鞘内注射Cav3.3反义寡聚核苷酸对CCD大鼠痛阈的影响

鞘内注射Cav3.3反义寡聚核苷酸对CCD大鼠痛阈的影响【摘要】目的观察鞘内注射Cav3.3反义寡聚核苷酸对慢性背根节压迫(chroniccompressionofdorsalrootganglion,CCD)大鼠痛阈的影响，探讨脊髓Cav3.3T型钙通道在神经病理痛中的作用。方法鞘内置管的雄性SD大鼠32只，随机分为4组(行为学n＝8，)：CCD＋NS组、CCD+Cav3.3反义核苷酸组(CCD+Cav3.3AS)、CCD+Cav3.3错义核苷酸组(CCD+Cav3.3MM)、假手术(sham)＋NS组。各组大鼠在CCD或sham后第1天开始连续4d每天两次鞘内分别注射Cav3.3AS、Cav3.3MM12.5μg/10μl或NS10μl，行为学部分分别观察术后1、3、5、7、10、14d大鼠机械缩足阈值(mechanicalwithdrawalthreshold,MWT)和热缩足潜伏期(thermalwithdrawallatency，TWL)。结果鞘内注射Cav3.3反义寡聚核苷酸能显著延缓CCD大鼠痛敏的形成，在CCD术后10d才形成与CCD＋NS组类似的痛敏，而鞘内注射Cav3.3错义核苷酸则与NS组无统计学差异。结论脊髓Cav3.3参与神经病理痛的形成，抑制脊髓Cav3.3基因的表达具有疼痛治疗作用。【Abstract】ObjectiveToinvestigatetheroleoftheCav3.3inspinalcordinthedevelopmentoftheneuropathicpain，toweobservedtheeffectofCav3.3antisenceoligonucleotideintrathecallyadministeredonthepainthresholdoftheratsfollowingchroniccompressionofdorsalrootganglion.MethodsThirtytwomaleSDratsafterimplantedcatheterintrathecallyweredividedintofourgroups(ethologyn=8,):CCD+NSgroups,CCD+Cav3.3antisenceoligonucleotide(CCD+Cav3.3AS)group,CCD+Cav3.3mismatcholigonucleotide(CCD+Cav3.3MM)group,sham+NSgroup.TheratsineverygroupwereintrathecallyadministeredrespectivelyCav3.3AS,CCD+Cav3.3MMtwiceadayfrompostoperation1dayto4daywith12.5μｇ/10μlor10μlNS.Measuredmechanicalwithdrawalthresholdandthermalwithdrawallatencyofratsineverygroupbeforeoperationandpostoperation1,3,5,7,10and14dayswithvonFreyhair.ResultsCav3.3ASintrathecallyadministeredcandelaythedevelopmentoftheCCDrats,anditwasuntilpostoperation10daytheMWTandTWLoftheratsinCav3.3ASgroupbecamesimilarwiththeCCD+NSgroup,however,theMWTandTWLoftheratsinCav3.3MMgrouphadnosignificancedifferenceVSCCD+NSgroup.ConclusionCav3.3TchannelmayhaveimportantroleinthedevelopmentoftheneuropathicpainandinhibitingtheexpressionofspinalcordCav3.3genemaycontributetothetreatmentoftheneuropathicpain.【Keywords】Neuropathicpain;Ttypecalciumchannels；Chroniccompressionofdorsalrootganglion；Spinalcord________________________________________1.1主要试剂和仪器反义寡聚核苷酸以大鼠Cav3基因序列为基础设计，由上海生工合成［2］，序列如下：Cav3.3反义寡聚核苷酸5GCTGAGGGCGGCTTGTGTTT3，错义寡聚核苷酸作为反义寡聚核苷酸处理的对照组，序列如下：5TACTGTACTTGCGAGGCCAC3，使用前用生理盐水稀释。抗Cav3.3抗体购自美国SantaCruz公司，辣根酶标记兔抗山羊IgG和DAB试剂盒购自北京中山公司。vonFrey纤维丝和热痛刺激仪BME410A分别购自美国Stolting公司和中国医学科学院生物工程研究所。1.2实验动物与分组健康成年雄性SpragueDawley大鼠48只，体重250～280g,由徐州医学院实验动物中心提供。行为学实验包括32只大鼠，随机分为4组(n=8)，即CCD+NS组：鞘内注射生理盐水；CCD+Cav3.3AS组：鞘内注射Cav3.3反义寡聚核苷酸；CCD+Cav3.3MM组：鞘内注射Cav3.3错义寡聚核苷酸；sham+NS组：鞘内注射生理盐水。各组大鼠在鞘内置管成功后5d行CCD手术或sham手术，术后第1天起，连续4d每天两次，鞘内分别注射12.5μg，容积均为10μl的反义、错义寡聚核苷酸或10μl生理盐水。分子生物学westernblot实验每组4只(n=4)。1.3CCD模型的建立参照胡三觉等［3］方法。SD大鼠在1%戊巴比妥40mg/kg腹腔注射麻醉后，沿L4～6棘突右侧切皮，分离脊椎右侧肌肉，暴露L4～6横突及其间的椎间孔，用弯成直角的长4mm，直径0.7mm的钢棒，以与背部正中线成30度以及与脊柱侧面水平线成10度向头背端插入L4和L5椎间孔(深度约3～4mm)。假手术组(sham)仅暴露L4、L5横突和椎间孔，不插入钢棒。1.4鞘内置管大鼠腹腔注射1%戊巴比妥40mg/kg麻醉，采用Yaksh法［4］，行鞘内置管术，大鼠清醒24h后观察其活动情况，剔除出现运动功能障碍的大鼠不用。术后第3天用2％利多卡因10μl经导管注射来判断导管的位置，如注射后30s内大鼠出现双后肢麻痹说明导管位置正确。5d后即可用于实验。实验时每次给药后用10μl生理盐水冲洗PE管。1.5行为学测定用vonFrey细丝测定大鼠的机械性缩足阈值(mechanicalwithdrawalthreshold,MWT)，用热辐射法测定大鼠热缩足潜伏期(thermalwithdrawallatency，TWL)。各组大鼠在手术前两天测定基础痛阈及手术后1至14dMWT和TWL。1.5.1MWT的测定用VonFrey纤维丝以updown法推算50%缩足阈值［5］：测定首先从2g开始，当该力度的刺激不能引起阳性反应，则给予相邻大一级力度的刺激；如出现阳性反应则给予相邻小一级力度的刺激，如此连续进行，直至出现第一次阳性和阴性反应的骑跨，再连续测定4次。1.5.2TWL的测定应用热刺激仪照射大鼠足底，记录从照射开始至出现足逃避反射的时间(s)，此即为热刺激缩足潜伏期；重复测量3次，取其平均值作为热刺激缩足潜伏期并作为定量指标［6］。