Lorwy法测蛋白浓度

Folin—酚试剂法(Lowry法) (一)实验原理 这种蛋白质测定法是最灵敏的方法之一。过去此法是应用最广泛的一种方法,由于其试剂乙的配制较为困难(现在已可以订购),近年来逐渐被考马斯亮兰法所取代。此法的显色原理与双缩脲方法是相同的,只是加入了第二种试剂,即Folin—酚试剂,以增加显色量,从而提高了检测蛋白质的灵敏度。这两种显色反应产生深兰色的原因是:?在碱性条件下,蛋白质中的肽键与铜结合生成复合物。?Folin—酚试剂中的磷钼酸盐—磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原,产生深兰色(钼兰和钨兰的混合物)。在一定的条件下,兰色深度与蛋白的量成正比。Folin—酚试剂法最早由Lowry确定了蛋白质浓度测定的基本步骤。以后在生物化学领域得到广泛的应用。这个测定法的优点是灵敏度高,比双缩脲法灵敏得多,缺点是费时间较长,要精确控制操作时间, 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 曲线也不是严格的直线形式,且专一性较差,干扰物质较多。对双缩脲反应发生干扰的离子,同样容易干扰Lowry反应。而且对后者的影响还要大得多。酚类、柠檬酸、硫酸铵、Tris缓冲液、甘氨酸、糖类、甘油等均有干扰作用。浓度较低的尿素(0.5%),硫酸纳(1%),硝酸纳(1%),三氯乙酸(0.5%),乙醇(5%),乙醚(5%),丙酮(0.5%)等溶液对显色无影响,但这些物质浓度高时,必须作校正曲线。含硫酸铵的溶液,只须加浓碳酸钠—氢氧化钠溶液,即可显色测定。若样品酸度较高,显色后会色浅,则必须提高碳酸钠—氢氧化钠溶液的浓度1~2倍。 进行测定时,加F olin—酚试剂时要特别小心,因为该试剂仅在酸性pH条件下稳定,但上述还原反应只在pH=10的情况下发生,故当Folin一酚试剂加到碱性的铜—蛋白质溶液中时,必须立即混匀,以便在磷钼酸—磷钨酸试剂被破坏之前,还原反应即能发生。 此法也适用于酪氨酸和色氨酸的定量测定。 此法可检测的最低蛋白质量达5mg。通常测定范围是20~250mg。 (二)试剂与器材 1.试剂 (1)试剂甲: (A)10克Na2CO3,2克NaOH和0.25克酒石酸钾钠(KNaC4H4O6·4H2O)。溶解于500毫升蒸馏水中。 (B)0.5克硫酸铜(CuSO4·5H2O)溶解于100毫升蒸馏水中,每次使用前,将50份(A)与1份(B)混合,即为试剂甲。 (2)试剂乙: 在2升磨口回流瓶中,加入100克钨酸钠(Na2WO4·2H2O),25克钼酸钠(Na2MoO4·2H2O)及700毫升蒸馏水,再加50毫升85%磷酸,100毫升浓盐酸,充分混合,接上回流管,以小火回流10小时,回流结束时,加入150克硫酸锂(Li2SO4),50毫升蒸馏水及数滴液体溴,开口继续沸腾15分钟,以便驱除过量的溴。冷却后溶液呈黄色(如仍呈绿色,须再重复滴加液体溴的步骤)。稀释至1升,过滤,滤液置于棕色试剂瓶中保存。使用时用标准NaOH滴定,酚酞作指示剂,然后适当稀释,约加水1倍,使最终的酸浓度为1N左右。 (3)标准蛋白质溶液: 精确称取结晶牛血清清蛋白或g—球蛋白,溶于蒸馏水,浓度为250 mg/ml左右。牛血清清蛋白溶于水若混浊,可改用0.9 % NaCl溶液。 2. 器材 (1)可见光分光光度计 (2)旋涡混合器 (3)秒表 (4)试管16支 (三)操作方法 1. 标准曲线的测定: 取16支大试管,1支作空白,3支留作未知样品,其余试管分成两组,分别加入0,0.1,0.2, 0.4,0.6,0.8,1.0毫升标准蛋白质溶液(浓度为250mg/ml)。用水补足到1.0毫升然后每支试管加入5毫升试剂甲,在旋涡混合器上迅速混合,于室温(20~25℃)放置10分钟。再逐管加入0.5毫升试剂乙(Folin—酚试剂),同样立即混匀。这一步混合速度要快,否则会使显色程度减弱。然后在室温下放置30分钟,以未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照,于700nm 处测定各管中溶液的吸光度值。以蛋白质的量为横座标,吸光度值为纵座标,绘制出标准曲线。注意:因Lowry反应的显色随时间不断加深,因此各项操作必须精确控制时间,即第1支试管加入5毫升试剂甲后,开始计时,1分钟后,第2支试管加入5毫升试剂甲,2分钟后加第3支试管,余此类推。全部试管加完试剂甲后若已超过10分钟,则第1支试管可立即加入0.5毫升试剂乙,1分钟后第2支试管加入0.5毫升试剂乙,2分钟后加第3支试管,余此类推。待最后一支试管加完试剂后,再放置30分钟,然后开始测定光吸收。每分钟测一个样品。 进行多试管操作时,为了防止出错,每位学生都必须在实验 记录 混凝土 养护记录下载土方回填监理旁站记录免费下载集备记录下载集备记录下载集备记录下载 本上预先画好下面的 表格 关于规范使用各类表格的通知入职表格免费下载关于主播时间做一个表格详细英语字母大小写表格下载简历表格模板下载 。表中是每个试管要加入的量(毫升),并按由左至右,由上至下的顺序,逐管加入。最下面两排是计算出的每管中蛋白质的量(微克)和测得的吸光度值。 Folin—酚试剂法实验表格: 管号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 标准蛋白质0 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 (250mg/ml) 未知蛋白质0.2 0.4 0.6 (约250mg/ml) 蒸馏水 1.0 0.9 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0.8 0.6 0.4 试剂甲 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 试剂乙0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 每管中蛋白质的量(ug) 吸光度值(A700) 2. 样品的测定:取1毫升样品溶液(其中约含蛋白质20~250微克),按上述方法进行操作,取1毫升蒸馏水代替样品作为空白对照。通常样品的测定也可与标准曲线的测定放在一起,同时进行。即在标准曲线测定的各试管后面,再增加3个试管。如上表中的8、9、10试管。 根据所测样品的吸光度值,在标准曲线上查出相应的蛋白质量,从而计算出样品溶液的蛋白质浓度。 注意,由于各种蛋白质含有不同量的酪氨酸和苯丙氨酸,显色的深浅往往随不同的蛋白质而变化。因而本测定法通常只适用于测定蛋白质的相对浓度(相对于标准蛋白质)。 lowry法又称为Folin-酚试剂法。 操作步骤: 1溶液A,100ml 0.5gCuSO4(5H2O) 1gNa3C6H5O7(2H2O) 加双蒸水至100ml,溶液可长期保存于室温 2 溶液B,1L 20g 碳酸钠 4g氢氧化钠 加双蒸水至1L溶液可长期保存于室温 3 溶液C,51ml 1ml 溶液A 50ml溶液B 4 溶液D,20ml 10mlFolin-酚试剂 10ml 双蒸水 检测步骤:1,用双蒸水稀释样品至0.5ml 2,加2.5ml溶液C 3,混匀在室温下放置5~10min 4,加0.25ml溶液D,混匀 5, 20~30min后,在分光光度计上测A750 1 第一步后的10分钟很重要,不是说一定要10min,而是说不同样品的反应时间应控制一致。因为该步反应会随时间进行,直到加入第二个溶液后才停止反应。 2 第二步反应,在30分钟到1个小时内基本是稳定的。 在560nm处检测的是Lowary的改进法,用4-甲酸喹啉代替Folin试剂,在碱性条件下,蛋白质与Cu2+反应形成Cu+与4-甲酸喹啉反应生成紫色络合物,在560nm测定。该试剂比Lowary的试剂稳定,干扰大大减少,而灵敏度相近 如果是问的lowry法(又称Folin—酚法)测定蛋白质含量的话,那就只有700nm了。此法的显色原理与双缩脲方法是相同的,只是加入了第二种试剂,即Folin—酚试剂,以增加显色量,从而提高了检测蛋白质的灵敏度。这种方法的原理是在碱性条件下,蛋白质中的肽键与铜结合生成复合物。Folin—酚试剂中的磷钼酸盐—磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原,产生深兰色(钼兰和钨兰的混合物)。在一定的条件下,兰色深度与蛋白的量成正比。 除了这种方法以外我们目前常用的蛋白质含量测定方法还有Bradford法,595nm检测。 Bicinchoninic acid (BCA )法是近来广为应用的蛋白定量方法。其原理与Lowery法蛋白定量相似,在562 nM处有高的光吸收值并与蛋白质浓度成正比,据此可测定蛋白质浓度。与Lowery 法相比,BCA蛋白测定方法灵敏度高,操作简单,试剂及其形成的颜色复合物稳定性俱佳,并且受干扰物质影响小。与Bradford法相比,BCA法的显著优点是不受去垢剂的影响。; 药典对lowry法有详细的说明,使用的波长是650nm,在三部药典附录VI B上写得十分明确 事实上,folin-酚法的检测波长是相当宽泛的,可以在500nm到750nm任意选取,选取不同的波长的灵敏度不一样,检测的蛋白量也不一样。 一般的选择的波长较长,同样蛋白的吸光度较大,也就是说生成的复合物的吸光系数较大。 因此选择波长只要不受干扰,从500到750都可以,一般常用的有500,540,640,660,700, 750。没有固定说法,试实验需要跟各人爱好确定。 参考资料:生物化学实验原理和方法,北京大学出版社 出现负值嘻嘻我今天也是如此,我是测我合成的多肽,测得280一看吓一跳是负数,我在看看合成的 说明书 房屋状态说明书下载罗氏说明书下载焊机说明书下载罗氏说明书下载GGD说明书下载 ,公司纯化时测波长是210nm 我在测果然就变正常了,所以你查查你的蛋白吸收值应该在哪里,一定是小于你测得设定数,就好了