沉默miR156表达的mimicry156载体的构建及转化烟草的研究

沉默miR156表达的mimicry156载体的构建及转化烟草的研究 冯圣军，章玉婷，缪家顺，詹 妮，朱祝军，于 超，王华森 （浙江农林大学农业与食品科学学院／浙江农林大学生物种业研究中心，杭州 ３１１３００） 摘要：ｍｉＲ１５６在植物营养生长阶段幼年期向成年期的转变过程中发挥重要的调控作用，其通过降解ＳＰＬｓ基因ｍＲＮＡ和翻译抑制调控靶基因的表达。通过定向改造拟南芥内源性Ｔａｒｇｅｔ ｍｉｍｉｃｒｙ ＩＰＳ１（ＩＮＤＵＣＥＤ ＢＹ ＰＨＯＳＰＨＡＴＥ ＳＴＡＲＶＡＴＩＯＮ １）构建了抑制ｍｉＲ１５６表达的ｍｉｍｉｃｒｙ１５６载体，并转化获得转基因烟草植株，转基因植株ｍｉｍｉｃｒｙ１５６对内源性ｍｉＲ１５６具有抑制作用。该 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 为研究ｍｉＲ１５６在植物营养生长阶段的调控作用提供了方便有效的途径。 关键词 ：ｍｉＲ１５６；Ｔａｒｇｅｔ ｍｉｍｉｃｒｙ ＩＰＳ１；表达载体；转化 中图分类号：Ｑ７８５文献标识码：A文章编号：0439－８114（２０15）01－0210-05 DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.01.055 Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｍｉｃｒｙ１５６ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒ Silencing ｍｉＲ１５６ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｏｂａｃｃｏ ＦＥＮＧ Ｓｈｅｎｇ－ｊｕｎ， ＺＨＡＮＧ Ｙｕ－ｔｉｎｇ， ＭＩＡＯ Ｊｉａ－ｓｈｕｎ， ＺＨＡＮ Ｎｉ， ＺＨＵ Ｚｈｕ－ｊｕｎ， ＹＵ Ｃｈａｏ， ＷＡＮＧ Ｈｕａ－ｓｅｎ （Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ／Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｅｅｄ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ， Ｚｈｅｊｉａｎｇ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ ＆ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｈａｎｇｚｈｏｕ ３１１３００，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｉｎ ｐｌａｎｔｓ ｍｉＲ１５６ ｐｌａｙｓ ａｎ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｒｏｌｅ ｉｎ ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ ｊｕｖｅｎｉｌｅ－ａｄｕｌｔ ｐｈａｓｅ ｃｈａｎｇｅ ｏｆ ｐｌａｎｔ ｖｅｇｅｔａｔｉｖｅ ｓｔａｇｅ and ｃｏｎｔｒｏｌｓ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔａｒｇｅｔ ｇｅｎｅｓ ＳＰＬｓ ｂｙ ｃｌｅａｖａｇｅ ｔｈｅｉｒ ｍＲＮＡ ｏｒ ｉｎｈｉｂｉｔ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ． Ｔｈｅ ｓｉｌｅｎｔ ｖｅｃｔｏｒ ｏｆ ｍｉＲ１５６ was ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ ｂｙ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｔａｒｇｅｔ ｍｉｍｉｃｒｙ （ＩＰＳ１， ＩＮＤＵＣＥＤ ＢＹ ＰＨＯＳＰＨＡＴＥ ＳＴＡＲＶＡＴＩＯＮ １）． Ｔｈｅ ｔｒａｎｓｇｅｎｅ ｔｏｂａｃｃｏ ｗａｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ． Ｂｏｔｈ ｏｆ ｔｈｅｍ ｈａd ｏｐｐｏｓｉｔｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｍｉＲ１５６． Ｔｈｉｓ ｍｅｔｈｏｄ will ｐｒｏｖｉｄｅ ａｎ ｅａｓｙ ａｎｄ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｗａｙ ｆｏｒ ｓｔｕｄｙｉｎｇ ｔｈｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉＲ１５６． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｍｉＲ１５６；Ｔａｒｇｅｔ ｍｉｍｉｃｒｙ ＩＰＳ１；ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ；ｔｒａｎｓｆｏｒｍ 收稿日期：２０１４－０６－３０ 基金项目：国家自然科学基金项目（３１１０１５５４）；浙江省自然科学基金资助项目（ＬＱ１２Ｃ１５００１２）；２０１２年浙江省“三农六方”农业科技协作计划 项目（１１３－２０４５２１０１６０）；浙江省公益性行业科研资助项目（２０１２Ｃ２２０１９） 作者简介：冯圣军（１９８８－），男，江苏南京人，在读博士研究生，研究方向为植物遗传发育、蔬菜生理与分子生物学，（电话）１８９１５９４２２３９ （电子信箱）５１１５８２５４６＠ｑｑ．ｃｏｍ；通信作者，王华森，男，副教授，主要从事植物遗传发育、蔬菜生理与分子生物学研究，（电子信箱） ｗｈｓｙｃｈ６６＠１６３．ｃｏｍ。 ｍｉＲＮＡ是真核生物中非编码的小ＲＮＡ，在基因转录后的调控过程中发挥重要作用，一般位于编码蛋白质的基因之间，在高等植物编码蛋白质基因的转录产物中存在茎环（Ｓｔｅｍ－Ｌｏｏｐ）结构，经过一系列复杂的加工后，Ｄｉｃｅｒ－Ｌｉｋｅ（ＤＣＬ）家族基因将茎环结构中大约２１个核苷酸大小的成熟ｍｉＲＮＡ单链切割出来，其可以选择性地装载到ＲＮＡ诱导的沉默复合体（ＲＮＡ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｃｏｍｐｌｅｘ，ＲＩＳＣ）上，ｍｉＲＮＡ与靶标ＲＮＡ进行互补配对，造成靶标ＲＮＡ的降解或翻译抑制［１］，因而能在转录后水平专一性调控靶基因的表达。通常ｍｉＲＮＡ与其靶基因之间的表达呈负相关，即在组织水平上某个ｍｉＲＮＡ含量的增加往往伴随着其靶基因转录水平的下降，与转录抑制因子相比，ｍｉＲＮＡ能在转录后水平更迅速地调节靶蛋白质含量，显著缩短调控反应的延滞期，精确维持靶蛋白质的稳定状态，从而有效地调控植物的生长发育［２］、生物及非生物的胁迫响应［３］。 ｍｉＲ１５６在植物营养生长阶段幼年期向成年期转变过程中发挥重要的调控作用，其在拟南芥（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）［４］，玉米（Ｚｅａ ｍａｙｓ）［５］，苔藓（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ ｐａｔｅｎｓ）［６］、番茄（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）［７］，夏堇（Ｔｏｒｅｎｉａ ｆｏｕｒｎｉｅｒｉ）［８］、软枝草（Ｐａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍ Ｌ．）［９］、水稻（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）［１０］等植物中都被证明是营养期转化的关键调控因子。ｍｉＲ１５６通过降解ＳＰＬｓ基因ｍＲＮＡ并通过翻译抑制调控靶基因表达，ｍｉＲ１５６的表达丰度随着植物发育进程逐渐降低的同时，解除了对ＳＰＬｓ基因的抑制从而顺利调控植物幼年向成年的过渡。 ｍｉＲ１５６等ｍｉｃｒｏＲＮＡ在植物中的重要调节作用已成为近年来研究的热点。正向遗传学研究法通过诱变剂处理，大量筛选突变体研究其表型和生理代谢。但是这种方法随机性较大，不易获得目的ｍｉＲＮＡ功能缺失的突变体，给研究带来了较大的障碍。靶基因模拟（Ｔａｒｇｅｔ ｍｉｍｉｃｒｙ，ＴＭ）技术的出现提供了一种新颖的ｍｉＲＮＡ研究方法。 植物中磷的生理平衡受复杂的调控系统支配，从而有效地控制植物的生长［１１］。研究发现ｍｉＲ３９９、ＰＨＯ２和ＩＰＳ１形成反馈循环系统调节植物中磷的动态平衡。在缺磷胁迫下ｍｉＲ３９９诱导降解与其具有一段互补区域的ＰＨＯ２ ｍＲＮＡ，ＰＨＯ２能够编码一种Ｅ２泛素结合酶，而这种酶影响植物中磷的含量和再利用过程［１２］。除了ＰＨＯ２ ｍＲＮＡ能够与ｍｉＲ３９９互补结合外，研究发现ＴＰＳＩ基因家族的ｍＲＮＡ同样含有ｍｉＲ３９９的结合域，ＩＰＳ１（ＩＮＤＵＣＥＤ ＢＹ ＰＨＯＳＰＨＡＴＥ ＳＴＡＲＶＡＴＩＯＮ １）属于ＴＰＳＩ家族的一员，但与ｍｉＲ３９９互补配对的ＩＰＳ１不仅没有降解反而具有抑制ｍｉＲ３９９活动的效果［１２］。与ｍｉＲ３９９调节ＰＨＯ２的靶位点相比，ＩＰＳ１在结合域的中心位点有３个核苷酸的插入，相当于ｍｉＲＮＡ调节靶基因结合区域的突起部分，从而阻止了ｍｉＲ３９９－ＲＩＳＣ复合体对ＩＰＳ１的切割，同时ＩＰＳ１占据ｍｉＲ３９９，从而抑制其对靶基因的降解作用［１３］。研究发现，ＩＰＳ１作用原理同样可用于抑制其他ｍｉＲＮＡ的活动［１３］，本研究通过定向改造拟南芥内源性ＩＰＳ１构建抑制ｍｉＲ１５６表达的ｍｉｍｉｃｒｙ１５６载体，旨在为进一步研究ｍｉＲ１５６在植物营养阶段的调控作用打下基础。 １ 材料 关于××同志的政审材料调查表环保先进个人材料国家普通话测试材料农民专业合作社注销四查四问剖析材料 与方法 １．１ 材料与试剂 １．１．１ 材料 拟南芥（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）哥伦比亚生态型（Ｃｏｌ－０），烟草（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ）（ＮＣ８９）均为浙江农林大学蔬菜品质改良重点实验室保存。 １．１．２ 细菌菌株与质粒载体 根癌农杆菌（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）菌种ＧＶ３１０１，由ｐＣａｍｂｉａ３３００改造的具有ｐＵｂｉ１０ 启动子的ｐＳＹ０６表达载体，均为本实验室保存。大肠杆菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）菌种Ｔｒａｎｓ５α Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｃｅｌｌ，克隆载体 ｐＥＡＳＹ？誖－Ｂｌｕｎｔ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ均购自全式金生物技术有限公司（北京）。 １．１．３ 酶及生化试剂 卡那霉素（Ｋａｎ）、庆大霉素（Ｇｅｎ）、羧苄青霉素（Ｃａｒｂ）和草甘膦（ＰＰＴ）均购自Ｓｉｇｍａ 公司。高保真ＤＮＡ 聚合酶PｈｕｓｉｏｎＴＭ Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ购自于美国ＮＥＢ（ＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ ＢＩＯＬＡＤＳ）公司。限制性内切酶ＳｐｅⅠ／ＢａｍＨⅠ、Ｔ４ ＤＮＡ 连接酶及反转录试剂盒、定量ＰＣＲ试剂盒均为Ｔａｋａｒａ公司（大连）产品。质粒提取试剂盒、琼脂糖凝胶电泳回收试剂盒购自生工生物 工程 路基工程安全技术交底工程项目施工成本控制工程量增项单年度零星工程技术标正投影法基本原理 股份有限公司（上海）。总ＲＮＡ 提取试剂盒Ｔｒｉｚｏｌ购自Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司，引物合成、测序由华大基因有限公司完成。 １．２ 方法 １．２．１ 拟南芥ＩＰＳ１基因克隆 以缺磷培养的拟南芥（Ｃｏｌ－０）为材料，依据Ｔrizol试剂盒说明 书 关于书的成语关于读书的排比句社区图书漂流公约怎么写关于读书的小报汉书pdf 进行总ＲＮＡ 的提取，并进行反转录得到ｃＤＮＡ。根据ＩＰＳ１的全长ｃＤＮＡ 序列，利用Ｐｒｉｍｅｒ Ｐｒｅｍｉｅｒ ５．０ 引物 设计 领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计 软件在编码区两端分别设计扩增引物Ｐ１（５’－ＧＧＡＣＴＡＧＴＡＴＧＧＧＧＡＧＡＣＡＡＣＣＡＴＧＣＴＧ－３’）和Ｐ２（５’－ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＴＣＡＡＡＡＣＡＡＣＣＣＡＡＡＡＧＴＧＧ－３’）。Ｐ１引物的５’端加入 ＢａｍＨⅠ酶切位点，Ｐ２引物５’端加入 ＳｐｅⅠ酶切位点，以拟南芥ｃＤＮＡ为模板，ＰＣＲ 扩增ＩＰＳ１基因。ＰＣＲ 反应条件为９４ ℃ ３ ｍｉｎ， ９４ ℃ ３０ ｓ，６０ ℃ ３０ ｓ，７２ ℃ ３０ ｓ，３５ 个循环；７２ ℃延伸７ ｍｉｎ。将获得的ＰＣＲ产物经１０ ｇ／Ｌ的琼脂糖凝胶电泳后，切下目的条带，用胶回收试剂盒回收备用。 １．２．２ 定向改造ＩＰＳ１基因 定向改造ＩＰＳ１基因，通过重叠ＰＣＲ获得ｍｉｍｉｃｒｙ１５６目的片段。将ＩＰＳ１上与ｍｉＲ３９９ 结合的区域，通过设计特定引物Ｐ３（５’－ＣＴＴＴＧＡＣＡＧＡＡＧＡＴＡＧＡＡＧＴＧＡＧＣＡＴＴＴＴＣＴＡ ＧＡＧＧＧＡＧＡＴＡＡ－３’）和Ｐ４（５’－ＡＡＡＴＧＣＴＣＡＣＴＴＣＴ Ａ ＴＣＴＴＣＴＧＴＣＡＡＧＣＴＴＣＧＧＴＴＣＣＣＣＴＣＧ－３’），改造为ｍｉＲ１５６与其靶基因结合区域，通过融合ＰＣＲ的方法，以上述克隆到的ＩＰＳ１基因为模板，分别以Ｐ１、Ｐ３和Ｐ４、Ｐ２作为引物分段扩增，得到２个克隆片段。然后用这２个片段为模板，以Ｐ１和Ｐ２为引物，通过融合ＰＣＲ扩增，产物即为改造好的ｍｉｍｉｃｒｙ １５６片段。扩增ＰＣＲ 反应条件为９４ ℃ ３ ｍｉｎ，９４ ℃ ３０ ｓ，６８ ℃ ３０ ｓ，７２ ℃ ３０ ｓ， ３５ 个循环；７２ ℃ ７ ｍｉｎ。融合ＰＣＲ 反应条件为９４ ℃ ３ ｍｉｎ，９４ ℃ ３０ ｓ，６０ ℃ ３０ ｓ，７２ ℃ ３０ ｓ，３５ 个循环；７２ ℃ ７ ｍｉｎ。将获得的ＰＣＲ产物经１０ ｇ／Ｌ的琼脂糖凝胶电泳后，切下目的条带，用胶回收试剂盒回收。 １．２．３ ｍｉｍｉｃｒｙ１５６载体的构建 将上述回收得到的目的片段进行定向连接，连接到克隆载体ｐＥＡＳＹ？誖－Ｂｌｕｎｔ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ上，连接产物转化到感受态大肠杆菌Ｔｒａｎｓ５α，菌液经ＰＣＲ和测序验证。提取阳性克隆质粒经ＳｐｅⅠ和ＢａｍＨⅠ双酶切后，回收目的片段连入ｐＳＹ０６表达载体中，通过菌液ＰＣＲ与ＳｐｅⅠ和ＢａｍＨⅠ双酶切验证后，采用冻融法转入农杆菌ＧＶ３１０１中，－８０ ℃保存菌株。 １．２．４ 烟草的遗传转化与鉴定 利用农杆菌介导的叶盘转化法转化烟草ＮＣ８９［１４］，通过５０ ｍｇ／Ｌ ＰＰＴ筛选转基因抗性植株，并提取Ｔ０代烟草转基因株系进行基因组ＰＣＲ 鉴定。 ２ 结果与分析 ２．１ 定向改造ＩＰＳ１为ｍｉｍｉｃｒｙ１５６ Ｔａｒｇｅｔ ｍｉｍｉｃｒｙ通过隔绝ｍｉＲＮＡ来调控ｍｉＲＮＡ对靶基因的降解活动，这种作用机制为ｍｉＲＮＡ的功能研究提供了异于传统遗传学且方便有效的途径。ＩＰＳ１作为典型的内源性Ｔａｒｇｅｔ ｍｉｍｉｃｒｙ，在缺磷胁迫下与ｍｉＲ３９９共同维持植物体内磷代谢平衡。根据这种机制本试验将ＩＰＳ１定向改造为抑制ｍｉＲ１５６表达的沉默载体。以缺磷培养的拟南芥ｃＤＮＡ为模板，通过ＰＣＲ扩增出ＩＰＳ１基因全长。通过设计特异性引物Ｐ３、Ｐ４，将ＩＰＳ１与ｍｉＲ３９９的结合区域改造为ｍｉＲ１５６与其靶基因互补的区域（图１），利用重叠延伸的方法，以ＩＰＳ１的编码序列为模板进行分段扩增（引物分别为Ｐ１、Ｐ３和Ｐ２、Ｐ４）。将２种ＰＣＲ产物回收并作为模板，以Ｐ1和Ｐ２为引物进行融合ＰＣＲ扩增，产物即为ｍｉｍｉｃｒｙ１５６，图２为重叠ＰＣＲ的具体流程示意图。 ２．２ 植物表达载体的构建 ｍｉｍｉｃｒｙ１５６片段与ｐＥＡＳＹ？誖－Ｂｌｕｎｔ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ载体连接并转化到大肠杆菌Ｔｒａｎｓ５α后，如图３Ａ菌液ＰＣＲ电泳结果所示，已筛选到了阳性转化子。测序结果进一步表明，阳性克隆的序列与设计的序列保持一致。用限制性内切酶ＳｐｅⅠ和ＢａｍＨⅠ将质粒和ｐＳＹ０６进行双酶切，经回收后将目的基因片段插入表达载体ｐＳＹ０６、ｐＵＢＱ１０启动子的下游，构成ｍｉｍｉｃｒｙ１５６载体，将构建好的载体分别用ＳｐｅⅠ和ＢａｍＨⅠ双酶切（图３Ｂ）并进行测序验证，结果证明ｍｉｍｉｃｒｙ１５６载体已构建成功。图３Ｃ结果表明，含ｍｉｍｉｃｒｙ１５６片段的ｐＳＹ０６植物表达载体已成功转化到农杆菌中。 ２．３ 烟草转ｍｉｍｉｃｒｙ１５６植株的鉴定 将构建好的表达载体转化农杆菌，通过农杆菌介导的叶盘转化法转化烟草，获得转基因植株，图４为烟草的遗传转化过程。 为了检测转基因是否成功，以野生型和表现出除草剂（Ｂａｓｔａ）抗性的转基因烟草植株的基因组ＤＮＡ为模板，通过ｂａｒ基因和ｍｉｍｉｃｒｙ１５６序列设计的特异性引物ｂａｒＦ（５’－ＧＣＧＧＴＣＴＧＣＡＣＣＡＴＣＧＴＣＡＡ－３’）、ｂａｒＲ（５’－ＡＡＡＣＣＣＡＣＧＴＣＡＴＧＣＣＡＧＴＴＣＣ－３’）和ｍｉｍｉＦ（５’－ＴＣＡＴＧＴＡＡＧＧＡＡＡＧＣＧＴＴＴＴＡＡ－３’）、ｍｉｍｉＲ（５’－ＡＣＴＧＧＴＣＴＧＡＣＴＡＴＴＣＴＣＣＡＡＡ－３’）分别进行ＰＣＲ扩增，鉴定转基因植株。从图５中可以看出，转基因植株基因组中扩增出ｂａｒ基因和ｍｉｍｉｃｒｙ１５６片段，而野生型植株中没有扩增出相应片段，初步判定目的基因已整合到烟草的染色体上。 ２．４ 转基因烟草表型分析 将上述ＰＣＲ检测获得的８株Ｔ０代阳性植株中的９号和３４号株系Ｔ１代种子和野生型烟草种子播种于无菌土中，经４ ℃破休眠４８ ｈ后移入温室中，此时开始计算植株年龄，待小苗长出子叶后喷施Ｂａｓｔａ，筛选自交分离含Ｔ－ＤＮＡ的植株，真叶长出后转基因植株与野生型植株表型逐渐表现出不同（图６Ａ）。ｍｉｍｉｃｒｙ１５６植株表现出快速成熟的表型（图６Ｂ）：开花明显提前（图６Ｃ），叶片数量低于野生型植株（图６Ｄ）。相同时间内ｍｉｍｉｃｒｙ１５６超表达植株叶片发生速率明显低于野生型烟草（图６Ｅ）。 ３ 讨论 ｍｉＲ１５６及其靶基因ＳＰＬｓ控制的营养生长阶段转变，被证明与植物一些重要的经济性状调控相关，如参与控制植物叶形、叶片大小、叶片发生速率、叶片扩展率、茎直径、不定根的发生、侧分支的形成、开花时间、花絮结构等。拟南芥超表达ｍｉＲ１５６可使幼年莲座叶数目显著增多，从而有效增加生物量，为生物能源开发提供了参考；对园艺作物番茄与观赏花卉夏堇的研究发现，ｍｉＲ１５６对作物株型的修整和果实形状大小的改变发挥重要的作用［７，８］；能源植物软枝草过表达ｍｉＲ１５６显著提高了叶片数量，为燃料的生产提供资源，同时针对性地表达ｍｉＲ１５６可提高可溶性糖的含量［９］。研究发现，ｍｉＲ１５６在植物多种营养物质合成路径中发挥重要的作用，Ｇｏｕ等［１５］研究证实ｍｉＲ１５６活动的增加提高了拟南芥花青素的含量，揭示了花青素、黄酮等次生代谢产物受到ｍｉＲ１５６－ＳＰＬｓ的调节。新近研究发现，光合作用的主要产物—糖，能够作为一个可移动的信号分子抑制新生叶原基中ｍｉＲ１５６的表达，从而促进营养生长阶段转变的发生［１６－１８］。因此，研究ｍｉＲ１５６－ＳＰＬｓ在植物中的调控机制具有重要意义。 传统的遗传方法研究ｍｉＲＮＡ具有很大的局限性，Ｔａｒｇｅｔ ｍｉｍｉｃｒｙ的出现提供了一种全新的调节特定内源性ｍｉＲＮＡ表达量的方法。本试验通过ＲＴ－ＰＣＲ方法克隆了拟南芥ＩＰＳ１基因，同时定向改造为具有ｍｉＲ１５６结合位点的抑制ｍｉＲ１５６表达的ｍｉｍｉｃｒｙ１５６。为了进一步研究其对ｍｉＲ１５６的调节功能，构建了启动子ｍｉｍｉｃｒｙ１５６植物表达载体，并将其转化到烟草中。转基因植株基因组ＰＣＲ和Ｂａｓｔａ检测表明，ｍｉｍｉｃｒｙ１５６已经整合到烟草染色体中，转基因后代与野生型对照相比，其叶片发生率降低，开花提前，表现出早熟的性状。上述结果表明，Ｔａｒｇｅｔ ｍｉｍｉｃｒｙ为ｍｉＲ１５６在植物间保守的调控功能提供了新颖的研究方法，为未来的研究奠定了基础。 参考文献： ［１］ ＢＡＲＴＥＬ Ｄ Ｐ． ＭｉｃｒｏＲＮＡｓ：Gｅｎｏｍｉｃｓ， ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ， ｍｅｃｈａｎｉｓｍ， ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ［Ｊ］． Ｃｅｌｌ，２００４，１１６：２８１－２９７． ［２］ ＷＵ Ｇ． Ｐｌａｎｔ mｉｃｒｏＲＮＡｓ ａｎｄ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ［Ｊ］． Ｊ Ｇｅｎｅｔ 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ｆｏｕｒｎｉｅｒｉ［Ｊ］． Ｐｌａｎｔａ， ２０１２， ２３６（4）： １０２７－１０３５． ［９］ ＦＵ Ｃ X， ＳＵＮＫＡＲ Ｒ， ＺＨＯＵ Ｃ E， ｅｔ ａｌ． Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｍｉＲ１５６ ｉｎ ｓｗｉｔｃｈｇｒａｓｓ （Ｐａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍ Ｌ．） ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎ ｖａｒｉｏｕｓ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｌｅａｄｓ ｔｏ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｂｉｏｍａｓｓ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ［Ｊ］． Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｊ，２０１２，１０：４４３－４５２． ［１０］ ＸＩＥ Ｋ Ｂ， ＳＨＥＮ Ｊ Ｑ， ＨＯＵ Ｘ， ｅｔ ａｌ． Ｇｒａｄｕａｌ ｉｎｃｒｅａｓｅ ｏｆ ｍｉＲ１５６ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｔｅｍｐｏｒａｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｃｈａｎｇｅｓ ｏｆ ｎｕｍｅｒｏｕｓ ｇｅｎｅｓ ｄｕｒｉｎｇ ｌｅａｆ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｉｎ ｒｉｃｅ［Ｊ］． Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ， ２０１２， １５８： １３８２-１３９４． ［１１］ ＣＨＩＯＵ Ｔ Ｊ， ＡＵＮＧ Ｋ， ＬＩＮ Ｓ Ｉ， ｅｔ ａｌ． Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ ｂｙ ｍｉｃｒｏＲＮＡ ｉｎ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ［Ｊ］． Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ， ２００６，１８（2）：４１２-４２１． ［１２］ ＦＲＡＮＣＯ－ＺＯＲＲＩＬＬＡ Ｊ Ｍ， ＶＡＬＬＩ Ａ， ＴＯＤＥＳＣＯ Ｍ， ｅｔ ａｌ． Ｔａｒｇｅｔ ｍｉｍｉｃｒｙ ｐｒｏｖｉｄｅｓ ａ ｎｅｗ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｆｏｒ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｃｒｏＲＮＡ ａｃｔｉｖｉｔｙ ［Ｊ］． Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， ２００７，３９： １０３３－１０３７． ［１３］ ＴＯＤＥＳＣＯ Ｍ， ＲＵＢＩＯ－ＳＯＭＯＺＡ Ｉ， ＰＡＺ－ＡＲＥＳ Ｊ， ｅｔ ａｌ． Ａ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔａｒｇｅｔ ｍｉｍｉｃｓ ｆｏｒ ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｍｉｃｒｏＲＮＡ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ［Ｊ］． ＰＬｏＳ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， ２０１０， ６（7）： ｅ１００１０３１． ［１４］ ＨＯＲＳＣＨ Ｒ Ｂ， ＦＲＹ Ｊ Ｅ， ＨＯＦＦＭＡＮＮ Ｎ Ｌ， ｅｔ ａｌ． Ａ ｓｉｍｐｌｅ ａｎｄ ｇｅｎｅｒａｌ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎｇ ｇｅｎｅ ｉｎｔｏ ｐｌａｎｔｓ［Ｊ］． Ｓｃｉｅｎｃｅ， １９８５， ２２７： １２２９－１２３１． ［１５］ ＧＯＵ Ｊ Ｙ， ＦＥＬＩＰＥ Ｆ Ｆ， ＬＩＵ Ｃ Ｊ， ｅｔ ａｌ． Ｎｅｇａｔｉｖｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｈｏｃｙａｎｉｎ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｉｎ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｂｙ ａ ｍｉＲ１５６－tａｒｇｅｔｅｄ ＳＰＬ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ［Ｊ］． Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ，２０１１，２３（4）： １５１２-１５２２． ［１６］ ＹＡＮＧ Ｌ， ＣＯＮＷＡＹ Ｓ Ｒ， ＰＯＥＴＨＩＧ Ｒ Ｓ． Ｖｅｇｅｔａｔｉｖｅ ｐｈａｓｅ ｃｈａｎｇｅ ｉｓ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ ａ ｌｅａｆ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｓｉｇｎａｌ ｔｈａｔ ｒｅｐｒｅｓｓｅｓ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉＲ１５６［Ｊ］． Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，２０１１，１３８（2）：２４５－２４９． ［１７］ ＹＡＮＧ Ｌ， ＸＵ Ｍ L， ＫＯＯ Ｙ， ｅｔ ａｌ． Ｓｕｇａｒ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｖｅｇｅｔａｔｉｖｅ ｐｈａｓｅ ｃｈａｎｇｅ ｉｎ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ ｂｙ ｒｅｐｒｅｓｓｉｎｇ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＭＩＲ１５６Ａ ａｎｄ ＭＩＲ１５６Ｃ［Ｊ］． Elｉｆｅ，２０１３，２： ｅ００２６０． ［１８］ ＹＵ Ｓ， ＣＡＯ Ｌ， ＺＨＯＵ Ｃ Ｍ， ｅｔ ａｌ． Ｓｕｇａｒ ｉｓ ａｎ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｃｕｅ ｆｏｒ ｊｕｖｅｎｉｌｅ－ｔｏ－ａｄｕｌｔ ｐｈａｓｅ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ ｉｎ ｐｌａｎｔｓ［Ｊ］． Elｉｆｅ， ２０１３，２：ｅ００２６９． （责任编辑 赵 娟） 1