【doc】青枯菌的分离和鉴定
青枯菌的分离和鉴定
f『,f音枉和嗣G岛
l996年第l期国外农学一油料作物?51?
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青枯菌的分离和鉴定一
V-Mcllan缸
受侵染萎蔫植株样品的搜集l?肼JVI<青};l;0
应当选择发病症状明显且感病早的4立刚半选抒培养可以集中橙查土壤中的 株.取样时间应在侵染的早期即在再侵染(l】青枯阳测定土壤陴中自青枯菌有几种简
菌庄腐烂组织中定殖)之前.建议IJ~fu2取降可他的方法是适台的:这些疗法帮助计算培养
适当分点搜集病株.将样本放在纸袋中.并在群体或者总滞体.在一个台适的培养基上.茁
标整上标明搜集日期和地点以及其它有刖的落鹾出后可汁贸:培养群体.这些方法采用
资料.例如寄主品种.生育时期等.取样和样在适当的培养丛上连续稀释样品.因此取样
品处理之间的时间应当尽量缩短.因此.取样汁划对于这些程序的效率是很重噩的.
以前的试验室准备工作很重要.有儿种非选择性培养基适于青枯苗的分 青枯菌的分离离和生长.它们是SAP培养基.king氏培养
从萎蔫檀株受侵染的茎或根上分离青枯基B(KMB)和TZCA培养基.这些培养基的
菌可通过下列步骤进行:
配方
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和菌搭性状如下:
1.把受侵染植株的茎或根切成3,4em表1青枯菌在三种非选择性琼脂培养 长的小段.基上的菌落表现(30=C条件下培养18~72小
2.用无菌水将样品冲洗干净.然后Hl无时)' 菌纸吸干水分.
3.将茎或根的小段分别放入盛有5ml 无菌蒸馏水的试管中一会儿之后,就可以看 见细菌从切口处渗出.
4.3,5分钟后取一接种环细菌悬洋液 在适当的培养基(倒如SPA培养基和FZCA 培养基)上划线接种,然后将培养皿放在28 ,
30?的条件下培养.
5.培养48~72小时后观察细菌的荫落. 注意:用三线法展易产生单个苗落.细菌 悬浮液的小滴置于培养皿上.接种环剐过后 要f次消毒,通过接种培养基使接种环冷却. 在培养基的表面划三条交叉线,以避开起初 的按种物.重复灭菌,冷却,划线接种这一顺 序,.将得到一系列稀释的接种体. 在"VZCA培养基上,有毒的菌落呈不规 则圆形,液体状乳白邑,其中心粉红邑.无毒 的菌落呈圆形,奶汕状,均匀的深红色. 培养培养特征
SPA乳白包删形落
KMn白包椎拌慷圮莨光悄落
TZ(TA白色戒H苗落斗『.呈粉红色 7.4.
蔗糖班白~14:.gJJb培养基配方(SPA) 成分g,L
蔗挺20
白胨5
K2HPJ0.5
MgSO:?7H200.2.5 琼脂l5
用的氢氧化钠调节pH值到7.2, King氏培养基B(KMB)配方
成分g/L
朊蛋白胨20
K?HP1.5
国外农学一油料作柏1996午第1期 M苎sUJ?7H【,0
甘油10
璩脂15
用0的氢氧化钠节DHfE--7.2. 氯化四氯I唑琼J3uh-养基(1ZCA)疗 成分g/L
蛋白胨10
水解醅朊1
葡萄糖5
荆]5
2.3.5一氯化三苯基四氯I唑0.05 注意:每100m【培养基加入过滤毒的 0.5FZCA溶液lm1.灭菌融化的培养基 6O?倒入培养皿前加入TZC. FZCA用于青枯苗的一般性生长和分离 培养基.它适合用来区分野生菌落型(白色带 有粉红中心)与低毒性突变菌落或非毒性突 变菌落.这些菌落可能在再次培养中产生.并 且,它们通常会在吸收四氯唑还原时形成 fol"mi~en过程中形成深红邑菌落.
选择性培养基
已经发展了几刊]分离青枯菌的选择性培 养基(Nesmith和Jenkins.1979;Kargani[1a和 Buddenhagen.1972;Granada和Scqueria, 1983).这些培养基可以测定每克土壤中10 个细苗,某些培养基仅适合于检;Il!lJ某个株系. 一
般来说.这些培养基对于青桔菌的生态学 和流行学研究是有用的.这些培养基增加了 分离效率.且减少了腐生土壤微生物的干扰. 也可将这些培养基与非选择性培养基相结台 进行诊断.
其它捡测试验
根据专化性抗原——抗体反应+血清试 验也能用于测定受侵染的植株组织和子中 的细菌.在各种血清试验中,点免疫(DIBA), 叫I'l1反应(ELISA),免疫电髓(ISEM)最 适合于测定量ll】诺lELISA更受欢迎.由于 ISEM需川电予提做镜检州.困此不适台处理 犬自洋术日4收JffL精反应(ELISA)是阻清 试验中最川自方法.在发腱中国家.采用 D?^比ELISA测定的大.围为则试所 需璎的捌料柙试剂不易得到.DNA珍断也可 以I?]于谊值怫组织内的青帖苗.但目前发 展中国家应HJ该方法非常有限.
近儿年来,一些简单,灵敏,高度专化的 髓青枯菌的ELISA方法已经建立起来.这 些测定方浊不需要对细菌进行纯化和培养. 这些方法H=常觇测定方法更快速,更灵敏,理
独立.晨美国的夏威夷大学
实验室
17025实验室iso17025实验室认可实验室检查项目微生物实验室标识重点实验室计划
,英国的洛 桑试验站和中国农科院植保所及秘售的国 际马铃薯中心等位一一些青枯菌的多克隆 和单克隆抗体已经制成这些抗体的大部分 都与一些亲缘关系较近的细菌种有交叉反 应.『旦在夏威夷大学和洛桑试验站获得的某 些高度专化的单克隧抗体与细菌种并不表现 交叉反虚.
Ef前.由于丽联lm_清反应(ELISA)方法 简单,灵敏,快速.并且能够测定位株组织和 其它质中的病原苗的量.冈此酶联血清反 应正在应刚于青桔菌的测定.它与经典的血 清试验(例如OchterlonydouNediffusiontest)
是不同的.后青采用了免疫沉淀反应.免疫专 化性的识驯是通过标记酶与合适的底物反 应.而不是观测非觉溶性抗原一抗体复合物 的形成.
译自:C-a-枯苗诊断技术和花生青枯病抗 性筛选~1995.23~26
译者:苗华荣邵战功李正超
校者:赵廷昌
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