红鳍东方鲀PPARγ真核基因表达载体构建及亚细胞定位研究

红鳍东方鲀PPARγ真核基因表达载体构建及亚细胞定位研究摘要[目的]旨在克隆红鳍东方鲀PPARγ基因的cDNA，并通过构建真核表达载体pCMV-3Tag-4A-PPARγ， 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 myc-PPARγ融合蛋白在大鼠L6细胞的表达及亚细胞定位。[方法]利用RT-PCR技术克隆红鳍东方鲀PPARγ基因的cDNA，构建pCMV-3Tag-4A-PPARγ重组质粒，转染至大鼠L6细胞，共聚焦显微镜下观察myc-PPARγ的亚细胞定位。[结果]红鳍东方鲀PPARγ基因cDNAORF全长1557bp，共编码518个氨基酸，pCMV-3Tag-4A-PPARγ融合蛋白在大鼠L6细胞核中表达，为深入探讨鱼类PPARγ生物学功能奠定了基础。Abstract[Objective]TheaimofthestudywastoclonecDNAofPPARγinTakifugurubripes，andanalyzedsubcellularlocalizationoftheexpressionproductthroughmycfusionprotein.[Method]ThecDNAofTakifugurubripesPPARγgenewasclonedbyRT-PCRandtherecombinanteukaryoticexpressionvectorspCMV-3Tag-4A-PPARγwereconstructedandusedforratL6cellstransfection.[Result]ThecDNAORFofPPARγhadalengthof1557bpencoding518aminoacids.ThepolyclonalantibodyagainstPPARγhadbeenpreparedsuccessfully；theconjugatedpmteinwasemcientlyexpressedinthecytoplasmofratL6cells.TheseresultshadagoodvalueforfurtherresearchofPPARγfunction.Key word word文档格式规范word作业纸小票打印word模板word简历模板免费word简历 sTakifugurubripes；PPARγgene；subcellularlocalization鱼类脂肪沉积呈高度物种特异性，例如河豚鱼、比目鱼的脂肪主要沉积在肝脏，其他物种如真鲷和鳗鱼的脂肪主要沉积在肝脏和骨骼肌[1]。不同的脂肪沉积部位可能是由组织特异性的脂肪代谢通路引起的[2]。脂肪代谢通路在分子水平主要是由一些重要的转录因子和酶进行调控，因此关于转录因子对鱼类脂肪代谢的调控机制是目前水产学研究的热点。过氧化物酶体激活增殖物受体（Peroxisomeproliferator-aetivatedreceptors，PPARs）是一类重要的核转录因子，分为3种亚型，分别是PPARα、PPARγ和PPARβ/δ[3]。PPARγ是动物体内脂肪代谢的生理传感器，在脂肪细胞分化中起到重要的作用，其主要生理学功能表现为促进脂肪细胞进行早期分化和正向调节脂肪代谢，同时还参与其他脂肪代谢基因表达的调控，从而导致细胞对脂肪酸和甘油三酯摄取的增加[4-6]。因此，从离体水平研究PPARγ对了解其生物学功能有特别重要的意义。目前，斑马鱼、大西洋鲑、虹鳟、鲻鱼、褐鲑鱼及草鱼等鱼类的cDNA已被克隆，而关于PPARγ基因的报道大部分局限于组织中的表达与其功能之间的关系[7-10]，PPARγ基因表达产物的亚细胞定位及其在真核生物中的功能在国内尚未见报道。因此，该试验通过克隆得到红鳍东方鲀PPARγ基因的cDNA并构建其融合表达载体，并进行亚细胞水平上的定位，为进一步研究该基因的在鱼类中的生物学功能奠定基础。1 材料 关于××同志的政审材料调查表环保先进个人材料国家普通话测试材料农民专业合作社注销四查四问剖析材料 与方法1.1试验材料该验用健康红鳍东方鲀体质量约为100g；RatL6细胞、E.coliJM109菌株、质粒pCMV-3Tag-4A由本实验室进行保存。1.2主要试剂SuperScriptⅢreversetranscriptase、lipofectamine2000均购自Invitrogen公司；pGEMT-easy载体、T4DNAligase购自Promega公司；BamHⅠ和XhoⅠ限制性内切酶、LATaqDNA聚合酶、TaqDNA聚合酶、AgroseGelDNApurification试剂盒均购自Takara公司；质粒小提试剂盒购（Sigma-Aldrich）；小鼠抗anti-myc单克隆抗体购自Sigma；alexafluor488anti-mouseIgG（H+L）二抗购自Molecularprobes；其他试剂均为分析纯。1.3PPARγORF的扩增及克隆利用ISOGEN抽取脂肪组织总RNA，以总RNA为 模板 个人简介word模板免费下载关于员工迟到处罚通告模板康奈尔office模板下载康奈尔 笔记本 模板 下载软件方案模板免费下载 ，利用SuperScriptⅢreversetranscriptase合成cDNA的第一链。同时，根据PPARγ（GenBank：AB275888.1）的基因序列，在ORF区两端 设计 领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计 引物（上游：5′-ATGGAGGACACCCAGCAGCTCCT-3′；下游：5′-TCAATACAAGTCCTTCATGATCTCC-3′），RT-PCR扩增反应条件如下：94℃变性40s，56℃退火40s，72℃延伸2min，35个循环，最后72℃充分延伸10min。将PCR产物与pGEMT-easy载体进行连接后转化至大肠杆菌JM109，然后进行筛选阳性克隆并进行菌落PCR鉴定，最后选取3个阳性克隆在ABI3100DNA测序仪上进行测序。1.4重组质粒pCMV-3Tag-4A-PPARγ的构建及鉴定根据克隆得到的红鳍东方鲀cDNAPPARγ的ORF序列，设计特异引物其中上下游引物分别带有BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点，Tr-PPARγ-PF：5′-GGATCCATGGAGGACACCCAGCAGCTCCT-3′；Tr-PPARγ-PR：5′-CTCGAGTCAATACAAGTCCTTCATGATCTCC-3′，以cDNA为模板扩增获得的PCR产物与pCMV-3Tag-4A质粒同时用BamHⅠ和XhoⅠ酶切3h后进行琼脂糖凝胶电泳并进行胶回收目的片段和载体，然后利用T4DNA连接酶过夜连接后转化到大肠杆菌JM109；随机挑选克隆，进行菌落PCR和双酶切鉴定，并对阳性克隆进行增菌培养抽提质粒，在ABI3100DNA测序仪对提取的重组质粒进一步测序验证。1.5重组质粒pCMV-3Tag-4A-PPARγ转染大鼠L6细胞利用脂质体lipofectamine2000进行基因转染。试验组为转染重组质粒pCMV-3Tag-4A-PPARγ；对照1组为转染pCMV-3Tag-4A。取生长状态良好的大鼠L6细胞在6孔板培养，至80%～90%细胞汇合度开始转染，转染48h后进行细胞间接免疫荧光检测。1.6间接免疫荧光检测及观察观察前，先除去细胞培养液，再用冷的PBS洗涤3次，每次5min；然后用4%多聚甲醛固定细胞0.5h，再用冰冷的PBS洗涤3次，每次5min；以0.1%Triton处理细胞20min，PBS洗涤3次，每次5min；10%正常血清室温封闭10min，anti-FLAGM2为一抗，进行4℃孵育过夜，PBS洗涤3次，每次5min；alexafluor488anti-mouseIgG（H+L）为二抗，37℃孵育1h，PBS洗涤3次，每次5min。封片后在共聚焦显微镜下观察结果并拍照。1.7红鳍东方鲀PPARγ蛋白亚细胞定位预测利用DNAStar软件中的Editseq程序和PSORTⅡProteinSortingPrediction软件（http：//psort.ims.u-tokyo.ac.jp/form2.htmL）分析红鳍东方鲀PPARγ蛋白的初级结构和亚细胞定位情况的预测。2结果与分析2.1目的基因的PCR扩增PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳分析，可见长度约1557bp的条带（图1），与预计结果相符。测序结果正确。2.2融合表达载体pCMV-3Tag-4A-PPARγ的鉴定将pCMV-3Tag-4A-PPARγ用限制性内切酶BamHⅠ和XhoⅠ进行双酶切鉴定。显示双酶切在1.56、4.20kb处有清晰条带（图2），与预期结果相符，说明pCMV-3Tag-4A-PPARγ表达载体构建正确。2.3间接免疫荧光细胞转染48h后，采用间接免疫荧光方法进行封片处理后，将其置于共聚焦显微镜下观察，试验组转染重组质粒pCMV-3Tag-4A-PPARγ的L6细胞可以在细胞内观察到绿色荧光，而且荧光分布于细胞核；对照转染pCMV-3Tag-4A的细胞，绿色荧光分布整个细胞（图3）。2.4PPARγ蛋白的初级结构及其亚细胞定位通过对红鳍东方鲀PPARγ蛋白的初级结构进行分析，结果表明该蛋白由518个氨基酸组成，分子量为58.72ku，理论等电点为6.29；亚细胞定位分析结果显示目的蛋白主要定位在细胞核中（表1）。3讨论研究发现，PPARγ是一个参与调控脂肪细胞的分化与脂肪代谢非常重要的转录因子，其主要正向调节调控脂肪细胞的分化从其表达水平也逐渐升高，成熟期的表达水平达到最高[11]。在哺乳动物中PPAR？觔基因有4个分型，不同分型的PPAR？觔在组织中的分布有较大的不同。PPAR？觔1主要分布在肝脏、胃肠道、脂肪、心脏、肾脏等组织；PPAR？觔2主要分布在脂肪组织、大肠、视网膜及脾脏等，PPAR？觔3在结肠上皮细胞及脂肪细胞中均表达；PPAR？觔4的表达水平的研究甚少[12-14]。PPARs在哺乳动物的的研究较多，而关于鱼类PPARs的研究上起步较晚。鱼类的PPAR？觔基因在1997年首次被克隆出来。目前，对鱼类PPAR？觔基因的研究主要是组织中的表达特性与其功能之间关系等。Cho等[15]克隆出了褐牙鲆的PPARγ基因的cDNA全序列，其长为1667bp，荧光定量PCR检测结果发现在饥饿状态下，PPARγ基因在肠道、鳃、胃、肝脏、肾脏、皮肤及脾脏中均有所表达，其中脾脏及皮肤中的表达量最高。Tsai等[16]克隆出了军曹鱼的PPARγ基因，研究发现PPARγ在所有组织中均有所表达，其中在内脏脂肪中表达量最高。He等[10]克隆出了草鱼的PPARγ基因，与鲤鱼、斑马鱼的PPARγ基因同源性分别为96.1%、92.2%，这说明基因在进化过程中比较保守。另外，草鱼的PPARγ基因在肝脏中的表达量较高，在其他组织中表达量较少。[12]BRAISSANTO，FOUFELLEF，SCOTTOC，etal.Differentialexpressionofperoxisomeproliferator-activatedreceptors（PPARs）：tissuedistribu-tionofPPAR-alpha，-beta，and-gammaintheadultrat[J].Endocrinology，1996，137（1）：354-366.[13]PALMERNA，HSUMH，GRIFFINKJ，etal.Peroxisomeproliferatorsactivatedreceptor-alphaexpressioninhumanliver[J].MolPharmacol，1998，53（1）：14-22.[14]BISCETTIF，STRAFACEG，PITOCCOD，etal.Peroxisomeproliferator-activatedreceptorsandangiogenesis[J].NutrMetabCardiovas，2009（19）：751-759.[15]CHOHK，KONGHJ，NAMBH，etal.Molecularcloningandcharacte-rizationofoliveflounder（Paralichthysolivaceus）peroxisomeproliferator-activatexlreceptorγ[J].GenCompEndocr，2009，163（3）：251-258.[16]TSAIML，CHENHY，TSENGMC，etal.Cloningofperoxisomepro-liferatorsactivatedreceptorsinthecobia（Rachycentroncanadum）andtheirexpressionatdifferentlife-cyclestagesundercageaquaculture[J].Gene，2008，425（1-2）：69-78.