细胞生物学实验指导 (1)_PDF转换成word转换器

细胞生物学实验指导细胞生物教研室目录实验一动物细胞的基本形态观察和显微测量………………………………1实验二线粒体的活体染色及电镜照片观察…………………………………4实验三液泡系的活体染色及电镜照片观察…………………………………6实验四细胞生理活动的观察…………………………………………………7实验五细胞组分的化学反应…………………………………………………11实验六细胞核与线粒体的分级分离…………………………………………14实验七细胞融合………………………………………………………………17实验八培养细胞的形态观察和计数…………………………………………19实验九细胞的原代和传代培养………………………………………………23实验十细胞中微丝的染色及微丝与细胞形态的实验观察…………………25实验十一应用细胞融合技术制备染色体提前凝集标本……………………27实验十二放线菌素D诱导HL60细胞凋亡的实验观察……………………29实验十三MAPK信号通路与乳腺癌细胞增殖及可能机制的探索性实验…36实验一动物细胞的基本形态观察和显微测量【实验目的】制备不同细胞的临时制片，观察、了解细胞的基本形态，学会使用测微尺，通过测量对红细胞的进化进行分析。【实验用品】一、材料和标本蟾蜍一只，人血液一滴。二、器材和仪器配有目镜测微尺的显微镜一台、载片十张、盖片三张、吸水纸、手术器材一套、解剖盘一个、镜台测微尺一个、小平皿一个、牙签。三、试剂1％甲苯胺兰、1％甲基兰、Ringer氏液(两栖类用)。【实验内容】一、细胞的基本形态观察(一)原理细胞的形态结构与功能相关是很多细胞的共同特点，在分化程度较高的细胞更为明显，这种合理性是生物漫长进化过程所形成的。例如：具有收缩机能的肌细胞伸展为细长形；具有感受刺激和传导冲动机能的神经细胞有长短不一的树枝状突起；游离的血细胞为圆形、椭圆形或圆饼形。不论细胞的形状如何，细胞的结构一般分为三大部分：细胞膜、细胞质和细胞核。但也有例外。例如：哺乳类红细胞成熟时细胞核消失。(二)观察 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 与结果1．制备蟾蜍脊髓压片观察脊髓前角运动神经细胞。取蟾蜍一只，破坏脑和脊髓，在口裂处剪去头部，除去延脑，剪开椎管，可见乳白色脊髓，取下脊髓放在平皿内，用Ringer氏液洗去血液后放在载片上，剪碎。将另一载片压在脊髓碎块上，用力挤压。将上面的载片取下即可得到压片。在压片上滴一滴甲苯胺兰染液，染色10分钟，盖上盖片，吸去多余染液。在显微镜下观察，染色较深的小细胞是神经胶质细胞。染成兰紫色的、大的、有多个突起的细胞是脊髓前角运动神经细胞，胞体呈三角形或星形，中央有一个圆形细胞核，内有一个核仁(参照照片)。2．蟾蜍骨骼肌细胞的剥离与观察剪开蟾蜍腿部皮肤，剪下一小块肌肉，放在载片上，用镊子和解剖针剥离肌肉块成为肌束，继续剥离，可得到很细的肌纤维(肌细胞)。尽可能拉直肌纤维。在显微镜下观察，肌细胞为细长形，可见折光不同的横纹，每个肌细胞有多个核，分布于细胞的周边(参照照片)。3．蟾蜍肝脏压片的制备与观察剪开蟾蜍腹腔，取一小块(约2～3mm)肝放在平皿内，用Ringer氏液洗净，用镊子轻3压将肝中的血挤出。然后放在载片上，制片方法同脊髓压片。染色用甲基兰。显微镜下观察可见肝细胞核染成兰色，肝细胞紧密排列，挤成多角形(参照照片)。4．蟾蜍血涂片的制备与观察取一滴蟾蜍血液，靠近一端滴在载片上．将另一载片的一端呈45°角紧贴在血滴的前缘，均匀用力向前推，使血液在载片上形成均匀的薄层。(图l一1)。晾干。显微镜观察可见蟾蜍红细胞为椭球形，有核。白细胞数目少，为圆形。图1—1血涂片的制备5．人血涂片的制备与观察取人血一滴，制片方法同上。显微镜观察可见人红细胞为凹圆盘形，无核。自细胞数目少，为圆形。6．人口腔上皮细胞标本的制备与观察用牙签刮取口腔上皮细胞均匀地涂在载片上(不可反复涂沫)，滴一滴甲苯胺兰染液，染色5分钟，盖上盖片，吸去多余染液。显微镜下观察可见复盖口腔 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 面的上皮细胞为扁平椭圆形，中央有椭圆形核，染成兰色。二、测微尺的使用(一)原理测微尺分目镜测微尺和镜台测微尺，两尺配合使用。目镜测微尺是一个放在目镜像平面上的玻璃圆片。圆片中央刻有一条直线，此线被分为若干格，每格代表的长度随不同物镜的放大倍数而异。因此，用前必须测定。镜台测微尺是在一个载片中央封固的尺，长1毫米(1000μm)，被分为100格，每格长度是10微米。(二)方法1．将镜台测微尺放在显微镜的载物台上夹好，小心转动目镜测微尺和移动镜台测微尺使两尺平行，记录镜台测微尺若干格所对应的目镜测微尺的格数(图1—2)。2．按下式求出目镜测微尺每格代表的长度目镜测微尺每格代表的长度(μm)=X10三、测量人口腔上皮细胞从显微镜载物台上取下镜台测微尺，换上人口腔上皮细胞标本，测量细胞、细胞核的长短径。【作业】一、分别求出使用低倍镜(10X)，高倍镜(40X)时目镜测微尺每格代表的长度：低倍镜：目镜测微尺每格代表的长度=XlO(μm)=XlO(μm)=μmμm高倍镜：目镜测微尺每格代表的长度=二、分别绘制所观察的6种细胞并注明基本结构。三、计算蟾蜍红细胞的核质比例。计算细胞、细胞核体积的 公式 小学单位换算公式大全免费下载公式下载行测公式大全下载excel公式下载逻辑回归公式下载 ：圆形V=4/3πr椭圆形V=4/3πab核质比N／D=Vn／(Vc—Vn)(Vn为核的体积，Vc是细胞质的体积)3(r为半径)2(a、b为长、短半径)实验二线粒体(Mitochondrion)的活体染色及电镜照片观察【实验目的】掌握一种活体染色方法,了解光学显微镜和电子显微镜下线粒体基本形态结构。【实验用品】一、材料和标本兔子一只、线粒体的电镜照片。二、器材和仪器显微镜、手术器材一套、解剖盘、小平皿、载片、盖片、吸水纸、10ml注射器、吸管。三、试剂l／300詹纳斯绿B染液、Ringer氏液(哺乳类用)。【实验内容】一、兔肝细胞线粒体的活体染色（一）原理线粒体是细胞内一种重要细胞器，是细胞进行呼吸作用的场所。细胞的各项活动所需要的能量，主要是通过线粒体呼吸作用来提供的。活体染色是应用无毒或毒性较小的染色剂真实地显示活细胞内某些结构而又很少影响细胞生命活动的一种染色方法。詹纳斯绿B是线垃体的专一性活体染色剂。线粒体中细胞色素氧化酶使染料保持氧化状态呈蓝绿色，而在周围的细胞质中染料被还原，成为无色状态。（二）方法用空气栓塞处死兔子，置于解剖盘内，迅速打开腹腔，取兔肝边缘较薄的肝组织一小块（2～3mm），放入盛有Ringer氏液的平皿内洗去血液(用镊子轻压)，用吸管吸去Ringer氏3液，在平皿内加1／300詹纳斯绿B染液，让组织块上表面露在染液外面，使细胞内线粒体的酶系可进行充分的氧化，这样才有利于保持染料的氧化状态，使线粒体着色。当组织块边缘染成篮色时即可，一般需要染30分钟。染色后，将组织块移到载片上，用镊子将组织块拉碎，就会有一些细胞或细胞群从组织块脱离。将稍大的组织块去掉，使游离的细胞或细胞群留在载片上，加一滴Ringer氏液，盖上盖片，吸去多余水分。(三)结果显微镜观察，肝细胞质中许多线粒体被染成蓝绿色，呈颗粒状。二、线粒体的光镜切片观察用詹纳斯绿B染色的兔肝细胞光镜切片，肝细胞中的线粒体呈蓝绿色的颗粒。三．线粒体的电镜照片观察不同细胞中线粒体的形态和数目不同。线粒体的外形多样，如圆形、椭圆形、哑铃形和杆状。线粒体的数目与细胞类型和细胞的生理状态有关，线粒体多聚集在细胞生理功能旺盛的区域。线粒体脊的数目与分布方式是多种多样的。一般与线粒体长轴垂直排列，但也可见到与线粒体长轴平行排列的脊。脊的横切面呈囊状或管状。脊的数量与细胞呼吸机能的强度有很大关系。这有三张线粒体超薄切片的电镜照片：第一张是小鼠肾小管上皮细胞中线粒体的电镜照片，可见线粒体呈椭圆形和杆状，由双层膜包围，内膜向内突起成平板状脊，脊与线粒体长轴垂直排列，肾小管上皮细胞重吸收作用需要能量，线粒体数目多。第二张是恒河猴脊髓突触内线粒体。可见线粒体体积小、数目多，脊与线粒体呈同心圆排列。第三张是小鼠睾丸间质细胞线粒体，线粒体的脊为分支的管，在照片上呈单层膜泡状。【作业】绘制光镜下肝细胞活体染色所见的线粒体及电镜下肾小管上皮细胞中线粒体的形态结构。实验三液泡系(Vacuolarsystem)的活体染色及电镜照片观察【实验目的】掌握一种活体染色方法，了解光学显微镜和电子显微镜下液泡系的基本形态结构。【实验用品】一、材料和标本蟾蜍一只，软骨细胞电镜照片。二、器材和仪器光学显微镜一台、手术器材一套、解剖盘一个、载片、盖片、吸水纸。三、试剂l／3000中性红染液、Ringer氏液(两栖类用)。【实验内容】一、蟾蜍胸骨剑突软骨细胞液泡系活体染色及观察(一)原理在动物细胞内，凡是由膜所包围的小泡和液泡除线粒体外都属于液泡系，包括高尔基器、溶酶体、微体、消化泡、自噬小体、残体、胞饮液泡和吞噬泡，都是由一层单位膜包围而成。软骨细胞内含有较多的粗面内质网和发达的高尔基复合体，能合成与分泌软骨粘蛋白及胶原纤维等，因而液泡系发达。中性红是液泡系特殊的活体染色剂，只将液泡系染成红色，在细胞处于生活状态时，细胞质及核不被染色，中性红染色可能与液泡中的蛋白有关。(二)方法取一只蟾蜍，破坏脑和脊髓，剪开胸腔，取胸骨剑突软骨最薄部分的一小片，放在载片上，滴两滴1／3000中性红染液，染色8～lO分钟，用吸水纸吸去染液，加一滴Ringer氏液，盖上盖片，吸去多余Ringer氏液。(三)结果显微镜下观察，可见软骨细胞为椭圆形，细胞核周围有许多染成玫瑰红色．大小不一的小泡，即软骨细胞液泡系。二、大白鼠胫骺软骨细胞电镜照片的观察动物细胞液泡很小，即使是活体染色也只能看出是一个小点，为了进一步看清液泡的结构我们有必要观察软骨细胞的电镜照片。大白鼠胫骺骨细胞电镜照片，细胞核与核仁很清楚，细胞质中有丰富的粗面内质网，液泡系发达，液泡由单层膜包围，细胞周边有液泡释放。【作业】绘制光镜下软骨细胞液泡系。实验四细胞生理活动的实验观察【实验目的】通过制片与观察加深理解细胞的运动、吞噬等生理活动。【实验用品】一、材料和标本雄性蟾蜍、小白鼠、l％鸡血悬液、6％淀粉肉汤、草履虫。二、器材和仪器光镜、2ml注射器、载玻片、盖玻片、解剖器材、滴管、移液管、试管、玻璃片、黑纸。三、试剂0.3％台盼兰、1％刚果红。【实验内容】一、细胞的吞噬活动(一)原理白细胞是机体防御系统中能游走的单位。它分为粒细胞系、单核细胞系、淋巴系三类。它们有许多生理功能，如游走性、变形运动、趋化性、吞噬异物等。在白细胞中，以粒细胞、单核细胞的吞噬活动较强，故称此二类细胞为吞噬细胞。单核细胞由血液进入组织后逐渐演变成巨噬细胞。吞噬细胞主要靠吞噬来处理异物。吞噬细胞首先由于趋化作用而向异物游走，然后伸出伪足包围异物，并发生内吞作用形成吞噬泡将异物吞入细胞，继而溶酶体与吞噬泡融合消化异物。(二)小白鼠腹腔巨噬细胞吞噬活动的观察l．实验前二天，每天向小鼠腹腔注射6％淀粉肉汤O．5～1ml(含O．3％台盼兰，起标记作用)，以刺激腹腔产生较多的巨噬细胞(此步由教师在实验前进行完毕)。2．实验时，每组取一只经上述处理的小鼠，腹腔注射1％鸡血悬液0．5～1ml，注射后轻揉小鼠腹部以使红细胞悬液分散均匀。3．1小时后，用颈椎脱位法处死小鼠，迅速剖开小鼠腹壁，向腹腔注入O．5ml～1ml生理盐水，用牙签轻轻搅拌使生理盐水与腹腔液混匀。4．用注射器抽取腹腔液，滴片，然后盖上盖片。5．镜检，高倍镜下画图记录所见结果。二、暗视野观察细胞的纤毛和鞭毛运动(一)原理暗视野照明法是一种不使照射被检物体的光线直接进入物镜的照明方法。常常用它来观察没有染色的活体细胞或胶体粒子。利用此照明法，在镜检时不能直接看到通过标本的照明光线，只有被检物体反射或衍射的光线进入物镜可以提高分辨率，在暗视野中可以看到明亮的被检物体的存在和运动，但它们的内部结构却看不清楚。(二)自制遮光板变普通显微镜为“简单的暗视野显微镜”。步骤：1．将显微镜聚光器调到最高位，用低倍镜调焦至清楚。2．取下目镜，从镜筒中观察并调节光圈的大小，使其与镜筒中所见物镜的视野相等。3．放一块透明玻璃于载物台透光孔上，用尺子测量光圈孔径。4．按照图6--1的形状，用黑纸剪成与调节后光圈孔径一样大小的中央遮光板。5．将中央遮光板放置在显微镜的滤光框上，即可进行标本的暗视野观察。注：如果使用高倍镜观察标本时，应按高倍镜调焦的视野大小重新制作中央遮光板。图6—1中央遮光板a．光圈孔径b．滤光片直径(三)观察蟾蜍上颌粘膜上皮细胞的纤毛运动步骤：1．用捣毁脑脊髓的方法处死蟾蜍。2．腹部向上将蟾蜍固定在蜡盘上。3．沿蟾蜍二侧口角向后剪开约l厘米，将下颌翻转固定在腹部。4．在上颌中线距喉头1厘米处放置腊屑，观察腊屑向什么方向移动？记录腊屑开始移动到消失的时间(见图6--2蟾蜍口腔内面图)。5．然后，用眼科剪刀剪取咽头前部的上颌粘膜约2×2cm小块，用牙签挑取剪下的粘2膜，将纵切面贴于载片上。6．加一滴生理盐水于载玻片标本上，加盖玻片，镜检。图6—2蟾蜍口腔内面图结果：1．在低倍镜下观察上颌粘膜细胞纤毛运动的现象。2．换高倍镜仔细观察纤毛有规律的运动。(四)暗视野观察蟾蜍精子的鞭毛运动步骤：l．将前面实验所用蟾蜍沿腹中线开腹，暴露出黄色圆柱状精巢。2．剪取一侧精巢于盛有自来水的平皿中，用镊子夹住精巢的一端，清洗去血污。3．移取洗净的精巢于另一干净的平皿上，用眼科剪将精巢充分剪碎后，加入数滴自来水混匀。4．用吸管吸取平皿内液体，滴一滴于载玻片上，盖上盖玻片，稍待2～3分钟于镜下观察。结果：1．在低倍镜下可见到视野中有许多精子：头部呈长锥形，尾为细长的线状结构。2．置高倍镜下观察：可见有许多靠尾部鞭毛弯曲摆动驱使而运动的精子，测量鞭毛长度。三、草履虫纤毛运动及食物泡的形成图6—3草履虫草履虫是一种单细胞动物。虫体由一个细胞组成，能执行复杂的生理功能。其体表，均匀密布纤毛，为运动细胞器。身体的前部有口沟，由前端斜向伸至体中部，口沟的底部为胞口，下部一短管斜向后部而入胞质，称胞咽。纤毛有规律的摆动使食物在胞咽聚结形成食物泡(吞噬泡)，最后脱离胞咽入胞质。食物泡随细胞质由体后端到前端不停环流，并与溶酶体(含酸性水解酶)融合，行使细胞内消化。根据食物泡中刚果红指示剂的颜色变化(酸性时，为红色；近中性时，为黄色；碱性时，为蓝色)。可以观察到消化过程。实验步骤：1．取一滴草履虫培养液于载玻片上，放上几根棉花纤维，以减慢草履虫的运动。加盖玻片，制成临时装片。2．观察草履虫的运动方式(观察时光线可调暗些)：可见镜下有许多样似倒置鞋底的草履虫，体表纤毛不断摆动，虫体以其中轴左旋前进，若遇阻力则试触后即刻回避而转向。3．观察草履虫的食物泡的形成：1)在盖玻片一侧加一滴l％的刚果红指示剂，用吸水纸从另一侧吸引使指示剂进入盖片下方，选一运动较迟缓的草履虫，移入高倍镜观察吞噬活动。2)几分钟后可见草履虫体内出现许多红色食物泡，随着食物泡不停的在胞质中环流，食物不断消化，泡内酸性减弱或近中性，颜色渐渐呈黄色，食物泡渐小，最后食物泡颜色呈蓝色，不能被消化的残渣，环流到身体后部的胞肛排出，不排出时不易见到胞肛。【作业】1．画图记录细胞吞噬实验所见结果，小鼠巨噬细胞吞噬实验如何解释细胞内台盼兰的着色？2．在观察细胞纤毛和鞭毛运动实验中,记录一下腊屑从开始运动到消失的时间。3．鞭毛和纤毛有何异同？实验五细胞组分的化学反应【实验目的】了解核酸、蛋白质、糖及酶的细胞化学反应原理，掌握Brachet反应及碱性蛋白、酸性蛋白、糖原和过氧化物酶的细胞化学染色方法。【实验用品】一、材料和标本蟾蜍、小白鼠各一只、肝脏石腊切片、培养的Hela细胞。二、器材和仪器光学显微镜、解剖器材、蜡盘、载玻片、吸水纸、染色缸、盖玻片、水浴箱。三、试剂PBS缓冲液(pH7.2)、甲基绿一呱咯宁醋酸缓冲液、纯丙酮、l/2丙酮+1/2二甲苯、纯二甲苯、70％乙醇、5％三氯醋酸、0.1％碱性固绿、0.1％酸性固绿、0.5％硫酸铜、联苯胺混合液、1％番红、无水乙醇、过碘酸酒精液、Schiff氏酒精液、亚硫酸水、Ehrlieh苏木精、95％乙醇、Carnoy固定液(甲醇：冰醋酸=3:1，体积比)【实验内容】细胞的组织化学方法，是研究细胞成分常用的方法之一。它是利用化学试剂与细胞内的某些物质进行化学反应，从而在细胞局部形成有色沉淀物，再通过显微镜对组织内的生物化学成分进行定性、定位、定量研究。一、Brachet反应一显示细胞内的DNA和RNA(一)原理细胞经甲基绿一呱咯宁混合液处理后，其中的DNA和RNA出现不同的呈色反应，一般认为这是由于带有负电荷的核酸对碱性染料呱咯宁和甲基绿具有亲和力，且这两种染料的作用有选择性，甲基绿染高聚分子的DNA呈蓝绿色，呱咯宁染低聚分子的RNA呈红色。由此对细胞中的DNA和RNA进行定位、定性、和定量分析。(二)方法l．接种Hela细胞于盖片上并培养24～48小时，使长成单层。2．取出盖片，用PBS(pH7.2)轻轻冲洗盖片表面去除残渣。3．放入Carnoy固定液中固定l小时。4．浸入甲基绿一呱咯宁醋酸缓冲液中30分钟染色。5．取出盖片放入蒸馏水中轻轻漂洗2～3次(2～3秒钟左右)，吸去水分。放入纯丙酮中分色2～3秒钟。6.放入l／2丙酮+1／2二甲苯中5秒钟。7．放入纯二甲苯中透明5分钟。8．滴一滴中性树胶于载玻片上，将盖片标本面朝下封片。9．镜下观察（三）结果细胞质被染成浅红色，细胞核被染成蓝绿色，而其中核仁被染成紫红色（参照照片）。二、细胞内碱性蛋白和酸性蛋白的显示（一）原理由于不同的蛋白质分子所带的碱性和酸性基团的数目不同，在pH值不同的溶液中，蛋白质分子所带的净电荷多少不同。如在生理条件下，整个蛋白质所带负电荷多，则为酸性蛋白质；带正电荷多，则为碱性蛋白质。据此，可将标本经三氯醋酸处理提出核酸后，用不同pH值的固绿染液分别染色，细胞内的酸性蛋白和碱性蛋白质显示出来。（二）方法1．以破坏脊髓法处死蟾蜍，将其腹面向上放人蜡盘中，剪开胸腔，打开心包。小心将心脏剪一小口，取心脏血一滴滴在干净载玻片一端，推片，按此法制备二张血涂片，室温晾干。2.将涂片作好标记放在70％乙醇中固定5分钟，室温晾干。3．放入5％三氯醋酸中60℃30分钟，抽提出核酸。4．清水冲洗多次（3分钟以上），以冲去痕迹的三氯醋酸。5．滤纸吸干玻片上水分。6.一张片放入0.1％碱性固绿(pH8.0～8.5)中染色10～15分钟,另一张片放入0.1％酸性固绿(pH2.0～2.5)染色5～10分钟。7．清水冲洗，盖上盖片镜检。（三）结果经碱性固绿染色片中，胞质、核仁不着色，细胞核大部分被染成绿色，是为碱性蛋白质存在处（参照照片）。经酸性固绿染色片中，因胞质和核仁中有酸性蛋白，被染成绿色。三、细胞内过氧化物酶的显示（一）原理过氧化物酶能把许多胺类氧化为有色化合物，用联苯胺处理标本，细胞内的过氧化物酶能把联苯胺氧化为蓝色的联苯胺蓝，进而变为棕色产物，因而可以根据颜色反应来判定过氧化物酶的有无或多少。（二）方法1．取小鼠一只，以颈椎脱位法将其处死，迅速剖开其后肢暴露出股骨，将股骨一端斜向剪断，用PBS缓冲液湿润过的注射器针头吸出骨髓一滴滴到载玻片上。2．推片，室温晾干。3．将涂片放入0.5％硫酸铜中浸30秒~1分钟。4．取出涂片直接放入联苯胺混合液中反应6分钟。5．清水冲洗，放入1％番红溶液中复染2分钟。6．清水冲洗，室温晾干。7．镜检或封片后镜检。（三）结果涂片中可见一些细胞中存在着蓝色或棕色颗粒，为过氧化物酶所在位置。四、过碘酸雪夫反应(PAS)——显示细胞内糖原(参照照片和示教片)(一)原理组织、细胞的多糖、粘多糖及粘蛋白等都可用PAS法来显示，其化学基础是利用过碘酸的氧化作用，打开碳链形成醛，生成的醛基与Schiff试剂中的无色品红反应形成紫红色化合物。(二)方法l．取l~2mm厚的肝组织块，用Carnoy氏液4℃固定4～6小时。2．乙醇脱水、二甲苯透明。石蜡包埋，切片。3．用70％乙醇展片。4．脱蜡：二甲苯(1)5分钟→二甲苯(2)5分钟→100％乙醇5分钟→含1％火棉胶的乙醇液1分钟→70％乙醇1分钟。5．直接浸入过碘酸酒精液反应5～15分钟，经70％乙醇洗片刻。6．浸入Schiff氏酒精液反应15分钟。7．亚硫酸水洗三次，以洗去多余的非特异性结合的色素，以及扩散的染料。8．流水冲洗3～5分钟。9．蒸馏水洗。10．浸入Ehrlich苏木精复染20~30秒，使细胞核着色。11．脱水：95％乙醇3分钟二次→100％乙醇3分钟二次→二甲苯透明10分钟二次。12．加盖片镜检或树胶封固后镜检。(三)结果细胞中呈紫红的颗粒即为糖原(参照照片)。五、苏丹Ⅲ染色——显示细胞内脂肪(示教片)【作业】1．用彩色笔绘出Brachet反应及PAS反应的镜下所见。2．说明着色的碱性蛋白可能是什么物质?实验六细胞核与线粒体的分级分离【实验目的】通过细胞匀浆和离心的方法分级分离细胞的组分，以了解其原理及过程。【实验用品】一、材料和标本小白鼠、冰块。二、器材和仪器玻璃匀浆器、普通离心机、台式高速离心机、普通天平、光学显微镜、载玻片、盖玻片、刻度离心管、高速离心管、滴管、10ml量筒、25ml烧杯、玻璃漏斗、解剖剪、镊子、吸水纸、纱布、螬盘、平皿、牙签。三、试剂0.25mol／L蔗糖一0.003mol／L氯化钙溶液、1％甲苯胺兰染液、0.02％詹纳斯绿B染液、0.9％NaCl溶液。【实验内容】一、原理细胞内不同结构的比重和大小都不相同，在同一离心场内的沉降速度也不相同，根据这一原理，常用不同转速的离心法，将细胞内各种组分分级分离出来。分离细胞器最常用的方法是将组织制成匀浆，在均匀的悬浮介质中用差速离心法进行分离，其过程包括组织细胞匀浆、分级分离和分析三步，这种方法已成为研究亚细胞成分的化学组成、理化特性及其功能的主要手段。匀浆(Homogenization)低温条件下，将组织放在匀浆器中，加入等渗匀浆介质(即0.25mol／L蔗糖一0.003mol／L氯化钙)进行破碎细胞使之成为各种细胞器及其包含物的匀浆。分级分离(Fractionation)由低速到高速离心逐渐沉降。先用低速使较大的颗粒沉淀，再用较高的转速，将浮在上清液中的颗粒沉淀下来，从而使各种细胞结构，如细胞核、线粒体等得以分离。由于样品中各种大小和密度不同的颗粒在离心开始时均匀分布在整个离心管中，所以每级离 心得 信息技术培训心得 下载关于七一讲话心得体会关于国企改革心得体会关于使用希沃白板的心得体会国培计划培训心得体会 到的第一次沈淀必然不是纯的最重的颗粒，须经反复悬浮和离心加以纯化。分析分级分离得到的组分，可用细胞化学和生化方法进行形态和功能鉴定。二、细胞核的分离提取(一)操作步骤1．用颈椎脱位的方法处死小白鼠后，迅速剖开腹部取出肝脏，剪成小块(去除结缔组织)尽快置于盛有0.9％NaCl的烧杯中，反复洗涤，尽量除去血污，用滤纸吸去表面的液体。2．将湿重约1g的肝组织放在小平皿中，用量筒量取8ml预冷的0.25mol／L蔗糖一0.003mol／L氯化钙溶液，先加少量该溶液于平皿中，尽量剪碎肝组织后，再全部加入。3．剪碎的肝组织倒入匀浆管中，使匀浆器下端浸入盛有冰块的器皿中，左手持之，右手将匀浆捣杆垂直插入管中，上下转动研磨3～5次，用3层纱布过滤匀浆液于离心管中，然后制备一张涂片①，做好标记，自然干燥。4．将装有滤液的离心管配平后，放入普通离心机，以2500rpm，离心15分钟；(1)缓缓取上清液，移入高速离心管中，保存于有冰块的烧杯中，待分离线粒体用；(2)同时涂一张上清液片②做好标记，自然干燥；(3)余下的沉淀物进行下一步骤。5．用6ml0.25mol/L蔗糖一0.003mol／L氯化钙溶液悬浮沉淀物，以2500rpm离心15分钟弃上清，将残留液体用吸管吹打成悬液，滴一滴于干净的载玻片上，涂片③，自然干燥。6．将①、②、③涂片用l％甲苯胺兰染色后盖片即可观察。(二)结果分别于高倍镜下观察三张涂片，描述镜下所见。三、高速离心分离提取线粒体(一)操作步骤1．将装有上清液的高速离心管，从装有冰块的烧杯中取出，配平后，以17000rpm离心20分钟，弃上清，留取沉淀物。2．加入0．25mol／L蔗糖一0．003mol／L氯化钙液lml，用吸管吹打成悬液，以17000rpm离心20分钟，将上清吸入另一试管中，留取沉淀物，加入0.1ml0．25mol／L蔗糖一0.003mol／L氯化钙溶液混匀成悬液(可用牙签)。3．取上清液和沉淀物悬液，分别滴一滴于干净载玻片上(分别标记④、⑤涂片)，各滴一滴0.02％詹纳斯绿B染液盖上盖片染20分钟。(二)结果油镜下观察，颗粒状的线粒体被詹纳斯绿B染成蓝绿色。【作业】1．简要说明分级分离细胞的原理及意义。2．比较一下分离细胞核时涂片①、②、③有什么不同?涂片③在你的实验结果中纯度如何？2．描述一下涂片⑤所见结果。小白鼠脱颈椎处死，迅速开腹剪取肝组织0.9％NaCl洗涤，称1g剪碎加8ml预冷的0．25mol／L蔗糖一0.003mol／L氯化钙溶液匀浆过滤，滤液移入离心管，滤液涂片①离心普通离心机2500rpm，15分钟滴片镜检滴片詹纳斯绿B染色④盖片詹纳斯绿B染色⑤盖片油镜检图8—1细胞核和线粒体分离图解实验七细胞融合【实验目的】掌握细胞融合原理、应用PEG融合细胞的方法以及细胞融合率的计算。【实验用品】一、材料鸡红细胞二、器材和仪器：显微镜、离心机、水浴箱、刻度离心管、试管、载玻璃片、盖玻片三、试剂50％PEG(MW4,000)、Hanks液(pH7.4)【实验内容】一、原理细胞融合(Cellfusion)，即在自然条件下或用人工方法(生物的、物理的、化学的)使两个或两个以上的细胞合并形成一个细胞的过程。人工诱导的细胞融合，在六十年代作为一门新兴技术而发展起来。由于它不仅能产生同种细胞融合，也能产生种间细胞的融合，因此细胞融合技术目前被广泛应用于细胞生物学和医学研究的各个领域。细胞融合的诱导物种类很多．常用的主要有灭活的仙台病毒(Sendaivirus)，聚乙二醇(Polyethyleneglycol，PEG)和电脉冲。目前应用最广泛的是聚乙二醇，因为它易得、简便，且融合效果稳定。PEG的促融机制尚不完全清楚，它可能引起细胞膜中磷脂的酰键及极性基团发生结构重排。二、方法(1)取新鲜鸡血以0.85％生理盐水制成10％的悬液。(2)称取0.5克PEG(MW=4,000)放入试管内，在酒精灯上融化之，迅速加入0.5ml预热的Hanks液混匀制成50％的PEG溶液。放入37℃水浴中待用。(3)取上述10％的鸡红细胞悬液1ml放入离心管中，再加入5mlHanks液混匀，然后以1,000rpm离心5分钟，小心弃去上清，用指弹法将细胞团块弹散。(4)取上述50％PEG溶液0.5ml，在1分钟内滴加到鸡红细胞悬液，边加边轻轻摇动混匀。待PEG全部加入后静置1分钟左右。此全部过程都要求在37℃水浴内进行。(5)缓慢滴加9mlHanks液以终止PEG的作用，在37℃水浴内静置5分钟。(6)离心弃上清后，取一滴融合后的细胞悬液滴片，加盖片镜检。三、结果观察在高倍镜下可以看到有两个或两个以上的鸡红细胞膜融合在一起，形成一个异核体细胞。要注意辨别融合细胞与重叠的鸡红细胞。四、融合率的计算在高倍镜下随机计数200个细胞(包括融合的与未融合的细胞)，以融合细胞(含两个或两个以上的细胞核的细胞)的细胞核数除以总细胞核数(包括融合与未融合的细胞核)即得出融合率。公式如下：【作业】l．在显微镜下按顺序绘制所观察到的细胞融合各阶段，并注明主要特点。2．你测定的细胞融合率为多少?实验八培养细胞的形态观察和计数【实验目的】了解培养中的动物细胞的一般形态和生长状态；掌握细胞计数的基本方法。【实验用品】一、材料和标本培养中的HeLa细胞(人子宫颈癌上皮细胞)、NIH3T3(小鼠成纤维细胞)、HL一60细胞(人白血病细胞)二、器材和仪器倒置显微镜、细胞计数板、普通光学显微镜、乳头吸管三、试剂0.3％台盼兰染液、0.25％胰蛋白酶一0.02％EDTA混合消化液【实验内容】一、培养细胞的形态观察(一)原理体外培养的细胞主要有两种状态。一种是能贴附在培养支持物上的细胞，如HeLa细胞、NH3T3等，叫贴壁型细胞，体外培养的细胞绝大多数都属于这种细胞。另一种细胞并不贴附在容器的壁上，而是悬浮在培养液中生长，如HL—60，叫做悬浮型细胞，这类细胞主要是血液原性或癌原性的细胞。(二)操作l．将细胞培养瓶从37℃二氧化碳培养箱(或温箱)中取出，注意观察细胞培养液的颜色和清澈度。然后，将细胞培养瓶平稳地放在倒置显微镜载物台上，此时应注意不要将瓶翻转，也不要让瓶内的液体接触瓶塞或流出瓶口。2．打开倒置镜光源，通过双筒目镜将视野调到合适的亮度。3．调节载物台的高度进行对焦，在看到细胞层之后，再用细调节器将物像调清楚，注意观察细胞的轮廓、形状和内部结构。在观察时，最经常使用的是10X物镜。(三)结果贴壁细胞一般有两种形状，即上皮细胞形和成纤维细胞形细胞。上皮细胞形细胞呈扁平的不规则多角形，圆形核位于中央，生长时常彼此紧密连接成单层细胞片，如HeLa细胞。成纤维细胞形细胞形态与体内成纤维细胞形态相似，胞体呈梭形或不规则三角形，中央有圆核，胞质向外伸出2～3个长短不同的突起，细胞群常借原生质突连接成网，如NIH3T3(参照照片)。贴壁细胞在生长状态良好时，细胞内颗粒少，看不到有空泡，细胞边缘清楚，培养基内看不到悬浮的细胞和碎片，培养液清澈透明，而当细胞内颗粒较多，透明差，空泡多时，表明生长较差。当瓶内培养基混浊时，应想到细菌真菌污染的可能。悬浮细胞当边缘清楚，透明发亮时，生长较好；反之，则较差或已死亡。由于培养基内有pH指示剂的存在，因此它的颜色往往可以间接地表明细胞的生长状态。呈橙黄色时，细胞一般生长状态较好；呈淡黄色时，则可能是培养时问过长，营养不足，死亡细胞过多；如呈紫红色，则可能是细胞生长状态不好，或已死亡。实际上，一种细胞在培养中的形态并不是永恒不变的，它随营养、pH、生长周期而改变，但在比较稳定的条件下形态基本是一致的。在贴壁细胞培养中，镜下折光率高，圆而发亮的一般被认为是分裂期细胞。肿瘤细胞有重叠生长的特征。二、培养细胞的计数及活细胞的鉴定(一)在细胞生物学的实验中，往往要进行活细胞的鉴定和细胞的计数、调整细胞的密度，是进行实验必不可少的一种基本技能。图13—1细胞计数板顶面观和侧面观的图示图13—2放大的计数室(二)操作1．将培养瓶中的培养液倒入干净试管中，向培养瓶中加入0.25％胰蛋白酶一0.02％EDTA混合消化液lml,静置3～5分钟，待见到细胞变圆，彼此不连接为止。2．将试管中的培养液倒回培养瓶中，并轻轻进行吹打，制成细胞悬液。3．取细胞悬液0.5ml，加入0.3％台盼兰染液0.5ml，混合后染色3～5分钟。4．滴加少许已染色的细胞悬液于放有盖片的细胞计数板的斜面上，使液体自然充满计数板小室。注意不要使小室内有气泡产生，否则要重新滴加。5．在普通光镜10X物镜下计数四个大格内(如图13—1，13—2示)的细胞数，压线者数上不数下，数左不效右。(三)结果按下式进行细胞浓度的计数：注①4大格中的每一大格体积为0.1mm。1ml=l，0000大格，因此，1大格细胞数×3=细胞数／ml。104注②染色标本在15分钟内检查计数，因为台盼兰染液可以迅速地使死细胞染上蓝色，延长时间活细胞也将着色，用此方法来分辨死活细胞。进行细胞计数时应力求准确，因此，在科学研究中，往往将计数板的两侧都滴加上细胞悬液，并同时滴加几块计数板(或反复滴加一块计数板几次)，最后取结果的平均值。【作业】一、问 题 快递公司问题件快递公司问题件货款处理关于圆的周长面积重点题型关于解方程组的题及答案关于南海问题 下面是某些贴壁细胞培养数天后观察计数的结果：瓶培养基镜下观察计数清澈度颜色细胞界限胞内颗粒空泡碎片总死甲乙丙丁混蚀清黄不清清楚清楚不清多少多大满视野6×109×102×102×1044645×102×105×101×104244橙黄黄少有多无有多清较多多清紫红1．根据上表分析各瓶细胞的生长情况是：A细胞生长状态良好；B培养时间太短；C细胞污染可能性大；D细胞与环境生长不适；E细胞营养不足。甲()乙()丙()丁()2．根据你的判断应采取的措施是：A将细胞弃去；B立即换新鲜培养液；C立即传代；D放置继续观察；E换到新的培养瓶中。)乙()丙(甲()丁()二、作图将你观察到的培养细胞作一草图。三、计算将你计数的每毫升细胞悬液中的细胞总数，死、活细胞的百分比例计算出来。实验九细胞的原代和传代培养【实验目的】初步掌握哺乳动物细胞的原代培养与传代培养的基本操作过程，为生物工程在医学上的应用打下基础。【实验用品】一、材料和标本乳兔、HeLa细胞(人宫颈癌细胞)二、器材和仪器手术器械、平皿、培养瓶、吸管、离心管(灭菌后备用)、酒精灯、烧杯、超净工作台、二氧化碳培养箱、倒置显微镜。三、试剂含有5％小牛血清的MEM培养液、0.01mol／LPBS，0.25％胰蛋白酶一0.02％EDTA混合消化液、75％乙醇。【实验内容】一、原代细胞培养(一)原理细胞培养(Cellculture)是模拟机体内生理条件，将细胞从机体中取出，在人工条件下使其生存、生长、繁殖和传代，进行细胞生命过程、细胞癌变、细胞工程等问题的研究。近年来，广泛地应用于分子生物学、遗传学、免疫学、肿瘤学、细胞工程等领域，发展成一种重要生物技术，并取得显著成就。由体内直接取出组织或细胞进行培养叫原代培养。原代培养细胞离体时间短，性状与体内相似，适用于研究。一般说来，幼稚状态的组织和细胞，如：动物的胚胎、幼仔的脏器等更容易进行原代培养。(二)操作1．取材用颈椎脱位法使乳兔迅速死亡。然后，把整个动物浸入盛有75％乙醇的烧杯中数秒钟消毒，取出后放在大平皿中携入超净台。用消过毒的剪刀剪开用碘酒和乙醇再次消毒后的皮肤，剖腹取出肝脏或肾脏。置于无菌平皿中。2．切割用灭菌的PBS液将取出的脏器清洗三次，然后用眼科手术剪刀仔细将组织反复剪碎，直到成1mm左右的小块，再用PBS清洗，洗到组织块发白为止。移入无菌离心管中，静置数3分钟，使组织块自然沉淀到管底，弃去上清。3．消化、接种培养吸取0.25％胰蛋白酶一0.02％EDTA混合消化液1ml，加入离心管中，与组织块混匀后，加上管口塞子，37℃水浴中消化8～10分钟，每隔几分钟摇动一下试管，使组织与消化液充分接触，静止，吸去上清，向离心管中加入5～10ml含5％小牛血清的MEM培养基，用吸管吹打混匀，移入二个培养瓶中，置于二氧化碳培养箱中培养。(三)结果细胞接种后一般几小时内就能贴壁，并开始生长，如接种的细胞密度适宜，5天到一周即可形成单层。二、传代细胞培养(一)原理体外培养的原代细胞或细胞株要在体外持续地培养就必须传代，以便获得稳定的细胞株或得到大量的同种细胞，并维持细胞种的延续。培养的细胞形成单层汇合以后，由于密度过大生存空间不足而引起营养枯竭，将培养的细胞分散，从容器中取出，以1:2或l:3以上的比率转移到另外的容器中进行培养，即为传代培养。细胞“一代”指从细胞接种到分离再培养的一段期间，与细胞世代或倍增不同。在一代中，细胞培增3～6次。细胞传代后，一般经过三个阶段：游离期、指数增生期和停止期。常用细胞分裂指数表示细胞增殖的旺盛程度，即细胞群的分裂相数／100个细胞。一般细胞分裂指数介于0.2％～0.5％，肿瘤细胞可达3～5％。细胞接种2～3天分裂增殖旺盛，是活力最好时期，称指数增生期(对数生长期)，适宜进行各种试验。(二)操作1．将长成单层的原代培养细胞或HeLa细胞从二氧化碳培养箱中取出，在超净工作台中倒掉瓶内的培养液，加入少许消化液。(以液面盖住细胞为宜)，静置5～10分钟。2.在倒置镜下观察被消化的细胞，如果细胞变园，相互之间不再连接成片，这时应立即在超净台中将消化液倒掉，加入3～5ml新鲜培养液，吹打，制成细胞悬液。3．将细胞悬液吸出2ml左右，加到另一个培养瓶中并向每个瓶中分别加3ml左右培养液，盖好瓶塞，送回二氧化碳培养箱中，继续进行培养。(三)结果一般情况，传代后的细胞在2小时左右就能附着在培养瓶壁上，2～4天就可在瓶内形成单层，需要再次进行传代。三、器材及液体的准备和无菌操作的注意事项(一)器材和液体的准备细胞培养用的玻璃器材，如：培养瓶、吸管等在清洗干净以后，装在铝盒和铁筒中，120℃，2小时干烤灭菌后备用；手术器材、瓶塞、配制好的PBS液用灭菌锅15磅，20分钟蒸气灭菌；MEM培养液、小牛血清、消化液用G6滤器负压抽滤后备用。(二)无菌操作中的注意事项在无菌操作中，一定要保持工作区的无菌清洁。为此，在操作前要认真地洗手并用75％乙醇消毒。操作前20～30分钟起动超净台吹风。操作时，严禁说话，严禁用手直接拿无菌的物品，如瓶塞等，而要用器械，如止血钳、镊子等去拿。培养瓶要在超净台内才能打开瓶塞，打开之前用乙醇将瓶口消毒，打开后和加塞前瓶口都要在酒精灯上烧一下，打开瓶口后的操作全部都要在超净台内完成。操作完毕后，加上瓶塞，才能拿到超净台外。使用的吸管在从消毒的铁筒中取出后要手拿末端，将尖端在火上烧一下，戴上胶皮乳头，然后再去吸取液体。总之，在整个无菌操作过程中都应该在酒精灯的周围进行。【作业】一、原代细胞和传代细胞培养有哪些区别?二、总结一下你自己的经验，怎样才能既迅速，又保证无菌操作。实验十细胞中的微丝染色及微丝与细胞形态的实验观察【实验目的】掌握考马斯亮蓝R250染细胞骨架微丝的方法，了解动物细胞骨架的基本形态结构。【实验用品】1．材料和标本盖片的培养的成纤维细胞C6三片。2．器材和仪器光学显微镜，镊子，小平皿，载片，吸水纸。37℃恒温箱。3．试剂PBS（pH7.2），2%TritonX-100液，M-缓冲液，3%戊二醛固定液，0.2%考马斯亮蓝染液，100μL/mL的细胞松弛素B，DEME培养液。【实验原理】真核细胞胞质中纵横交错的纤维网称为细胞骨架（cytoskeleton）。根据纤维直径、组成成分和组装结构的不同，分为微管(microtubule,MT)、微丝(microfilament,MF)和中间纤维(intermediatefilament,IF)。微丝是肌动蛋白构成的纤维（F-action）。单根微丝直径约7nm，在光学显微镜下看不到。本实验用考马斯亮蓝R250（Coomassiebrilliantblue,R250）显示微丝组成的应力纤维。应力纤维在体外培养的贴壁细胞中尤为发达，形态长而直，常与细胞的长轴平行并贯穿细胞全长。细胞松弛素B可与微丝的亚单位肌动蛋白结合，从而破坏微丝，改变细胞的形状。考马斯亮蓝R250可以染各种蛋白，并非特异染微丝。但在该实验条件下，微管结构不稳定，有些类型的纤维太细，光镜下无法分辨。因此，我们看到的主要是由微丝组成的应力纤维。【实验内容】1．成纤维细胞微丝的染色（1）在平皿中用盖片培养C6成纤维细胞。（2）将盖片放入盛有PBS的平皿内用吸管轻轻吹洗盖片，换液三次，每次3min，洗去培养液。（3）将盖片移入2%TritonX-100液，置37℃恒温箱内处理20~30min。M-缓冲液有稳定细胞骨架的作用。（4）立刻将盖片移入M-缓冲液，换洗三次，每次3min。（5）将盖片移入3%戊二醛固定5min。（6）将盖片移入0.2%考马斯亮蓝染液染液中，染色15min。然后小心的用自来水冲洗，空气干燥。2．成纤维细胞微丝对细胞松弛素B的反应（1）在平皿中有三张成纤维细胞贴壁生长的盖片，在超净工作台内将一张盖片移入另一平皿中继续培养，用作对照。（2）在有两片的平皿内加100μL/mL的细胞松弛素B4滴继续培养半h。（3）将用细胞松弛素B处理过的两张盖片取一张做染色处理，另一张用培养液洗五次（在平皿内换5次培养液，每次都要摇动），继续培养观察。2h后细胞形态恢复，接近正常。（4）对恢复的盖片与第一张没用药的盖片一同做染色处理。【注意事项】1.洗片时要轻柔，以免把细胞从载片上洗去。2.恢复时间要足够，否则细胞不会恢复到未处理前的情况。3.细胞盖片注意正反面。4.染色后应冲洗盖片背面，避免损伤细胞。【观察要点】1.光镜下观察被染成蓝色的微丝聚集成的张力纤维束（注意成纤维细胞中微丝分布的特点）；2.注意观察正常对照片与用药处理后的标本成纤维细胞形状的区别；3.观察用药处理后又洗去药的标本细胞形状是否恢复正常。实验十一应用细胞融合技术制备染色体提前凝集标本【实验目的】通过细胞融合技术，初步了解染色体提前凝集标本制备原理、方法及间期细胞三种时相的提前凝集染色体特点。【实验用品】1.材料人宫颈癌上皮细胞（Hela细胞）2.器材和仪器光学显微镜、离心机、水浴箱、热吹风机、10ml刻度离心管、5号针头注射器、试管架、试管夹、染色槽、废液缸、冰冻载玻片、吸水纸、擦镜纸、香柏油瓶、记号笔、酒精灯。3.试剂50％PEG、Hanks液（pH7.4）、RPMI－1640培养基（含10％灭活小牛血清，pH7.4）、10ug/ml秋水仙素、0.075mol/LKCl低渗液、0.2％次甲基兰染液、1/15mol/LPBS、Carnoy固定液、Giemsa染液。【实验原理】在自然条件下或用人工的方法（物理、化学或生物）将两个或两个以上的同种或不同种细胞融合成一个细胞的过程称为细胞融合。七十年代初，由于发现M期细胞内有某种促进染色体凝集因子，它无种属特异性，所以在细胞融合和染色体技术的基础上，建立了制备染色体提前凝集标本的方法。即让M期细胞与间期（I期）细胞融合，从而诱导I期细胞染色质提前浓缩成染色体。形成的这种染色体称提前凝集的染色体（PrematurelyCondensedChromosome，PCC）。这项技术已应用于细胞周期分析、正常细胞和肿瘤细胞染色体的微细结构的研究、多种因素作用细胞使染色体损伤及修复效应的研究，预测某种血液病的病程、愈后及复发的临床实践等方面。【实验方法】1.收集培养的M期Hela细胞（1）取一瓶处于对数生长期的Hela细胞，向培养基中加入10ug/ml的秋水仙素使终浓度为0.04ug/ml。（2）在37℃二氧化碳培养箱中继续培养12h，使大量生长的细胞被阻断于M期。（3）每组取一瓶经上述处理的细胞，以平行于细胞生长面方向反复振摇，使培养液不断冲刷细胞层（或用吸管吹打），M期细胞因变成球形容易脱离瓶壁而悬浮。（4）将含有M期细胞的培养基移入离心管中，1000rpm离心5min。（5）弃去上清，加入5mlHanks液，用吸管吹打成细胞悬液。2.收集培养的Hela细胞（1）取一瓶生长良好的Hela细胞，弃去培养基。（2）加入少量0.25％的胰蛋白酶消化2-3min，弃去胰酶消化液。（3）加入5mlHanks液，用吸管吹打成单个悬浮细胞备用。3.50％PEG的制备（1）称取0.5gPEG（MW4,000），倒入离心管中。（2）在酒精灯上加热使之融化（约为0.5ml）。（3）再加入预热的Hanks液0.5ml，混匀，置37℃水浴中待用。4.细胞融合（1）将上述两管细胞倒入一个离心管中充分混匀。1000rpm离心5min，弃上清，再小心地吸尽残液。（2）用指弹法弹散细胞，在37℃水浴条件下吸取0.5ml50％PEG，逐滴加入离心管中，并不断地轻轻摇动，整个过程约90秒钟。然后，迅速加入5mlHanks液以终止PEG的作用。在37℃水浴中静置5min。（3）1000rpm离心5min，弃上清，加入2ml含有血清的RPML-1640培养基，同时用5号针头的注射器垂直加入10ug/ml的秋水仙素1滴，轻轻吹打成悬液，37℃水浴中温育30～60min。5.制备PCC标本（1）细胞温育后，以1000rpm离心5min，弃上清，加入10ml0.075mol/LKCL低渗液轻轻制成悬液。（2）在37℃处理25min左右，终止时加入1mlCarnoy固定液进行固定。（3）1000rpm离心8min，弃上清，指弹离心管底部使细胞分散，加入10mlCarnoy固定液固定30min。（4）1000rpm离心5min，弃去上清，留0.2ml残液，用吸管轻轻吹打成悬液。（5）取预冷的载玻片，制一张滴片，烤干。（6）Giemsa染色15min左右，水洗，干燥后镜检。【观察要点】在低倍镜下，可以容易地找到M期与I期细胞融合而诱导产生的PCC图像，由于处于I期不同时相的细胞均能与M期细胞融合而被诱导产生PCC，因此有三种不同形态特点的提前凝集染色体：G1期PCC、S期PCC和G2期PCC。其形态特点分别是：G1期PCC为单线染色体，细长，着色浅呈蓬松的线团状；S期PCC由于染色体解旋，DNA以多点进行复制，复制后的部分着色较深，以双线染色体片段形式存在，故呈粉碎颗粒状结构；G2期PCC因DNA复制完毕，所以可见凝集的双线染色体，但较M期染色体细长。根据上述I期各时期PCC特点，在自己制备的标本中观察并分析各期PCC的图像。实验十二放线菌素D诱导HL60细胞凋亡的实验观察【实验目的】1.熟悉凋亡细胞的形态学特征和生化改变。2.掌握细胞传代培养的基本步骤及无菌操作技术。3.掌握基因组DNA的常规提取方法。4.掌握琼脂糖凝胶电泳及SDS-PAGE的基本原理和操作要点。5.熟悉Hoechst33258和Giemsa两种细胞染色方法，学会荧光显微镜的使用。6.掌握Western免疫印迹方法的原理和基本操作。7.了解采用流式细胞仪进行细胞分析的原理和操作过程。【实验用品】1.材料和标本人白血病细胞HL60细胞2.器材和仪器微量加样器、微量注射器、加样枪头、玻璃匀浆器、离心管、三角烧瓶、载波片、电泳仪、垂直电泳槽、水平电泳槽、水浴锅、涡流振荡器、微波炉、高压锅、转移电泳槽、恒温水浴摇床、多用脱色摇床、紫外透射仪、高速冷冻离心机、普通高速离心机、CO2孵箱、超净台、紫外－可见光分光光度仪、流式细胞仪。—20℃低温冰箱。3.试剂放线菌素D、琼脂糖、异丙醇、70%乙醇、DNAmarker、溴化乙锭、Giemsa染液、PI染液、0.15mol/LNaCl溶液、TAE缓冲液、丙稀酰胺、过硫酸胺、双蒸水、TEMED、SDS、TE缓冲液、考马斯亮蓝R250、甲醇、冰醋酸、电泳样品缓冲液、转移缓冲液、甘氨酸、Tris碱、浓HCl、双蒸水、甲醇、单去污剂裂解液、0.01mol/LPBS(pH7.3)、蛋白分子量Marker、封闭液、TBST、TBS、洗脱抗体缓冲液、显影液、定影液、抗体、化学发光试剂。【实验原理】细胞凋亡是发生于细胞内的、由基因控制的自主性死亡过程。伴随凋亡的发生，细胞将出现一系列的形态学和生化改变，主要包括细胞皱缩、染色质凝集、凋亡小体形成、DNA片段化等。目前已发展了各种针对凋亡细胞特征的检测方法，可对凋亡细胞进行分析，以研究凋亡的发生机制及各种诱导因素的作用等。本实验将通过抗肿瘤药物放线菌素D对人白血病细胞的诱导凋亡作用，检测凋亡过程中细胞的形态学及生化改变。细胞培养是一种模拟体内生理环境，使细胞在体外存活并生长、繁殖的技术，可为各种细胞研究提供具有良好均一性的细胞来源。维持细胞体外繁殖的主要手段是进行细胞的传代培养，即将培养中的细胞分散，从容器中取出，以1：2或1：3以上的比率转移到另外的容器中进行培养。本实验将通过传代培养过程获得所细胞。放线菌素D是抗肿瘤类抗生素，其主要作用是通过与DNA结合，阻断依赖DNA的mRNA的合成，从而阻碍蛋白质合成，抑制瘤细胞分裂，引起细胞凋亡。细胞凋亡时，发生染色质凝集、核破裂、凋亡小体形成等形态学改变，在对细胞进行染色处理后，可在光学显微镜下观察。Hoechst33258为与A-T结合的特异性DNA荧光染料，对活细胞和固定细胞均能染色。Giemsa是一种复合染料，可对染色体染色。流式细胞术是一种可对细胞进行精确分选和分析的技术。PI是一种DNA特异性荧光染料，同细胞的结合与DNA含量成正比，利用此特点流试细胞仪可将处于不同细胞周期的细胞分开。细胞凋亡时，染色质凝聚，DNA裂解，在制备样品过程中，低分子量的DNA片段扩散，加之凝聚的染色质排斥染色，致使凋亡细胞的可染性低，在直方图的G0/G1期峰前出现特殊的亚二倍体峰。细胞凋亡时，细胞内核酸内切酶活化，特异性地切断核小体连接区DNA，形成长度为180-200bp整数倍的核苷酸片段，进行琼脂糖电泳时会出现特征性的梯形条带。EB染液能特异性插入双链DNA，在紫外照射下可检测到DNA条带。目前研究表明，Bcl2基因家族与细胞凋亡的发生密切相关，Bcl2是Bcl2家族的主要代表，具有抑制凋亡的作用，放线菌素D在诱导细胞凋亡过程中Bcl