酵母双杂交

酵母感受态细胞的制备及酵母转化 酵母感受态细胞的制备 转化规模 YPDA 培养基平板上活化酵母菌 小 大 文库 接直径 2-3ml的单克隆 1 个或多个于 1ml YPDA 或 SD a培养基中（最好选用四周之内的酵母菌落） 涡旋打散菌体 转移到表中右面所示体积的 YPDA或 SD 培养基中 50ml 50ml 150ml 30℃，250rpm，振荡培养 16-18h，至 OD600 大于 1.5 转移过夜培养的培养物于表中右面所示体积的 YPDA 中，加入的量要足够使 1 升培养物中 OD600 约达 0.2-0.3 300ml 300ml 1000ml 30℃,230-270rpm，振荡培养 3h 至 OD600 约 0.5(0.4-0.6) 50ml 离心管，室温 1000×g，离心 5min 收集菌体 弃上清，用灭菌的 1×TE 或灭菌蒸馏水重悬菌体 25-50ml 25-50ml 500ml 室温，1000×g，离心 5min 弃上清，用灭菌的 1×TE/LiAc 重新悬浮菌体 1.5ml 1.5ml 8ml 准备 PEG/LiAc 溶液 10ml 10ml 100ml 注：酵母转化分为顺序转化和共转化。a 在顺序转化中，进行第二次转化时，用 SD-Trp 培养基； 上面表中所标出的培养基及试剂的体积不是固定不变的，可根据实验中的实际情况调整，如 PEG/LiAc 溶液，转化时只用 60ml，若准备 100ml 就很浪费。 酵母转化 小 大 文库 在指定管中混合下列成分 1.5ml 50ml 500ml DNA-BD/诱饵 a 0.1μg 20-100μg 0.2-1.0mg AD/文库 0.1μg 10-50μg 0.1-0.5mg Herring testes carrier DNA(鲑鱼精 DNA) 0.1mg 2mg 20mg 加入酵母感受态细胞，涡旋混匀 0.1ml 1ml 8ml 加灭菌的 pEG/LiAc 溶液，涡旋混匀 0.6ml 6ml 60ml 30℃,200rpm，振荡培养 30min 加 DMSO，温柔混匀或旋转（注：此步一定不要涡旋） 70μl 700μl 7.0ml 42℃热击 15min，大规模和文库规模的需要不断旋 转混匀 冰上放置 1-2min 5S(14krpm) 5min (1000×g) 5min (1000×g) 室温离心，弃上清 用 1×TEb重悬 0.5ml 1.0ml或10mlc 10ml 涂板，根据不同严谨度涂不同缺陷平板，低严谨度的涂 SD-Leu-Trp 二缺板；中严谨度的涂 SD-Trp-His-Leu 三缺板；高严谨度的涂 SD-Ade-His-Leu-Trp/X-gal 四缺板。在进行小规模转化时， 将转化子混合物涂于 100mm 的平板上，大规模和文库转化时，涂 150mm 平板。当新的诱饵和文库 结合时，寻找最佳 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 是很难的，因此，分别涂转化子的 1/3 于低、中、高严谨度的平板上。 30℃倒置培养至克隆出现，一般 3 天左右 选取克隆进行 β-半乳糖苷酶显色实验 注意：a 在共转化实验中，建议使用 DNA-DB vector 与 AD vector 比例为 2:1(摩尔比)，转化效率 最好；b 若需要高严谨度的筛选时，用 YPDA 重悬，培养基有利于转化热击时酵母细胞的恢复， 对筛选没有副作用；c 共转化时用 1.0ml TE 悬浮，在顺序转化中的第二次转化时用 10ml TE 悬浮。 另外，在做互作或文库筛选时，需要做阳性和阴性对照：PCl1 为自激活对照； pGADT7-T+pGBKT7-53 阳性对照；pGADT7-T+pGBKT7-lam 阴性对照。 为了检测每一个质粒的转化效率，用 100μl 水稀释 1μ l 转化子，铺于 SD-Leu和 SD-Trp 平板上；为了检测共转化效率，按不同比例（1:1000，1:100，1:10）稀释转化子，取 100μl 涂于 SD-Leu-Trp 平板上； 酵母培养基： YPD medium (1L) Dific peptone（可用 OXOID 公司的胰化蛋白胨）20g/L Yeast extract 10g/L Agar（for plates only） 20g/L 加蒸馏水 950ml 调 pH 6.5 高压灭菌，待冷却到 55℃左右，加 40％的葡萄糖 50ml 至终浓度 2％。 40％葡萄糖：40g 葡萄糖加 60ml 左右的蒸馏水溶解，然后定容至 100ml，过滤灭菌，4℃ 存放。注意，一定不能高压灭菌，因长时间高温会使葡萄糖变黑。 YPDA medium (1L) 在上面的 YPD 培养基中每升加 0.2% 的腺嘌呤半硫酸盐（adenine hemisulfate）15ml 至 终浓度 0.003%，高压灭菌。 0.2% adenine hemisulfate： 0.2g 加 100ml 蒸馏水溶解即可。 注：如果需要在 YPD(YPDA) 中加抗生素如 kanamycin，在上面准备的培养基中加 50mg/ml 的 Km0.2-0.3ml 至终浓度 10-15mg/L SD medium (1L) 无氨基酸酵母氮源（yeast nitrogen base without amino acids, YNB） 6.7g/L Dific 琼脂 （Dific Agar，for plates only） 20g/L 10×DO （Dropout Solution） 100ml 蒸馏水 850ml NaOH 调节 pH 5.8，高压灭菌，待冷却到 55℃左右，加 40％的葡萄糖 50ml，至终 浓度为 2％。 注：如果使用固体 DO，1L 中加 0.64g。 下面氨基酸成分是无缺陷 DO 中所需的所有氨基酸： Nutrient 10X Concentration L-Adenine hemisulfate salt 200 mg/L L-Arginine HCl 200 mg/L L-Histidine HCl monohydrate 200 mg/L L-Isoleucine 300 mg/L L-Leucine 1000 mg/L L-Lysine HCl 300 mg/L L-Methionine 200 mg/L L-Phenylalanine 500 mg/L L-Threonine 2000 mg/L L-Tryptophan 200 mg/L L-Tyrosine 300 mg/L L-Uracil 200 mg/L L-Valine 1500 mg/L 根据所需不同营养缺陷型，去掉相应的成分 例如: 配制 1L 10X –Leu/–Trp DO 溶液，按下面成分配制: • 200 mg adenine hemisulfate • 200 mg arginine HCl • 200 mg histidine HCl monohydrate • 300 mg isoleucine • 300 mg lysine HCl • 200 mg methionine • 500 mg phenylalanine • 2000 mg threonine • 300 mg tyrosine • 200 mg uracil • 1500 mg valine 将上面的成分溶解在 1 L 的去离子水中，过滤或高压灭菌。 酵母转化所用试剂： • 鲑鱼精DNA（Herring testes carrier DNA） (10 mg/ml) 使用前，沸水浴20min立即冰上冷却。为了提高转化效率，建议使用高质量的鲑鱼精DNA。 • PEG/LiAc solution (polyethylene glycol/lithium acetate) 现用现配 终浓度 准备10 ml 溶液 PEG 4000/3350 40% 8 ml of 50% PEG TE buffer 1X 1 ml of 10X TE LiAc 1X 1 ml of 10X LiAc • 储存液（Stock solutions） 50% PEG 3350 (Polyethylene glycol, 聚乙二醇，分子量为3,350)灭菌去离子水配制，50g 加60ml 水加热溶解，然后定容100ml。 • 100% DMSO (Dimethyl sulfoxide)，二甲基亚砜 • 10X TE buffer: 0.1 M Tris-HCl, 10 mM EDTA, pH 7.5. 高压灭菌。 • 10X LiAc: 1 M lithium acetate，用稀释的醋酸调pH 7.5 高压灭菌。 β-galactosidase Filter Assays 试剂和材料的准备： Whatman 5# 滤纸或Grade 410滤纸，灭菌处理 镊子，用来夹取滤纸 Z buffer 储存液 X-gal 储存液 Z buffer/X-gal 溶液 液氮 操作方法： 1．为了得到最好的结果，用新鲜的克隆（一般30℃培养2-4天），菌落直径1-3mm。 2．配制Z buffer/X-gal 溶液 3．预先将滤纸放在盛有2.5-5.0ml的Z buffer/X-gal 溶液的培养皿中。 4．用镊子夹取一张干净、干燥的滤纸放在长有菌落的平板上，轻轻用镊子摩擦将滤，帮 助菌落附着在滤纸上。 5．透过滤纸，在三个不同的方位上穿孔（不对称的方位），此方法用于在培养基上确定 滤纸的方向。 6．当滤纸均匀湿润后，用镊子小心将滤纸从培养基上取下，转移到液氮中，浸没在液氮 中10妙。 7．取出液氮中冷冻过的滤纸，室温下融化。 8．小心将滤纸正面朝上，放在第三步预处理的滤纸上，避免在两层滤纸中间产生气泡。 9．将带有两层滤纸的培养皿放于30℃或室温下，定期检查蓝色菌落的出现情况。一般8 小时之内变兰的可初步定位阳性克隆。 10． 在平板上找到与蓝色菌落相对应的菌落，挑相应的蓝色菌落到新的培养基平板 上。 方法改进：先在一个培养皿中铺一张普通灭菌滤纸，再加2.5-5.0ml Z buffer/X-gal溶液将 滤纸润湿；然后将显色滤纸（Whatman 5# 滤纸或Grade 410滤纸）剪成长方形，放在培 养皿中，加少量灭菌水润湿，用牙签挑取菌落轻轻在滤纸上划线，直接液氮冷冻10妙钟， 取出室温融化，放在预先准备好的滤纸上，避免在两层滤纸间产生气泡。做好标记后， 放在30℃或室温下，定期检查蓝色菌落的出现情况。一般8小时之内变兰的可初步定位阳 性克隆。 储存液 • Z buffer 储存液 Na2HPO4• 7H2O 16.1 g/L NaH2PO4• H2O 5.50 g/L KCl 0.75 g/L MgSO4 • 7H2O 0.246 g/L 调 pH 7.0 高压灭菌，室温可以保存一年。 • X-gal 储存液 溶解20mg 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D- galactopyranoside, X-GAL)于100ml N,N-二甲基甲酰胺(N,N-dimethylformamide, DMF)中，配成浓度为20 mg/ml，–20℃黑暗储存。 • Z buffer/X-gal 溶液 100 ml Z buffer 0.27 ml  β-mercaptoethanol (β-ME) 1.67 ml X-gal 储存液 参阅clontech 公司的酵母双杂交系统3的说明书，《Yeast protocol handbook》和 《MATCHMAKER GAL4 Two-Hybrid System 3 & Libraries User Manual》。