光谱分析技术(好资料)课件

光谱分析技术光学导论光谱：复色光经色散系统分光后，按波长（或频率）的大小依次排列的图像光学导论基于测量物质的光谱而建立起来的分析 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 称为光谱分析法吸收光谱发射光谱分子光谱原子光谱光学导论吸收光谱颜色的差异——定性颜色的深浅——定量光学导论发射光谱化学发光热/电激发发光光致发光光学导论光谱分析法的准确分类分子光谱吸收（根据吸收波段不同细分）紫外-可见红外发射（根据发射原理不同细分）光致发光：荧光、磷光化学发光光学导论光谱分析法的准确分类原子光谱吸收发射（根据发射原理不同细分）热/电激发发光：发射光致发光：荧光光学导论光谱分析≠光学分析！光学分析=光谱分析+非光谱分析非光谱分析：基于物质与辐射的相互作用，测量辐射的某些性质，如折射、散射、干涉、衍射和偏振等变化的分析方法光学导论光谱分析与非光谱分析的区别光谱分析涉及“颜色”“谱”“能量”的变化非光谱分析涉及光的传播方向等物理性质的变化，不涉及“谱”光学导论光的本质：电磁辐射、波粒二象性波波长λ、频率γ、速度υυ=γλc(真空中的υ)=3×108m·s-1波长λ：相邻两个波峰或波谷间的直线距离单位可以是nm、μm、cm、m频率γ：在1秒时间内经过某点的波数（即每秒内振动的次数）单位Hz(s-1)周期T：频率的倒数；波数σ：波长的倒数光学导论射线x射线紫外光红外光微波无线电波10-2nm10nm102nm104nm0.1cm10cm103cm105cm电磁波谱：将电磁辐射按照波长或频率的大小顺序排列起来即称为电磁波谱光学导论光学导论粒光子：能量E、普朗克常数h、电子伏特eVh=6.626×10-34J·s1J=6.241×1018eVＥ=hγ=hc/λ当物质所吸收的电磁辐射能量能够满足该物质由低能态(基态)跃迁至高能态(激发态)，将产生吸收光谱当物质通过电、热或光等激发至激发态，再从激发态过渡到低能态或基态时，将产生发射光谱吸收光谱发射光谱光学导论某分子的外层价电子从基态跃迁到激发态需要20eV，请问该分子吸收光的波长？解：1eV=1.602×10-19J根据公式Ｅ=hc/λ则λ=hc/Ｅ=（6.626×10-34×3×108）/（20×1.602×10-19）=0.62×10-7m=62nm紫外-可见分光光度法什么是紫外-可见光谱远紫外光区：10~200nm近紫外光区：200~400nmUVC：200~280nmUVB：280~320nmUVA：320~400nm可见光区：400~780nm红外光区：780nm~1mm什么是紫外-可见分光光度法基于分子外层价电子跃迁产生的在紫外-可见光谱区的吸收光谱进行分析的一种常用的光谱分析方法。ultravioletandvisible(UV-vis)spectrophotometry基本原理分子的三种运动状态对应有一定的能级。即在分子中存在着：电子能级振动能级转动能级这三种能级都是量子化的分子能量的变化：E=Ee+Ev+ErEe>Ev>Er基本原理基本原理分子吸收光（电磁波）后产生的能量的变化：远红外光谱（转动光谱）中红外光谱（振动光谱）紫外-可见光谱（电子光谱）基本原理带状光谱发生电子跃迁时必然要发生振动能级和转动能级的跃迁，这使得紫外-可见吸收光谱呈现带状典型的紫外-可见吸收光谱图吸收峰最大吸收波长(λmax)基本原理价电子σ电子→饱和的单键π电子→不饱和的双键、三键n电子→孤对电子分子中分子轨道有成键轨道与反键轨道：它们的能级高低为：σ<π<n<π*<σ***n非键轨道反键轨道反键轨道成键轨道成键轨道→*n→*→*n→*>>> 1.σ→σ*跃迁：饱和烃（C-C，C-H）能量很高，λ<150nm2.n→σ*跃迁：含杂原子饱和基团（-OH，-NH2）能量较大，λ150~250nm3.π→π*跃迁：不饱和基团（C=C，C≡C）能量较小，λ~200nm共轭体系，E更小，λ>200nm4.n→π*跃迁：含杂原子不饱和基团（C≡N，C=O）能量最小，λ200~400nm基本原理 影响紫外-可见吸收光谱的因素1共轭效应共轭体系越长，π与π*的能量差越小，红移效应和增色效应越明显。2立体化学效应空间位阻、跨环效应3溶剂的影响溶剂效应4体系pH的影响Tips：由于溶剂对电子光谱图影响很大，因此，在吸收光谱图上或数据表中必须注明所用的溶剂。与已知化合物紫外光谱作对照时也应注明所用的溶剂是否相同。在进行紫外光谱法分析时，必须正确选择溶剂。朗伯-比尔定律——定量分析的基础当强度为I0的一定波长的单色入射光束通过装有均匀待测物的溶液介质时，该光束将被部分吸收Ia，部分反射Ir，余下的则通过待测物的溶液It，即有：I0=Ia+It+Ir朗伯-比尔定律如果吸收介质是溶液（测定中一般是溶液），式中反射光强度主要与器皿的性质及溶液的性质有关，在相同的测定条件下，这些因素是固定不变的，并且反射光强度一般很小。所以可忽略不记，这样：I0=Ia+It朗伯-比尔定律透光率——透光率表示透过光强度与入射光强度的比值，用T来表示，计算式为：T=It/I0T常用百分比（%）表示。吸光度——透光率的倒数的对数叫吸光度。用A表示：A=-lgT=lg(I0/It)朗伯-比尔定律当用一束强度为I0的单色光垂直通过厚度为b、吸光物质浓度为c的溶液时，溶液的吸光度正比于溶液的厚度b和溶液中吸光物质的浓度c的乘积。朗伯-比尔定律IoItbaA=lg(I0/It)=Kbc朗伯-比尔定律吸光系数：当溶液浓度c的单位为g/L,溶液液层厚度b的单位为cm时，K叫“吸光系数”，用a表示，其单位为L·g-1·cm-1摩尔吸光系数：当溶液浓度c的单位为mol/L，液层厚度b的单位为cm时，K叫“摩尔吸光系数”，用ε表示，其单位为L·mol-1·cm-1ε=aM(M为吸光物质的分子量)工作原理基仪器结构框图光源碘钨灯氘灯单色器测量池参比池样品池光电倍增管数据处理和仪器控制紫外-可见分光光度计紫外-可见分光光度计单光束分光光度计双光束分光光度计紫外-可见分光光度计吸收池的材料玻璃360nm2.25mm紫外-可见分光光度计石英200nm2.5mm紫外-可见分光光度计吸收池的形状紫外-可见分光光度计思考 题 快递公司问题件快递公司问题件货款处理关于圆的周长面积重点题型关于解方程组的题及答案关于南海问题 为什么紫外可见分光光度计的最大吸收值只能到3或者5，超过该值便会造成数据溢出？ 生物分子的紫外-可见吸收光谱糖紫外可见光谱在糖的分析中,主要作定量检测。最大吸收波长为218nm,多糖最大吸收波长为206nm。○ 生物分子的紫外-可见吸收光谱脂脂肪○○230~240nm,于有机溶剂中（如乙醇、正己烷等）类脂维生素A326nm于乙醇番茄红素番茄红素在溶剂正己烷中的谱图番茄红素在溶剂石油醚中的谱图生物分子的紫外-可见吸收光谱生物分子的紫外-可见吸收光谱蛋白质Proteinsinsolutionabsorbultravioletlightwithabsorbancemaximaat280and200nm.Aminoacidswitharomaticringsaretheprimaryreasonfortheabsorbancepeakat280nm.Peptidebondsareprimarilyresponsibleforthepeakat200nm.酪氨酸色氨酸苯丙氨酸**可编辑生物分子的紫外-可见吸收光谱核酸嘌呤和嘧啶在250～280nm有强的吸收作用，综合起来在260nm吸收值最大。Tips：1.吸收强度：单核苷酸>单链DNA>双链DNA（增色效应、减色效应）2.A260/A280＝1.8～2.0，DNA较纯　A260/A280<1.8，DNA样品中含有蛋白质A260/A280>2.0，DNA样品中含有RNA微生物的紫外-可见吸收光谱600nm测细菌等微生物的浊度，用于估计细菌的生长情况。比如，得到的OD600的数值如果在0.6-0.8之间，表明细菌处于旺盛生长的对数生长期，OD600>3表明细菌已经饱和等。核酸蛋白测定仪EppendorfBioPhotometerplusELISA原理图①固相的抗原或抗体（免疫吸附剂）②酶标记的抗原或抗体（标记物）③酶作用的底物（显色剂）酶标仪酶标仪TecanInfinite®200Pro多功能酶标仪ELISA 酶 底物 显色反应 测定波长 辣根过氧化物酶 邻苯二胺四甲替联苯胺氨基水杨酸邻联苯甲胺2,2‘-连胺基-2(3-乙基-并噻唑啉磺酸-6)铵盐 橘红色黄色棕色兰色蓝绿色 492460449425642 碱性磷酸酯酶 4-硝基酚磷酸盐(PNP)萘酚-AS-Mx磷酸盐+重氮盐 黄色红色 400500 葡萄糖氧化酶 ABTS+HRP+葡萄糖葡萄糖+甲硫酚嗪+噻唑兰 黄色深蓝色 405420 β-Ｄ－半乳糖苷酶 甲基伞酮基半乳糖苷(4MuG)硝基酚半乳糖苷(ONPG) 荧光黄色 360,450420分子荧光光谱什么是荧光光谱某些物质经紫外-可见光照射后，能立即放出能量较低（亦即波长较长）的光——光致发光。当照射停止后，如化合物的发射在10-9秒钟内停止，则称荧光(fluorescence);超过此限度即称为磷光(phosphorescence)。什么是荧光光谱基本原理Ee0Ev0Ev1Ev2Ev3Ev4Ee1Ee2荧光发射：当分子处于单重激发态的最低振动能层时，去活化的一种形式是以10-9~10-7s左右的短时间内发射光子返回基态，这一过程称为荧光发射。激发光谱激发光谱固定荧光发射波长，扫描激发波长荧光激发光谱与紫外-可见吸收光谱类似，Why？横坐标是入射光（激发光）的波长，纵坐标是发射光（荧光）的强度发射光谱固定激发光波长，扫描发射波长横坐标是发射光（荧光）的波长，纵坐标是发射光（荧光）的强度发射光谱(荧光光谱)2.三维荧光光谱IF∝f(λex、λem)蒽的激发光谱固定发射波长、扫描激发波长IF∝f(λex、λem)蒽的发射光谱固定激发波长、扫描发射波长蒽的三维等高线光谱图蒽的三维等荧光强度光谱荧光量子产率（荧光效率）kF为荧光发射过程的速率常数，取决于荧光物质的分子结构；Ki为其他过程（如振动弛豫等）的速率常数总和，主要取决于化学环境，同时也与荧光物质的分子结构有关。 化合物 F 0.1 0.29 0.46 0.60 0.52荧光与有机化合物的结构1.π*→π是有机化合物产生荧光的主要跃迁类型。2.产生荧光的有机物质，都含有共轭双键体系，共轭体系越大，荧光越容易产生。产生荧光的条件荧光物质的刚性和平面性增加，有利于荧光发射。3.刚性平面结构荧光与有机化合物的结构荧光强度与浓度的关系荧光的淬灭荧光淬灭：荧光分子与溶剂分子或其它溶质分子相互作用引起荧光强度降低或消失的现象。荧光淬灭剂：这些溶剂分子或其它溶质分子称为荧光淬灭剂（如卤素离子、重金属离子、氧分子、硝基/羰基/羧基化合物等）。荧光能量共振转移（FRET）能量共振转移（FRET）FluorescenceResonanceEnergyTransfer相互作用的研究荧光分光光度计光源氙灯激发单色器样品池光电倍增管数据处理仪器控制发射单色器问题：荧光分光光度计与紫外-可见分光光度计有何异同点？紫外-可见分光光度计:荧光(磷光)分光光度计:荧光分光光度计样品池1.样品池的材料：与紫外-可见分光光度计的吸收池一样2.吸收池的形状：紫外-可见分光光度计的吸收池两面透光荧光分光光度计的样品池四面透光问题：紫外-可见分光光度计的吸收池与荧光分光光度计的样品池有什么区别？荧光分光光度计紫外-可见分光光度计测量池(吸收池)荧光分光光度计样品池I0ItI0ItIF,p荧光分光光度计荧光光谱的应用芳香族化合物存在共轭的不饱和体系，是有机化合物荧光测定的主要类型。1.有机化合物的鉴定 待测物 试剂 λexmax λemmax 测定范围ppm 丙三醇 苯胺 紫外 蓝色 0.1~2 糠　醛 蒽酮 465 505 1.5~15 氨基酸 氧化酶 315 425 0.01~50 维生素A 无水乙醇 345 490 0~20 蛋白质 曙红丫 紫外 540 0.06~6 肾上腺素 乙二胺 420 525 0.001~0.02 青霉素 α-甲氧基-６-氯-９-(β-氨乙基)-氨基氮杂蒽 420 500 0.0625~0.625 玻璃酸梅 3-乙酰氧基吲哚 395 470 0.001~0.033 胍基丁胺 邻苯二醛 365 470 0.05~5 四氧嘧啶 苯二胺 365 485 10-4荧光光谱的应用2.分子标记与追踪　在生物学研究中，科学家们利用能发光的荧光分子对生物体进行标记。将荧光分子通过化学方法“挂在”其他“不可见”的分子上，原来不可见的部分就变得可见了。生物学家利用这种标记方法，把原本透明的细胞、细胞器或生物分子从黑暗的显微镜视场中“揪出来”。量子点（无机纳米粒子）荧光染料（有机小分子）荧光蛋白（蛋白质）荧光光谱的应用2.1荧光在核酸研究中的应用——电泳MidoriGreenEthidiumbromide荧光光谱的应用SYBRGreenI2.2荧光在核酸研究中的应用实时定量荧光PCR（RT-qPCR）2.3荧光在核酸研究中的应用—分子信标荧光光谱的应用Taq-Man荧光光谱的应用2.4荧光在蛋白质研究中的应用几种含苯基侧链的氨基酸可以发出荧光，且受微环境变化的影响，因此可用于作为内源荧光探针来研究蛋白质构象。荧光光谱的应用2.5ELISA中的“荧光”荧光光谱的应用下村修等人于1962年在一种学名为Aequoreavictoria的水母中发现能发光的蛋白——绿色荧光蛋白（greenfluorescentprotein,GFP）。分子质量为26kDa，由238个氨基酸构成。2008年诺贝尔化学奖授予了下村修以及另外两位科学家（美国科学家马丁·沙尔菲和美籍华裔科学家钱永健），以表彰他们发现和发展了绿色荧光蛋白质技术。细胞标记荧光光谱的应用活体标记荧光光谱的应用1.传统的荧光分子在发光的同时，会产生具有毒性的氧自由基，导致被观察的细胞死亡，这叫做“光毒性”，因此，在绿色荧光蛋白发现以前，科学家们只能通过荧光标记来研究死亡细胞静态结构，而绿色荧光蛋白的光毒性非常弱，非常适合用于标记活细胞，在GFP出现之前这完全不可想象。2.荧光蛋白与靶蛋白的连接可直接通过二者表达基因的融合，转导至宿主细胞，在宿主细胞中翻译表达出靶蛋白与荧光蛋白的复合体。绿色荧光蛋白荧光光谱的应用可以发出各种颜色荧光的荧光蛋白荧光光谱的应用荧光光谱的应用量子点(quatumdots)Cd/Pb/Zn---S/Se/Te1.量子点的荧光强度比常用的有机荧光材料高几十倍。2.高稳定性，有机荧光材料会遭遇光漂白，长时间激发后造成荧光效率的不断降低；量子点则可承受长时间高强度的激发。3.量子点的激发光范围广，而发射光范围窄。（这意味着什么？）量子点荧光光谱的应用当需要同时荧光标记几个不同靶标时，量子点较广的激发范围意味着可以在同一激发光波长下同时激发不同的量子点。而窄范围的发射光范围则使得不同量子点发出的不同颜色的荧光更易鉴别和测量，减少了干扰。**可编辑