涂片，自然干燥后镜检。 注 ：1.可蘸去一环富集液瓶内壁菌样直接化线双平板培养或固体平板（厌氧培养箱）。白色或杂色为杂菌，紫红色为光合细菌 不同土壤和水样得到不同光合细菌,有杂菌过多无法得单菌落,有时会分离到藻类. 2. 光合细菌培养周期较长，培养时采用在大烧杯中放入培养的平皿，周围放一些 加水棉球，盖上玻璃板在培养箱中培养以防干裂。 3．可取1mL富集液于10mL半固体培养基中混均培养，当琼脂中出现红色菌落时，进 行单菌落液体培养。 结果与讨论： 厌氧箱培养平板表面长出红色菌落，深层琼脂拄分离时琼脂柱内长出分散红色单菌落。 几种红假单胞菌形态，球性（分散的球状），荚膜（视链状） 沼泽（星或放射状）。 光合细菌制剂规摸性培养 1、​ 生产条件 （1）营养：淡水型对盐要求0.1%-0.2%，海水型 1%-3%。紫色非硫菌要求多种生长因 子，多为B族类。淀粉厂废水.酒精厂废液均为很好材料 （2）光照 ：最适2000-3000lx（勒）40W、60W灯泡（1000lx左右）距离25-30cm。 光照强度1000-6000lx均可生长，超过4000lx菌液转色快，易老化，附壁碎片沉淀不易保存。光线不足，速度慢.菌液浅，杂菌易污染。 （3）温度: 最适28℃-30℃ 5-7天转为棕红色并有少量附壁现象 15℃-35℃均能生长，达到对数期时间不同. 20℃-30℃ 四至五天达到对数期. 35℃-40℃三至四天生长旺盛，五天明显抑制，附壁下沉，细胞碎片。 （4） PH ：6.5-7.5 培养过程中PH不断上升　 6.5-8.5均能生长 PH≤6.5 前三天慢，四天后生长良好 PH≥8.0 三天良好，第四天慢（PH上升），八天达峰值 PH≥9.0显著影响，菌数下降。 （5）氧气：光合细菌在微氧条件相对缺氧时生长快，菌体的营养成分相对较高，其需氧量在0.2～0.5vvm。种子在玻璃瓶培养时，采用棉塞封口，每天至少摇晃2次 。 二. 生产工艺 流程：试管菌种 三角瓶 种子培养 开放式培养 （1）试管培养：2×15mL/15×150mm 活力强，繁殖速度快，菌液鲜艳 试管菌种定期转接防止老化 (2) 三角瓶培养：2×400mL/500mL三角瓶 ，121℃ 20-30min 接种量2%-3% 28℃-30℃ 5-7天 菌液均匀无沉淀，颜色紫红至棕红色，有菌液固有的清香味。 (3) 血清瓶培养（或卡氏罐）： 2×8L/10L血清瓶 121℃ 20-30min 接种量5% 连续光照 28℃-30℃ 5-7天 菌液均匀，转色好，无附壁沉淀碎片现象。 (4) 种子培养：6×20L/20L塑料桶 灭菌：容器采用化学灭菌法；0.5L/T水 次氯酸钠水溶液 浸泡12-24小时，滤菌水冲洗二遍即可使用 培养基灭菌；卡氏罐培养基灭菌后于无菌室内分装，或所有物料加30-50%水 高压蒸汽灭菌分装后滤菌水补齐。 接种量：10%-15% 28℃-30℃ 5-7天 连续光照 (5) 开放式培养： 1. 灭菌：25×20L/20L塑料桶 0.5T暂存罐灭菌，将0.5T滤菌水泵人暂存罐，加入培养物料，充分溶解后分装于25×20L塑料桶（化学灭菌）中备用 2. 培养条件：接种量20%-30% PH7.2-7.4 28℃-30℃ 连续光照 7-9天 3 .发酵管理： a. 摇动：每天至少二次，定时进行 防止菌种下沉。 b. PH调节：PH≥9.0及时调整（醋酸 盐酸等），PH上升光合菌生长特征。 c. 外观： 菌液均匀，基本无分层 无附壁 碎片或沉淀现象（光强 温高 退化菌种等）. 颜色由浅红 粉红变为 棕（深）红色 ，10-30亿cfu/mL 4.保存期：夏天三个月 冬天六个月，保持80%活力。 （6）分段培养法：是提高菌浓度的有效方法 一般培养三天后，PH变为8.0左右，补充新鲜培养基后，PH又变为7.0。 可考虑1.0%食醋。 （7）问 题 快递公司问题件快递公司问题件货款处理关于圆的周长面积重点题型关于解方程组的题及答案关于南海问题 与讨论：a.变浅：接种量少 ，菌种老化杂菌多，PH过高过低，光线不足，温度过高过低，水硬度大。 b.变黑：气温较高季节长期失去光照。 c.变绿：多见于高温季节绿硫菌繁殖，连续多次密闭发酵，更换菌种和水源。 d.变灰：接种小，菌种不纯，光线不足，PH 过低。 （8）光合细菌的成品保存： 低温凉爽，每天不低于2小时光照，光合细菌生长惯性，若突然无光照，5-10天菌液发臭，刚开始时给一定光即可缓和，逐渐降光照，光合细菌进入稳定期时在阴凉避光可保存6月之久。 附 ：光合细菌固定方法： 1．沸石粉： 粒度120目 2．光合细菌浓缩液：用浓度3-5g/L磷酸氢钙溶液，将光合细菌培养液菌体过夜，虹吸法吸取上清液即为光合细菌浓缩液. 3. 菌体固定化 沸石粉50g 添加粘度500mpa 海藻酸钠2.0kg 或 粘度800mpa 2.5kg 粘度1000mpa 1.5kg，在加入光合细菌浓缩液12-15 kg混均，制粒机成型粒径5mm,置于 20g/L的氯化钙溶液硬化12h，取出自来水漂洗二次装袋保藏.光合细菌持续降解氨氮.小分子有机酸等有害污染物的作用。 光合细菌计数及保藏 一．光合细菌计数： 双琼脂平板计数法 血球计数板法：准，繁 液体管法：时间长（12天） 比色法：简单偏差大， 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 比浊管难保藏。 双琼脂平板计数法：简单．准确 1.培养基：双琼脂平板 上层1%琼脂，下层0.8%琼脂 2.操作步骤: 梯度稀释 烤板（下层） 加上层琼脂(15mL) 10-610-710-8 涂布或混菌 28一30℃ 45一50℃ 5一7天 20一30 min 连续光照 测活菌数 二.菌种保藏: 1.液体保藏法: 时间1一2月,适于短时间生产性保存.28一30℃ 5一7天,每天震荡一次防止附壁或下沉，易污染(霉菌).防止退化,每月转接一次。 表面封蜡保存法(放在干燥器中)保存一年以上,适于长时间保种。 2.半固体保存法:琼脂0.8一1.0% 穿刺接种封石蜡. 28一30℃ 40-60w灯泡距离30一50cm 7一14天，连续光照下置于冰箱保存.保存时间一年以上，杂菌率低.总菌含量稍低。 附：乳酸菌制剂的培养 一.流程：试管菌种 三角瓶培养 种子罐培养 发酵罐培养 二.生产工艺： （1）试管培养： 将二至三株乳酸菌菌种各取一至二环于液体试管中，28一30℃活化培养24h， （2）三角瓶培养：150-200mL/250mL 接种量3.0-4.0%或活化斜面取一至二环菌苔， 28一30℃ 静置培养24h （3）种子罐培养：4500mL/5000mL聚乙烯瓶 接种量3.0-5.0% 30-35℃ 静置培养24-30h 转接500L塑料罐 （4）发酵罐培养：900L/1000L发酵罐 接种量3.0-5.0% 30-35℃ 静置培养24-30h 当发酵液PH4.0以下，活菌数50亿cfu/ml时停止发酵。 1000mL菌液加10L水，10-15天投加一次。 乳酸菌制剂促进有益藻类的生长，水色鲜活，提高水体溶解氧，降低有害物质的量。 三．小结 试管 三角瓶培养基高压灭菌，种子罐 发酵罐培养基可不灭菌，静置培养。 可用塑料桶代替发酵罐，玉米浆 糖蜜作为发酵主要原料变费为宝。 大曲中微生物的研究 1． 采样：曲样放入无菌袋密闭及时送实验室，用无菌小刀切开曲块，将大曲外中内层混合均匀，无菌条件下粉碎。 2．培养基： 霉菌分离计数培养基：查氏培养基或PDA培养基 PH自然 酵母分离计数培养基：麦芽汁琼脂+0.05%脱氧胆酸钠 PH5.5-6.5 YPD培养基：葡萄糖20g/L 蛋白胨10g/L 酵母膏5-10g/L 细菌分离计数培养基：营养琼脂+0.05%脱氧胆酸钠 营养琼脂（非贫营养型细菌计数）： 蛋白胨 10g/L 牛肉膏 3g/L NaCl 5g/L PH 7.2—7.4 3．培养条件：霉菌 30℃ 5-7天 酵母菌 28℃ 2-3天 好氧细菌 35℃ 2-3天 兼性厌氧细菌 厌氧培养盒35℃ 2-3天 芽孢杆菌 80℃热处理15-20min 35-37℃ 1-2天 4．计数方法： 总细菌计数方法： 1．0g大曲粉加入无菌水99mL/250mL（8-12个玻珠），摇床20-30min 梯度稀释涂布或混菌。高温曲10-3 10-4 10-5 中温曲 10-4 10-5 10-6 35-37℃倒置培养1-2天进行计数。 芽孢杆菌计数：操作同上，将三角瓶置于80℃热处理15-20min杀死非芽孢菌。 梯度稀释涂布或混菌 高温曲10-3 10-4 10-5 中温曲 10-4 10-5 10-6 35-37℃倒置培养1-2天进行计数并镜检。 酵母菌 霉菌 放线菌计数： 酵母菌 霉菌：梯度稀释度 高温曲10-2 10-3 10-4 中温曲 10-3 10-4 10-5 28 ℃倒置培养酵母菌2-3天 霉菌3-5天进行计数。 放线菌：梯度稀释10-1 10-2 5．优势菌初步鉴定： 从平板挑去菌落形态不同菌株进行划线分离纯化并进行个体与群体形态观察。纯化后接种 于相应试管斜面上，编号。把分离纯化优势菌进行个体与群体形态观察，然后进行生理生化鉴定。 6．大曲中的微生物 中温曲 中高温曲 高温曲微生物的类群及数量 单位cfu/g干曲　 中温曲 中高温曲 高温曲 包包曲 芽孢菌 1。8×106 5。3×105 3。75×107 细菌数 总数 3。5-5。0×106 1。4×105 非芽孢菌 1。7×106 9×104 5。3×106 酵母菌属 1。1-7。5×105 7×105 -------- 3。12×106 丝状菌 4。5×106 1。26×106 5。5×102 1。2×107 放线菌 3。6×103 ---------- 优势微生物种类： 包包曲：细菌：不产芽孢细菌 产芽孢菌（枯草 蜡状 地衣芽孢杆菌） 酵母菌：酿酒酵母 产朊 热带假丝酵母 白地霉 霉菌：黑曲 米曲 红曲 毛霉属 中温曲：细菌：芽孢杆菌属 醋酸杆菌属 乳酸杆菌属 节杆菌属 肠杆菌属 假单胞菌属 球菌属， 以常温菌为主，种类较高温曲多。 酵母菌：酵母属和汉逊酵母属 数量多 种类少。 霉菌： 曲霉属 毛霉属 根霉属 串珠霉属 放线菌：链霉菌属 高温曲：细菌：芽孢杆菌属 乳酸杆菌属 梭菌属。由常温类群向嗜热类群转化，由类群复杂向种群组成较为单一转化。多属孢囊不膨大的芽孢杆菌属，其优势细菌主要是枯草 地衣 蜡状 嗜热脂肪芽孢杆菌。 酵母菌：少或无，偶而 检测 工程第三方检测合同工程防雷检测合同植筋拉拔检测方案传感器技术课后答案检测机构通用要求培训 到。 霉菌：主要是毛霉属 根霉属 ，种类单一，多为毛霉属。 放线菌：未检出。 中高温曲：细菌：枯草 地衣 蜡状 嗜热脂肪芽孢杆菌。 酵母菌：耐高温假丝酵母和白地霉占优势。 霉菌：主要是米曲霉 红曲霉和土曲霉等。 7．大曲中酵母菌的分离纯化 大多数酵母菌为腐生，其生活最适pH为4.5一6，常见于含糖分较高的环境中，例如果园土、菜地土及果皮等植物表面。酵母菌生长迅速，易于分离培养，在液体培养基中，酵母菌比霉菌生长得快。 利用酵母菌喜欢酸性环境的特点，常用酸性液体培养基获得酵母菌的培养液（这样做的好处是酸性培养条件则可抑制细菌的生长），然后在固体培养基上用划线法分离之。 （1）富集培养：取5g样品，在试管中加入10ml麦芽汁培养基，同时加入一滴乳酸摇匀，25-28℃ 24h，而后取1ml菌液转入另10ml麦芽汁培养基试管中培养25-28℃ 24h稍长(过长则霉菌长出)。 培养液变浊产膜或沉淀。观察：用无菌操作法取少许菌液置于载玻片中央的0.l%美蓝染色液中，混匀后加盖玻片制成水浸片，先用低倍镜后换高倍镜观察酵母菌的形态和出芽生殖情况。活酵母菌可使美蓝还原，从而使菌体不着色，用此方法可判断酵母菌的死活。 要求：较高的糖50g/l， 抑菌剂 孟加拉红0.03 g/L（许多细菌 放线菌和快速生长的霉菌），PH 4.5。或用乳酸（5 ml）-马铃薯（200g）-葡萄糖（20g）培养基富集。 （2）酵母菌分离：平板划线 涂布或混菌均可。梯度稀释度 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 取 10-5 10-6 10-7,0 .1 ml菌液涂布25-28℃ 48h（若不纯可挑取单菌落连续多次划线）。 （3）酵母菌选择：典型酵母单菌落进行描述性 记录 混凝土 养护记录下载土方回填监理旁站记录免费下载集备记录下载集备记录下载集备记录下载 ，制片镜检，然后选择不同菌落转接于麦芽汁斜面，25-28℃ 24-48h。 （4）酵母菌纯化：挑取10-7 培养基单菌落，在PDA培养基接种25-28℃ 2-5d后，取形态不同 的单菌落传接二次，观察菌落形态确定为单菌落后，分别接种于PDA培养基和MA培养基中，25-28℃ 3d，根据在不同培养基中菌落形态进行初步分类。 产酯酵母和河内白曲混培养 河内白曲：属于曲霉属，在试管12°BX麦芽汁培养基上，菌落初呈白色，背面起皱纹，29－30℃培养4－5天逐渐变成棕红色，分生孢子。生酸量大，能抑制杂菌生长，酶活力、耐酸、耐温性强，酸性蛋白酶含量高，有较强的糖化和发酵能力。 耐高温细菌曲：该菌为厌氧菌，能直接发酵糖类变为酒精，最适生长温度为36℃，死亡温度为60℃，PH值为3.5－7.0，适应范围广，耐酸性强，耐高温，耐酒精，产酒精能力高达120g/L.h，正常发酵温度高出酵母菌6－7℃。 1．​ 三角瓶混培养： 麸皮 80% 鲜酒糟20% 加水量80%（以麸皮计） 水分50-52% 150g/1000ml三角瓶塞棉塞，高压灭菌40-50min，冷却后在无菌室接种。 河内白曲 0。3% 产酯酵母5% （7。5ml） 置于培养箱 28-30℃ 32小时。 2．​ 曲盒混培养：装盒后单独放到曲房内保温培养，开始室温28-30℃，曲盒品温保持28℃左右， 品温不过37℃，培养时间32小时。 3．厚层通风制曲： 麸皮 75-80% 鲜酒糟20-30% 适当加入2%稻糠 ，加水量65-75%（以麸皮计），堆积润料30min，常压灭菌60-80Min，闷料30 min，扬麸散冷38-40℃接种，接种量0。3-0。4%，冬天适当增加接种量，曲料曲房堆积，品温28-30℃，堆积水分50-52%，酸度0．4-0．6．2-3小时后将产酯酵母用喷壶喷洒翻拌均匀再堆积1-2小时装箱，装箱厚度25-30cm，入箱物料疏松，最后用木条刮平。通风：品温28-30℃，每4小时通风一次，室温31-33℃，1 0小时左右，品温上升至33-35℃，可连续通风降温，一般不过35℃，连续培养30小时开冷风排潮，培养时间40小时左右，水分32%左右出房。糖化力735-1012mg/g.h.40℃,酸度0。20-0。35g/100g,孢子疏散，无染菌现象。 培养过程中加强温度控制，入池时室温34℃下约10小时，进入高峰繁殖期，品温上升猛，可达40-41℃，立即通风降温，使品温保持34-35℃。 产酱香细菌高温麸曲的生产 1．斜面培养基： 玉米浆5g/L 葡萄糖5g/L K2HPO4 0.2 g/L MgSO4 0.1 g/L PH 7.0 转接于斜面32-35℃ 2d。 2．三角瓶培养： 培养基配方同上，150mL/500mL三角瓶加棉塞灭菌，斜面接液体，摇床培养32-35℃ 24小时。 3．​ 卡氏罐培养： 玉米浆2g/L 葡萄糖2g/L K2HPO4 0.2 g/L MgSO4 0.1 g/L PH 7.0 装量1/3，加棉塞灭菌，38℃接种，接种量10%，放在摇床上32-34℃培养48小时。 4．​ 细菌高温麸曲生产： 黄曲（培养20小时未成熟）600kg 小麦面300kg 豌豆面100kg 水220 kg 菌液75 kg 40℃进行拌料拌均。 装池培养：室温保持32-35℃，品温38℃，2小时后通风一次，8小时后出池加水130kg，