%9e%8bHIV1毒株gp120序列特征分析及其蛋白的表达

·424· 生堡邀生堑堂塑免瘴堂盘盎2Q堕生!旦筮!!鲞筮!魍g堕!』丛i!翌!型墅墅坐!：丛业!Q鲤。!!!：丝：型!：§ 5株不同亚型HIV．1毒株gpl20序列 特征分析及其蛋白的表达 王铮 李敬云 鲍作义 李韩平庄道民 刘思杨 李林 【摘要】 目的分析我国HIV．1主要弧型毒株的gpl20区域的序列特征，并表达出gpl20糖基 化蛋白，为研究gpl20的致病机制和设计疫苗奠定基础。方法利用巢式PCR从来自于不同省份的 5名HIV一1感染者外周血单个核细胞DNA中扩增全长gpl20基闪并测序，对序列特征进行分析，并将 获得的gpl20基因克隆入真核表达载体，体外表达获得gpl20糖基化蛋白。结果序列分析显示，此 5条gpl20序列分属HIV-I11hai-B、BC重组和AE重组哑型，虽然亚型不同，但这些gpl20序列在相同 的位置都存在着一些保守的糖基化位点，且都具备相同的Furin蛋白酶第一切割位点，与参考序列比 较发现，不同的HIV亚型序列中，除V3序列长度较为保守外，Vl、V2、v4、V5各区域都有不同程度的 缺失现象，与Bc重组和AE重组哑型相比，Thai-B亚型”的顶端环呈现出多种组合。最终将这5条 gpl20序列都克隆人真核表达载体并表达出糖基化的gpl20蛋白。结论在设计疫苗和检测试剂时 应考虑到膜区的高变性，gpl20糖蛋白的体外表达有利于进一步开展针对我国主要HIV流行毒株膜 蛋白致病机制和疫苗学的研究。 【关键词】HIV-1；gpl20；糖基化蛋白 Theanalysisof5I-IIV-1gpl20sequencesfromdifferentcladesandexpressionoftheircorresponding proteinsinvitroWANGZheng，UJing·yun，BAOZuo—ri，LIHan-ping，ZHI／ANGDao—min，UUSi— yang。LILin．StateKeyLaboratoryofPathogenandBiosecurity，PLACenterforHrvTest。InstituteofMicro· biologyandEpidemiology，AcademyofMilitaryMedicalSciences，&彬ng100071，China Correspondingauthor：HJing—yun．Email：l泌@nic．bmi．ac．cn 【Abstract】ObjectiveTocharacterize5gpl20sequencesfrommainlycirculatingcladesinChina andexpressionoftheirgpl20glycopmteins．Methodsgpl20geneswereamplifiedfromthePBMCsof5 HIV-linfectedindividualsindifferentprovincesusingnestPCRandtheirDNAsequencesweredetermined． Sequencecharacteristicswereanalyzedandgpl20genesweresub-clonedintothemammalianexpressionvec— tortoproducegpl20glycoproteins．ResultsSequencecharacteristicsindicatedthesesequencesbelongto thecladeThai·B，CRF—BCandCRF—AE，r_e|spectively．ThereweresomeconservativeN-linkedglycosyla- tionsitesandprimaryFurinproteasecleavagemotifsinthesamepositionswithingpl20aminoacidse· quencesalthoughthesegpl20sec驴enceswerecategorizedintodifferentelades．Incomparison试threferen— tialstrains。aminoacidsdeletionswerefoundintheVi。V2，V4，V5regionsexceptfortheV3loop；above all，V3tipmotifsofThai—BexhibitedthemorepolymorphicformsthanthoseofCRF—BCandCRF—AE． These5gpl20sequenceswereclonedintotheeukaryoticexpressionvectorandgpl20glycoproteinswere pmducedsuccessfully．ConclusionHyper-variablenatureofEnvshouldbeconsideredwhiledesigning HIV—lvaccineortestreagent，andgpl20expressioninvitroishelpfultofurtherresearchontheEnvpatho- genesisandvaccinedevelopmentagainstthemainlycirculatingHIV·1isolatesinChina． 【Keywords】HIV-l；gpl20；Glycoprotein HIV．1分为M、N和0三群‘1引。M群在全世界 流行最广，可分为A～J10个亚型(或分支)，并呈现 出地理上的区域分布特征。其中B亚型是最主要 DOI：10．3760／ema．j．issn．0254-5101．2009．05．010 基金项目：国家自然科学基金资助项目(30700706) 作者单位：1000r71北京，军事医学科学院微牛物流行病研究所全 军艾滋病检测中心，病原微生物生物安全国家重点实验室 通信作者：李敬云，Email：坷y@hie．bmi．卵．en，电话：010— 66948566 ．病毒学． 的流行亚型，主要发现于北美和欧洲，A、D亚型主 要流行于非洲，C亚型则分布于非洲和亚洲，这些亚 型形成了代表HIV．1M群的系统进化树上的不同 分化枝。而不同亚型HIV的共感染则导致了循环 重组型的形成(circulatingrecombinantforms，CRFs)o 我国的优势亚型为Thai—B亚型、CRF—BC亚型和 CRF_AE亚型。 HIV．1传人我国已经近20年。我国地域辽阔、 万方数据 主堡筮生物堂塑复瘴堂盘壶!Q塑生!旦筮22鲞筮!魈gbi坠』M适些丛!型坚咝：丛型!Q塑：!尘：垫：堕2：§ 人口和自然环境复杂，还有许多社会学因素的作用， 造成不同地区HIV—l的流行和进化规律也各不相 同。而我国此前研究HIV一1咖，基因的变异主要是 针对HIV的C2．V3区序列进行分析，但此种只针对 gpl20部分区域的分析往往会遗漏病毒重要的遗传 和变异信息。因此，获得我国目前主要HIV—l流行 毒株的全长gpl20序列，能够进一步掌握我国HIV 毒株的遗传背景及变异情况，对设计和发展我国的 抗病毒药物、疫苗研究和诊断方法的改进具有重要 的意义。 本研究旨在获得我国主要HIV．1流行毒株的全 长gpl20序列，利用生物信息学方法进行序列分析， 并将全长gpl20序列克隆入真核表达载体，表达出 相应的gpl20糖蛋白，为进一步开展针对我国主要 HIV流行毒株的变异进化和疫苗学研究奠定基础。 方法和材料 研究对象：外周血单个核细胞(peripheralblood mononuclearcells，PBMCs)来自全国不同地区的5名 HIV-l感染者，分别来自广西(样品编号GX48、 GX79)、河南(样品编号HN24)、宁夏(样品编号 NX22)、甘肃(样品编号GS22)，以上感染者的感染 途径为卖血或静脉吸毒。所有样本的采集均是在患 者知情同意的前提下，由经过培训的专业医护人员 对感染者基本情况进行调查，填写专门设计的调查 表，使用一次性真空采血管采集EDTA抗凝全血约 14rIll。 质粒与菌株：pUCl8一T载体、感受态大肠杆菌 DH5o【、HBl01由本实验室保存，真核表达载体 pJW4303、克隆有毒株JR—FLgpl20区域的pJW4303 重组载体和兔抗HIV—lgpl20A、B、C、D、E各亚型 的血清C29．1由美国马萨诸塞大学医学院核酸疫苗 实验室提供。pfu高保真DNA聚合酶购自Strate— gene公司，各种限制性内切酶购自NEB公司，LA TaqDNA聚合酶购自TaKaRa公司，Western—Light发 光试剂盒购自AppliedBiosystems公司。 提取前病毒DNA：分离出感染者PBMCs，将其 与来自健康人的PBMCs共培养一周后，利用Omega 公司的DNAbloodextractionkit提取PBMCs基因组 DNA，按照按试剂盒说明书操作。 PeR扩增获得病毒gpl20序列：采用nested— PCR方法扩增HIV一1e／／,v基因的gpl20，利用Env—l、 Env-2为外侧引物，Ugpl20和Dgpl20为内侧引物 (表1)，使用的酶为LADNA聚合酶。第一轮PCR 程序设置如下：94℃2rain，94℃30S，60℃30s， 72。C3min30S(25个循环)；72℃10min。第二轮 程序设置如下：94℃2rain，94℃30S，56℃30S， 72℃lrain30s(25个循环)，72℃10min。产物采 用TA克隆法直接克隆入T载体，转化大肠杆菌，菌 落PCR鉴定阳性克隆。克隆测序获得gpl20序列。 表1引物序列及其在ItlV基因中的位置 Table1．Prilnersequencesandtheirlocationsonthe HIVgenome 引物 序列(5’q’) 位茕 Env一1 GA从GAGCAGAAGACAc．眦从TG 6206—6227 Env-2 TCCAGTCCCCC盯rr陀rY竹AAA从G9063—9086 U印120 TGTGGGTCACA(T)GTCTAT(C)TATC,GGGTAC6328—635l D印120 TGCGCCATA删CTGCTGCl℃7795—7816 gpl20．D_nCTrGTGGGTCACAGTCTATrATC觚TACC6323—6352 印120母blGGTCC,6ATCCrrACTCCA(=(=ACrcTrcIL'TVrC咒c7723—7749 gpl20真核表达载体的构建：利用高保真pfu聚 合酶和引物gpl20-P—fl和gpl20一P—bl(表1)从获得 的gpl20克隆载体中扩增gpl20，PCR反应程序如 下所示：94℃2min，94℃30S，56℃30S，72℃1min 30s(19个循环)，720C10min。经凝胶纯化PCR产 物。NheI酶切pJW4303，回收酶切产物后用Kle— now补平黏性末端，再用BamHI酶切，加T4DNA 连接酶与用BamHI酶切的PCR产物进行过夜连 接，获得重组表达载体。 重组DNA载体的体外表达及其鉴定：利用 lO斗gDNA质粒转染10cm2培养皿中培养的 5×106293T细胞，采用磷酸钙共沉淀法转染，12h 后吸去上清，更换为无血清DMEM培养基，48h后 收集上清于一80℃冻存。Westernblot检测上清中 gpl20的表达，吸取20山上清煮沸上样，经聚丙烯 酰胺电泳后，转移到PVDF膜七，0．5％l-Block4℃ 封闭过夜。按1：200的稀释度将anti．gpl20兔血清 溶于10rIll封闭液中，在慢速摇床上放置60min。 用15mlblockingburr先以每次10min的时间清 洗两次，再以每次30min的时间清洗PVDF膜两 次。按1：5000的稀释度将碱性磷酸酶标记的羊抗兔 二抗稀释到5mlblockingbuffer中，与PVDF膜孵育 l h。用20mlblockingbuffer10rain2次，20rain2 次，清洗PVDF膜4次。将PVDF膜放置于20Inl assaybuffer中清洗2次，每次2min。再将PVDF膜 夹于塑料文件夹中，将蛋白结合面向上放置，加入 CSPD和Nitro·Block按20：l混合的发光液。室温下 反应3～5rain，用滤纸吸去PVDF膜表面的液体后， 将其夹人透明文件夹中。在暗室中进行压片，曝光 万方数据 生堡筮生塑堂塑鱼瘥堂盘壶!Q螋生!旦筮!!鲞筮!翅g!垫』堕!!尘i!!地型!!!：丛盟!Q螋：坠!：垫：№：1 3 min后洗片。并将x光片扫描留作 记录 混凝土 养护记录下载土方回填监理旁站记录免费下载集备记录下载集备记录下载集备记录下载 。 结 果 1．测序及序列分析结果：PCR扩增出gpl20基 因并进行测序，将测序结果提交至GenBank，获得序 列的收录号分别是：ABK42019(HN24)、EU908737 (GS22)、EU908738(GX48)、EU908739(GX79)和 EU908740(NX22)，将序列提交至网站http：／／www． hiv．1anl．gov，进行分析比对后确定各病毒膜区序列 亚型，从GenBank中下载分离自中国的各亚型HIV 膜蛋白gpl20氨基酸序列作为参考，利用MEGA3．1 将其与GX48、GX79、NX22、GS22、HN24一起作系统 进化树分析，毒株序列主要聚为3簇，可见5株病毒 分为BC重组、AE重组和Thai．B3类，其中，GX48、 GX79为CRF01一AE，NX22、G$22为CRF—BC，HN24 为HIV．1Thai．B亚型，代表了我国目前流行的主要 HIV一1毒株(图1)。 图1针对5条原代分离株gpl20氨基酸序列的系统进 化分析结果 Fig1．Phylogeneticanalysisofgpl20aminoaddse- quencesof5primaryisola、tes‘ ‘ 2．糖基化位点分析：gpl20蛋白为高度糖基化 的外膜糖蛋白，是HIV吸附和侵入细胞的重要结构 蛋白。除了参与封闭中和抗体的应答外，糖基的重 排还能够补偿由于病毒逃逸中和抗体导致局部氨基 酸的变化而引起的膜区构象改变∞o。GS22有29个 N．连接的糖基化位点，GX79有25个糖基化位点， NX22、GX48、HN24都有24个糖基化位点。虽然这 些糖基化位点的分布并不具有规律性，但仍然可以 推测出一些重要位点的糖基，如图2中所示的位于 54、134、138、1857222、2297250、264、277、3427 378、 447的N．连接糖基化位点，虽然这5条分离毒株来 自于3个不同的亚型，但是这些糖基化位点存在于 5条序列中相同的位置，推测这些糖基可能是维持 病毒包膜蛋白的构象稳定所必需的。在病毒的高变 区V1、v2、v3、v4、v5，各分离株糖基化程度不一， 出现的位置和数量也各不相同。 3．蛋白酶切割位点分析：成熟的膜蛋白由一个 相对分子质量(M，)为120×103的亚单位非共价结 合到41×103的穿膜单位上，HIVEnv蛋白剪接前 体作为一个gpl60多聚蛋白合成，此后，蛋白剪切前 体被相关的细胞内蛋白酶加以修饰，此过程推测是 、 发生在转运高尔基体网络中。细胞酶切割gpl60的 基序是R—X．R／K．R，但也可以切割第二个位置：K— x．K—R-R，该位置位于第一个切割位点N末端第8 个氨基酸处H引。除NX22的切割基序为R—G-K．R 外，GS22、GX48、GX79、HN24的切割基序均为R—E— K．R，更为重要的是HN24还拥有第二个切割位点 K．A．K．R．R(图2)，这就意味着Furin蛋白酶可以比 其余毒株更高的效率切割该病毒膜蛋白前体，从而 产生更多的感染性病毒粒子∞J。 4．高变区域分析：从GenBank中获得分离自我 国的各亚型HIVgpl20序列，在各亚型序列之间进 行比对分析，并确定出gpl20上的5个高变区V1、 V2、V3、V4、V5，结果如图3所示，总体来看，3种不 同的HIV亚型序列中，除v3序列较为保守外，Vl、 V2、V4、V5各区域都有不同程度的缺失，从而造成 各区域的长度也不尽相同。对于BC重组亚型 GS22来说，其V1／V2茎环区域(93个氨基酸)要长 于所有其余的BC重组毒株。序列比对还提示，在 AE亚型中，V1和v2都有不同程度的缺失，而在BC 亚型中，大量的序列缺失主要发生在V1区，V2倒 显得较为保守。Thai．B亚型的序列缺失也主要发生 在V1区域。V3区域由于是病毒结合辅助受体的 重要区域，相比较其余的高变区来说比较保守，V3 环顶端4肽更是主要的特异性抗原决定簇，可诱导 宿主产生中和抗体和CTL反应。序列分析显示我 国流行的AE亚型和BC重组亚型顶端4肽以 GPGQ为主，而Thai．B亚型则是呈现出GPGQ、 GPGR、GPGK和GQGR等多种组合。gpl20的v4 万方数据 和v5区域也是两个变异率较高的区域，3种亚型的 gpl20序列比对皆显示此二区域氨基酸丢失较多， 差异也大。对于v4和V5区域，还没有对它们绝对 作用的描述，虽然删除V4区域会破坏印160的折 叠，但v4区域看起来还似乎可以允许外源抗体表 位的插入pj。 5．gpl20表达载体的构建及蛋白表达的West- crnblot分析：利用高保真pfu聚合酶和引物gpl20一 p—fl、gpl20一P·bl从获得的gpl20克隆载体中扩增 gpl20，再克隆人哺乳动物表达载体pJW4303。此载 体中包含一个tPA(tissueplasminogenactivator) leader，在克隆完成后，gpl20的原始信号肽序列会 被tPAleader所取代，此外，该载体还含有一个CMV 启动子和一个IntronA序列[7-8]，已有的实验研究证 明这些改造可以有效地提高DNA重组载体在体外 的表达效率一J。以10斗gDNA质粒采用磷酸钙共 沉淀法转染293T细胞，48h后收集无血清培养基 上清进行Westernblot，一抗为抗HIV一1gpl20A、B、 C、D、E各亚型的兔血清C29．1。曝光时间为3rain。 Westernblot结果显示在培养上清中，均可以见到高 度糖基化的典型弥散的gpl20条带(图4)。证实了 gpl20蛋白表达的成功。 讨 论 我国流行的HIV—l毒株主要有CRF07一BC、 CRF08一BC、Thai—B和CRF0l-AE这4种亚型，目前 国内的分型研究主要是单纯的对C2．V3区域的扩 增和分析上，但gpl20作为HIV基因组中最高变的 区域，要想真正全面地了解病毒膜蛋白的生物学特 性和致病机制，必须获得病毒的全长gpl20。 在H1V感染过程中，病毒的膜蛋白首先被合成 一个单独的多肽剪接前体。在高尔基体中，膜蛋白 随后被寡聚化并接受广泛的糖基化修饰。经在高尔 基体内加工完成的糖蛋白，肘，约为160×103，在跨 高尔基体网上被碱性氨基酸酶和等价胞质内切酶切 割成gpl20和gr,41。gpl20和gp41依靠微弱的非 共价键连接在一起形成gpl20一gp41复合物，该复合 物最初表达在被感染细胞的表面。在病毒出芽的过 程中，gpl20．9041复合物被组装进病毒的膜区并以 剌突的形式展示在病毒表面。104¨。 ．，．罢2．：妻．：二：篡1竺序列中的N-连接糖基化位点位 gpl20单体模型表明糖基很可能覆盖着刺突的 置和芝咖2切A割li位点的比较 外表蔷从而≤藩蒜老葛磊磊氧：藉薹某；釜磊器№． gnmentofN．glycosylatlORsitesandFurin7o”“”””⋯’⋯”。⋯九属用、11’’阳尘1．刁““” cleavagesites锄蚰g5gpl20seq咖嘣 很不理想的结合靶标，因为这些糖是由宿主的细胞 注．糖基化位点以方框标出，Furin切割位点以下划线标出 产生的，不具有免疫原性。这些静态的糖基覆盖面 万方数据 ·428· CladeAE CX■0 CX79 FJ●SS矗E FJ●62矗￡ FJ●S2RE 97cn口x2F囊E 97CHCX'1F—E FJ●51囊E CX■● CX79 FJ●SS—E FJ●62■E FJ●52日E 97Cnqx2F一￡ 97CHCX11F矗E FJ●S1^E CX■0 CX79 FJ●S5冉￡ fJ●62囊E FJ●S2nE 97cnqx2F^￡ 97CHCX1'F—E FJ●S1一E CkdeBC CS22 ●●X22 V●●RL96'3●C CHl●91BC 90CHO髀BC 97CH●01BC CHll7BC CHll■BC CHllSBC CHHl9C CS22 ’●X22 V嘲L96'3■C CH●918C 98CH●_一0C 97CHo●1BC CHll7BC CHll■BC CHllSBC CHH'9C CS22 ●●X22 V●●RL'6'3●C CH●91BC 98CH●●90C 97CH●■'BC CHll7BC CHll■BC CHll5BC CHHl9C 生堡徵生塑堂塑鱼瘴堂苤查2Q塑生!旦筮塑鲞星!塑g堑坠』丛i!咝迪!虹坚丛：丛型!Q塑，!尘：垫，盟!：§ 卜——————一V17V2bop—IUrLCUnKlT●ILlIHI瞄mIOS_I‘⋯⋯一一ll儿W峨IF_¨fIRO“OXUHnLFV■LOIUP惜C●tS⋯⋯⋯一EV队I●tHTS ¨儿C¨L●CTm擅TH-·IH。llImPHIC⋯⋯一HLI虻ulKTf帅IEL口OI¨‘OUHnLFVXLDlVPI惜．s惜⋯⋯⋯一TF札lHC惦S ¨rL¨n嗽lHI嚏町^T儿SHl“SSI●V●一儿曩HIIOlUl垃SF哪舡1种IORKUVSLFV札OIUPID’嗍SO’略⋯一SR￡V札I呲HTS LT札CUlt峨lO●曙ⅢT哪IITI哪TTIT⋯⋯IU‘HIT收UI睡SF LI几CVTUtt⋯··S●瞳T冀U’■■llSH吖●●-一II‘HllO￡Ul’CSF LInCUI¨霉卜⋯-№●■¨6HHII峨PH⋯一¨CHITOEUl●tTF ¨rtCUn心T_H·L№WI瞄嘲¨瞄P*⋯一¨‘HltOE“吒lfIl九咖，l孵，糠●州匹盯¨US_卜⋯⋯⋯雌一lIpO口l啦" I． Vj∞O口 ．● 卜P—————————一 ‘——————叶I lS呱l眦T■PFnI-lSlSICq‘口饥帆llSIICO■I■VCEI瞄Il哪 l钟EI垃SIrFlHI-TS¨ICP‘R虾性ICSIICOl_l^VCEU峨l’●●■ SS帅l峨f囊PS●●●■IlⅢFC，CH哪nIClllCOl_口囊Y州lS冀II唧 lsuEl嗽I"S_IRlSIRI‘，‘仰f”IC_llCOIRI●V“l嚆Il_￡ lS呱I啦IRrS_TllSI_I‘P‘OLF性I‘OlICOl_●●VCEI幔TI懈 lSufl啦T曩rSHm囊ISIlHCP‘口uf”I‘DIICOIRl囊VCEIH引l■t lSVEl峨TlPS嘲IRISlSlCP‘O僻V_l‘OlI‘OI■I¨CEI瞒SI慨 llUlI峨T■rS_IRISllICr‘札¨lICEIICOI¨●VCEl曩Il_l I卜V51 TROcl^I●●_一·TH·-ETFRPCCC TROCCOSHK— fROCCNH●帅TRDCCTH⋯ TRDCC^H～ TRDCC日DH一一 TRDCCOHH—一 TRDCCCH⋯ -T●tTEIFRPCCC 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起的作用还知之甚少。这也为我们开展F一步的研 究提供了思路。 从分析结果可以看出，各亚型HIV·lgpl20序 列中的5个高变区，除V3区域较为保守、无缺失 外，V1、V2、V4、V5各区域都有不同程度的缺失。 V3区域由于其在病毒感染和复制中的重要作用，在 各亚型的HIV病毒中都趋于保守，尤其是顶端环4 肽，AE重组亚型和BC重组亚型的V3环顶端4肽 几乎全是GPGQ一种组合，但Thai—B亚型的gpl20 V3环顶端序列却以GPGQ、GPGR、GPGK和GQGR 这4种形式出现。V3区域是中和抗体447-52D识 别的表位，此表位的核心序列为GPGR，并导致V3 区域采用一个显著的Ⅱ型B．发夹样转角。GPGR外 侧的特定氨基酸替代，特别是在V3区域的N端片 段，也会影响抗体对该表位的结合【15-J6J。值得注意 的是类似于447-52D的抗体迄今为止还没有在非B 亚型病毒中被发现，虽然这些病毒中的V3区包含 了一个GPGQ序列而且比B亚型中的GPGR序列更 加保守：”】。 病毒的Furin蛋白酶切割位点是容易被忽视的 一个潜在毒力因子，膜蛋白前体剪切后的三聚体继 续通过高尔基体接受N一连接的糖基化修饰直到成 熟的病毒刺突被运送到细胞膜上以用来组装病毒颗 粒。切割过的膜蛋白才是具备融合功能性的，未切 割的Env形式只能结合到CIM而可以使病毒吸附 到细胞上[18l，却不具备进入细胞所必需的膜融合能 力。 在对该组HIVgpl20全长序列的重要特征进行 分析的同时，我们还构建了gpl20的真核表达载体， 经Westernblot反应提示，表达出的蛋白可以为兔抗 gpl20抗体所识别，由于该真核载体pJW4303还可 用作DNA疫苗载体，所以本工作为进一步研究 gpl20蛋白的功能和开展相关免疫学研究奠定了基 础。 参 考 文 献 [1]ClavelF，HogganMD，WilleyIlL，eta1．Geneticrecombination ofhumanimmtmodofieiencyvirus．JVirol。1989，63(3)：1455- 1459． 【2]Wong-$taalF，ShawGM，HahnBH，eta1．Genomicdiversity0f humanT—lymphotropievinmtype111(H11v-III)．Science，1985， 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芝麻主要过敏原清蛋白基因的克隆表达、纯化及免疫学鉴定 徐栋梁 邬玉兰 刘志刚 孔小丽 芝麻是哑洲地区重要的油料作物， 主要含有两种储存蛋白，为llS的球蛋 白和2s的清蛋白，这两种蛋白占芝麻中 总蛋白的80％～90％，清蛋白是其中主 要的致敏蛋白之一。从SWISS—PROT和 TrEMBL以及NCBI的GenBank等数据 库下载到一些芝麻中清蛋白的核酸序 列，利用生物信息学方法对这些芝麻清 蛋白序列进行同源性比对，确定其保守 区域。根据这些序列，设计并合成简并 性引物：sesiljs：5’-ATGGCGAAGAAGC- TCGCA-3’，sesiljx：5'-CTACACAAAGAT- AACTCGGAATFGG-37。分别提取黑、白 芝麻的总RNA，然后采用RT-PCR技术 DOI：10．3760／cma．j．im．0254-5101． 2∞9．05．Ol】 基金项目：国家自然科学基金 (30871752)；深圳市深港创新圈项目、深圳大 学校科研基金(200712、200807)；国家质检总 局项目 作者单位：518060深圳大学过敏反应与 免疫学研究所 通信作者：刘志刚，Email：LZG@89t1． edu．cn，电话：0755-26535077 分别从黑、白芝麻中克隆出清蛋白的基 因。在GenBank数据库中，白芝麻清蛋 白基因的登录号为FJ222624，黑芝麻清 蛋白基因的臀录号为FJ222625。 为了将黑、白芝麻清蛋白eDNA片 段连入pET-28a表达载体，在其cDNA 的5’和3’端通过PCR引物分别加入了 EeoRI和Xhol酶切位点。回收PCR 产物连接到pMDl8．T载体上，转化大肠 杆菌TOPl0，菌落PCR及EeoRI和 Xhol酶切鉴定。阳性菌落提取质粒，所 得质粒与原核表达载体pET-28a分别进 行EcoRI和XhoI双酶切，并将获得的 基因片段与pET-28a的酶切产物相互连 接，构建重组表达质粒。以重组质粒转 化大肠杆菌TOPl0，菌落PcR鉴定，提 取阳性质粒，进行双酶切鉴定，阳性克隆 经测序鉴定后用于诱导表达。上述阳性 菌落提取质粒，所得质粒与原核表达载 体pET-28a分别进行EcoRI和XboI双 酶切，并将获得的基因片段与pET-28a 的酶切产物相匝连接，构建重组表达质 粒。以重组质粒转化大肠杆菌TOPl0， ．基础免疫学． 菌落PCR鉴定，提取阳性质