基于CRISPR-Cas9定向编辑CCL17和CCL22基因的研究

  基于CRISPRCas9定向编辑CCL17和CCL22基因的研究  高淑慧瞿创吴凤麟沈晗[Summary]目的针对人源的CCL17和CCL22基因进行CRISPR/Cas9-gRNA 设计 领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计 ，并验证设计的sgRNA的有效敲除效率。方法利用CRISPR网站提供的工具对CCL17和CCL22基因的靶向编辑位点进行筛选设计，然后构建CRISPR-Cas9-CCL17和CRISPR-Cas9-CCL22敲除质粒，并将构建好的质粒转入293T细胞系，然后通过基因组PCR产物的T-A克隆测序方法分别验证设计的sgRNA敲除质粒的编辑效率。结果成功构建针对于人源CCL17和CCL22基因的sgRNA敲除质粒，并有着良好的编辑效率，均达70%以上。结论针对CCL17和CCL22基因设计的CRISPR敲除质粒对靶基因有着很好的编辑效果，为后续基于CCL17和CCL22的相关性研究奠定了基础。[Key]CRISPR；引导RNA；趋化因子；基因编辑[]R319[]A[]1674-4721（2018）4（c）-0004-05StudyongenomeeditingtargetingCCL17andCCL22usingCRISPR-Cas9systemGAOShu-huiQUChuangWUFeng-linSHENHan▲SchoolofBiosciencesandBiopharmaceutics，GuangdongPharmaceuticalUniversity，GuangdongProvinceKeyLaboratoryforBiotechnologyDrugCandidate，Guangzhou510006，China[Abstract]ObjectiveTodesignCRISPR/Cas9-gRNAtargetinghumanCCL17andCCL22gene，andtoevaluatetheeditingeffectivenessofthesgRNA.MethodsThetargetededitingsitesofCCL17andCCL22geneswerescreenedusingtoolsprovidedbyCRISPRwebsite，thentheknockoutplasmidofCRISPR-Cas9-CCL17andCRISPR-Cas9-CCL22wereconstructedandseparatelytransfectedinto293Tcells.Finally，theT-AeditingandsequencingmethodsofgenomicPCRproductswereusedtoverifytheeditingefficiencyofthedesignedsgRNAknockoutplasmid.ResultsTheknockoutplasmidofCRISPR-sgRNAtargetinghumanCCL17andCCL22genewassuccessfullyconstructedwithhigheditingefficiency，reachedmorethan70%.ConclusionTheCRISPR-Cas9-CCL17andCRISPR-Cas9-CCL22showgoodeditingefficiency，whichprovidefoundationforthedeepresearchofthefunctiononCCL17andCCL22.[Keywords]Clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicreapeat；sgRNA；Chemokines；Genomeediting趋化因子是一组具有趋化作用的小分子蛋白，参与机体各种免疫细胞的迁移，并在局部免疫调节的各种组织中承担重要功能。目前，已有众多研究表明机体免疫系统与肿瘤的发生、发展相互作用，而趋化因子因对免疫细胞的迁移作用成为肿瘤研究中新的关注点[1]。CCL17，即胸腺和活化调节趋化因子（thymusandactivationregulatedche-mokine，TARC），與CCL22，即巨噬细胞来源的趋化因子（macrophage-derivedchemokine，MDC）同为趋化因子大家族中的一员，人源基因均定位于染色体16q13，两者有37%同源氨基酸序列[2-5]，且共有一个高亲和力受体CCR4，是CC趋化因子受体（CCchemokinereceptor，CCR），由Power等在嗜碱性粒细胞系中得到，具有蛋白激酶作用的磷酸化位点，广泛表达于单核细胞、树突状细胞、中性粒细胞、NK细胞和T细胞等炎症相关细胞[6-7]。最初的研究发现，CCL17和CCL22参与过敏性炎症反应的发生、发展。一方面Semmling等[8]发现，在α-GC诱导的交叉免疫反应中，CD8+DC细胞在交叉提呈过程中分泌的趋化因子CCL17不仅能促进NKT细胞表达趋化因子受体CCR4并与其结合后刺激NKT细胞的活化，还能促进DC细胞与初始T细胞的接触从而提高提呈效率，以发挥免疫监视作用。Naoko等[9]又发现，经瘤内注射AdRGD-CCL17显著减缓了CT26肿瘤模型的疾病进展，且肿瘤消退主要与免疫效应细胞在肿瘤组织部位浸润相关。另一方面，在肿瘤免疫逃逸过程中发挥重要作用的Tregs细胞能够有效抑制效应T细胞的抗肿瘤作用，而Treg细胞表面表达CCR4受体，在Gobert等[10-13]的研究中，Treg细胞在肿瘤微环境中的迁移则主要通过趋化因子CCL22介导。作为CCR4的高亲和力受体，趋化因子CCL17和CCL22虽然在很多方面有相似性，但其在免疫系统中的调节作用却各有不同，因趋化因子主要是通过与其受体结合而发挥作用，而很多研究都是将CCR4基因沉默，同时抑制了CCL17和CCL22的功能，笔者分别针对人源CCL17和CCL22基因设计靶向CRISPR-sgRNA敲除质粒，从而能更好地对趋化因子各自的功能进行更彻底的相关性研究[14]。CRISPR/Cas9（clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicreapeat/CRISPR-associatednuclease9）系统是一种继锌指核酸酶之后的可对基因组进行靶向修饰的新型编辑技术，其开发具有成本低、易于构建、编辑效率高等优势，在研究中的应用更为广泛[15-17]。本实验选用CRISPR/Cas9系统对人源性趋化因子CCL17和CCL22基因进行了基因编辑方面的探索性研究，旨在为后续趋化因子CCL17和CCL22的相关研究奠定基础。1材料和方法1.1材料pX458质粒为实验室保存菌种；大肠埃希菌DH5α感受态购自广州TAKARA代理公司；pGEM-TEasyVector与T4DNA连接酶购自Promega公司；AxyPrepDNAGelExtractionKit与PCRCleanupKit试剂盒购自AXYGEN公司；BbsⅠ限制性内切酶与DNA聚合酶购自广州NEB代理公司；引物与sgRNA均由英潍捷基公司合成。1.2靶向sgRNA的设计及寡核苷酸链合成通过NCBI网站得到目的基因CCL17和CCL22的基因序列，然后综合多个设计sgRNA的网站筛选结果与PAM位点原则获得20个碱基，同时在正向5′端加碱基序列”cacc”，反向5′端加碱基序列”aaac”，使sgRNA的黏性末端能与BbsⅠ酶切后的黏性末端互补（表1）。表1CCL17、CCL22gRNA核心序列1.3pX458-sgRNA质粒载体的构建将公司合成的sgRNA序列稀释至一定浓度，然后进行磷酸化修饰，产物置于4℃保存。利用限制性内切酶BbsⅠ将pX458质粒进行酶切，酶切产物进行切胶回收后与载体进行4℃过夜连接，连接产物转入大肠埃希菌感受态DH5α，培养后挑选阳性单克隆菌落摇菌后取部分菌液送去测序。1.4pX458质粒功能的验证1.4.1细胞转染取生长状态良好的293T细胞经消化处理成单细胞悬液后进行计数，以每孔5×106个细胞种于六孔板中，待8～10h细胞贴壁后密度达到80%，磷酸钙转染法将前期构建成功的pX458-CCL17和pX458-CCL22敲除质粒分别转染293T细胞。24h后可通过荧光倒置显微镜来观察绿色荧光蛋白的表达情况，72h后可借助流式细胞仪来检测转染效率。1.4.2细胞基因组DNA的提取和PCR扩增利用AxyPrepDNAGelExtractionKit试剂盒提取72h后293T细胞的基因组DNA。针对靶向基因CCL17和CCL22筛选的sgRNA位点，在位点300～500bp附近设计一对引物（CCL17Knockout-F：5′-AGATCTTCCACGAACACCCC-3′；CCL17Knockout-R：5′-AATAGGTTGGACCTCATGGC-3′；CCL22Knockout-F：5′-CCCCGCTCCTAGAGCTGACT-3′；CCL22Knockout-R：5′-TCTGGTAGCCCTGCCACATT-3′）进行编辑后基因组DNA扩增，将扩增好且条带正确的PCR产物送去公司测序。1.4.3PCR产物纯化、T载体连接及测序对PCR测序结果进行分析，选择有套峰出现的PCR产物经AxyPrepPCRCleanupKit试剂盒纯化后测定产物浓度，然后与pGEM-T载体4℃过夜连接，将连接好的产物转入大肠埃希菌DH5α感受态，37℃培养12～16h，然后挑取阳性单克隆菌落摇菌并进行菌液PCR测序，将测序结果进行相应的分析统计。2结果2.1pX458-sgRNA质粒载体的构建分析连接产物转化大肠埃希菌挑取单菌落后用U6、sgRNA反向序列作上下游引物经PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳检测，将出现目的条带的菌液进行测序，用软件分析测序后碱基序列，如图1所示，即阳性菌落测出的碱基序列与设计的sgRNA序列完全相同，确定在酶切位点成功插入sgRNA，由此，靶向CCL17和CCL22基因的敲除质粒构建成功。图1所构建pX458质粒的测序结果2.2pX458質粒的细胞转染效率分析处理转染时间达72h的细胞，以未转染质粒组作空白对照，通过流式细胞仪检测敲除质粒转染组的绿色荧光蛋白的表达情况从而计算转染效率，结果如图2所示。Control：未转pX458敲除质粒的阴性组；CCL17、CCL22：相应pX458敲除质粒转染组图2PX458质粒转染效率的检测结果2.3pX458质粒转染后编辑功能的检测分别将转染pX458-CCL17与pX458-CCL22质粒的各细胞组经消化处理后提取293T细胞基因组的DNA，根据设计好的PCR产物进行扩增，然后测序分析，发现阴性未转染组在PAM位点基本都是单一的峰，而pX458-CCL17与pX458-CCL22质粒转染组在PAM位点前3个碱基处开始出现明显的套峰（如图3A），提示设计的sgRNA均有良好的靶向性。T-A克隆后，将出现条带的菌液送测序后分析测序结果，靶向CCL17基因的10个测序样品中有9个克隆出现编辑情况，如图3B所示，有2个克隆在同一位点发生9个碱基的缺失，其余7个则是在不同位点发生缺失情况，且碱基的缺失数目也不同，由此得出pX458-CCL17敲除质粒的编辑效率为90%。靶向CCL22基因共有6个克隆出现了编辑情况，如图4B所示，有1个克隆出现1个A/T碱基的插入，其余5个则是不同碱基数目的缺失，共送样20个阳性克隆测序，考虑到其转染效率，由此得出pX458-CCL22敲除质粒的编辑效率为73.2%。A.基因组PCR测序结果；B.基因组PCR的T-A克隆测序结果“-”表示碱基序列的丢失，“+”表示碱基序列的插入，“*”表示该编辑序列在测序中重复出现的次数图3CCL17-sgRNA的编辑效率结果A.基因组PCR测序结果；B.基因组PCR的T-A克隆测序结果“-”表示碱基序列的丢失，“+”表示碱基序列的插入，“*”表示该编辑序列在测序中重复出现的次数图4CCL22-sgRNA的编辑效率结果3讨论随着肿瘤免疫研究的发展，机体免疫系统在肿瘤的发生、發展及转归方面的相关作用机制逐渐成为热点，趋化因子能够趋化各种免疫细胞的迁移，因而在机体免疫调节中承担着重要功能。越来越多的研究发现，趋化因子参与肿瘤微环境的调节，影响肿瘤进展。Henry等[18-19]的研究发现，DC细胞能够分泌趋化因子CCL17促进与初始T细胞的活化作用，增强抗肿瘤免疫作用。又有报道显示，在卵巢癌中趋化因子CCL22能够通过与CCR4结合趋化Treg细胞的迁移从而抑制杀伤性T细胞的抗肿瘤作用[20]。虽CCL17与CCL22有共同的高亲和力受体CCR4，但两者在肿瘤免疫中的作用机制仍备受争议[21-22]。由于以往研究大多是将CCR4受体抑制后再进行相关研究，从而无法直接对CCL17和CCL22各自的功能进行研究，于是本文结合日渐成熟的CRISPR/Cas9编辑技术，分别针对CCL17和CCL22基因设计靶向sgRNA，从而能够为CCL17和CCL22两者更严谨的研究提供工具，奠定基础。CRISPR/Cas9靶向基因编辑系统是继锌指核酸酶（Zincfingernucleases，ZFNs）[23]和转录激活因子样效应物核酸酶（transcriptionactivator-likeeffectornucleases，TALENs）[24]之后的新型定点编辑技术，但后两者的筛选和组装过程都需要较高的技术要求，并且潜在的细胞毒性问 题 快递公司问题件快递公司问题件货款处理关于圆的周长面积重点题型关于解方程组的题及答案关于南海问题 也需要后续研究，而CRISPR/Cas9编辑系统则具有成本高、易于构建及编辑效率高等优势，其开发为基因定点修饰技术提供了新的平台，越来越成为研究的热点[25]。本研究则利用CRISPR/Cas9编辑系统对趋化因子CCL17和CCL22进行定点编辑，在构建载体时选用pX458质粒，质粒上带有BbsⅠ酶切位点，在设计的sgRNA上添加黏性末端则可连入pX458质粒，操作简单。根据前期对sgRNA的PAM结构的相关设计原则研究，选取编辑效率最好的NGG（N可以为A/T/C/G）结构5′端的20个碱基作为靶向序列，并联合多个设计网站综合评分设计出sgRNA-CCL17和sgRNA-CCL22。成功构建pX458-CCL22和pX458-CCL22敲除质粒后，在编辑效率的验证过程中，由于同一基因在同一种属的不同细胞中的基因组序列是相同的，因此选取常规的磷酸钙转染293T细胞来验证敲除效率。因转染效率未达到预期效果，利用pX458自身带有的绿色荧光报告蛋白将细胞进行流式分选，将转染成功的细胞分选后再进行基因组的提取及后续研究，通过编辑后的测序分析，发现通过将细胞分选后再进行基因组的提取及后续PCR产物扩增，编辑情况及编辑效率则能更彻底地显现。测序结果显示，虽然针对两个基因在设计sgRNA时遵循的设计原则相同，但在实际的编辑中效率仍会出现差异，分析原因应与基因自身的sgRNA有关，因而在设计sgRNA时应综合考虑，尽量遵循已报道的具有高编辑效率的序列特点。此外，与良好的编辑效率相比，今后的实验还应考虑到基因编辑的脱靶率的相关研究。综上所述，本研究成功构建分别针对于人源CCL17和CCL22基因的CRISPR/Cas9敲除质粒，并通过验证，设计的sgRNA序列具有较好的编辑效率，为趋化因子CCL17和CCL22在肿瘤免疫中后续的研究提供了工具，奠定了基础。[Reference][1]RossiD，ZlotnikA.Thebiologyofchemokinesandtheirreceptors[J].AnnuRevImmunol，2012，54（1-3）：111-120.[2]ImaiT，YoshidaT，BabaM，etal.MolecularcloningofanovelTcell-directedCCchemokineexpressedinthymusbysignalsequencetrapusingepstein-barrvirusvector[J].JBiolChem，1996，271（35）：21514-21516.[3]AsojoOA，BoulègueC，HooverDM，etal.Structuresofthymusandactivation-regulatedchemokine（TARC）[J].ActaCrystallogrDBiolCrystallogr，2003，59（7）：1165-1173.[4]BerinMC，EckmannL，BroideDH，etal.RegulatedproductionoftheThelper2-typeT-cellchemoattractantTARCbyhumanbronchialepithelialcellsinvitroandinhumanlungxenografts[J].AmJRespirCellMolBiol，2001，24（4）：382-389.[5]WagsaterD，DienusO，LofgrenS，etal.QuantificationofthechemokinesCCL17andCCL22inhumancolorectaladenocarcinomas[J].MolMedRep，2008，1（2）：211.[6]MizukamiY，KonoK，KawaguchiY，etal.CCL17andCCL22chemokineswithintumormicroenvironmentarerelatedtoaccumulationofFoxp3+regulatoryTcellsingastriccancer[J].IntJCancer，2008，122（10）：2286-2293.[7]InngjerdingenM，DamajB，MaghazachiAA.HumanNKcellsexpressCCchemokinereceptors4and8andrespondtothymusandactivation-regulatedchemokine，macrophage-derivedchemokine，andI-309[J].JImmunol，2000，164（8）：4048-4054.[8]SemmlingV，Lukacs-KornekV，ThaissCA，etal.Alternativecross-primingthroughCCL17-CCR4-mediatedattractionofCTLstowardNKTcell-licensedDCs[J].NatImmunol，2010，11（4）：313-320.[9]NaokoK，MasakazuN，HatanakaY，etal.CC-chemokineligand17genetherapyinducestumorregressionthroughaugmentationoftumor-infiltratingimmunecellsinamurinemodelofpreexistingCT26coloncarcinoma[J].IntJCancer，2007，121（9）：2013-2022.[10]GobertM，TreilleuxI，Bendriss-VermareN，etal.RegulatoryTcellsrecruitedthroughCCL22/CCR4areselectivelyactivatedinlymphoidinfiltratessurroundingprimarybreasttumorsandleadtoanadverseclinicaloutcome[J].CancerRes，2009，69（5）：2000-2009.[11]QinXJ，ShiHZ，DengJM，etal.CCL22recruitsCD4-positiveCD25-positiveregulatoryTcellsintomalignantpleuraleffusion[J].ClinCancerRes，2009，15（7）：2231-2237.[12]IshidaT，UedaR.CCR4asanovelmoleculartargetforimmunotherapyofcancer[J].CancerSci，2006，97（11）：1139-1146.[13]TakeuchiA，MasatoshiE，YamadaH，etal.AreductionofrecipientregulatoryTcellsbycyclophosphamidecontributestoananti-tumoreffectofnonmyeloablativeallogeneicstemcelltransplantationinmice[J].IntJCancer，2012，130（2）：365-376.[14]SantullimarottoS，BoakyeK，LacyE，etal.EngagementoftwodistinctbindingdomainsonCCL17isrequiredforsignalingthroughCCR4andestablishmentoflocalizedinflammatoryconditionsinthelung[J].PLoSOne，2013，8（12）：1254-1258.[15]WiedenheftB，SternbergSH，DoudnaJA.RNA-guidedgeneticsilencingsystemsinbacteriaandarchaea[J].Nature，2012，482（7385）：331-338.[16]BhayaD，DavisonM，BarrangouR.CRISPR-Cassystemsinbacteriaandarchaea：versatilesmallRNAsforadaptivedefenseandregulation[J].AnnuRevGenet，2011，45（45）：273-297.[17]ScottDA，RanFA，ZhangF，etal.GenomeengineeringusingtheCRISPR-Cas9system[J].NatProtoc，2013，32（12）：815-819.[18]HenryCJ，OrnellesDA，MitchellLM，etal.IL-12producedbydendriticcellsaugmentsCD8+TcellactivationthroughtheproductionofthechemokinesCCL1andCCL17[J].JImmunol，2009，181（12）：8576-8584.[19]KangS，XieJ，MaS，etal.TargetedknockdownofCCL22andCCL17bysiRNAduringDCdifferentiationandmaturationaffectstherecruitmentofTsubsets[J].Immunobiology，2010，215（2）：153-162.[20]CurielTJ，CoukosG，ZouL，etal.SpecificrecruitmentofregulatoryTcellsinovariancarcinomafostersimmuneprivilegeandpredictsreducedsurvival[J].NatMed，2004，10（9）：942-949.[21]TaniK，AzumaM，NakazakiY，etal.PhaseIstudyofautologoustumorvaccinestransducedwiththeGM-CSFgeneinfourpatientswithstageⅣrenalcellcancerinJapan：clinicalandimmunologicalfindings[J].MolTher，2004，10（4）：799-816.[22]ChristianM，CermakT，DoyleEL，etal.TargetingDNAdouble-strandbreakswithTALeffectornucleases[J].Genetics，2010，186（2）：757-761.[23]BibikovaM，BeumerK，TrautmanJK，etal.Enhancinggenetargetingwithdesignedzincfingernucleases[J].Science，2003，300（5620）：764-764.[24]ChoSW，KimS，KimJM，etal.TargetedgenomeengineeringinhumancellswiththeCas9RNA-guidedendonuclease[J].NatBiotechnol，2013，31（3）：230-232.[25]LiJ，ShouJ，GuoY，etal.EfficientinversionsandduplicationsofmammalianregulatoryDNAelementsandgeneclustersbyCRISPR/Cas9[J].JMolCellBiol，2015，7（4）：284-287.（ -全文完-