对动物组织DNA提取方法的改进及PCR检测

第32卷第3期浙江师范大学学报(自然科学版)Vol.32,No.32009年9月　　　　　　JournalofZhejiangNormalUniversity(Nat.Sci.)　　　　　　Sep.2009　　文章编号:100125051(2009)0320317205对动物组织DNA提取 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 的改进及PCR检测3鲍毅新,　孙　波,　张龙龙,　赵庆洋(浙江师范大学生态研究所,浙江金华　321004)摘　要:以小型哺乳动物社鼠为例,通过调整酚与氯仿的比率、减少抽提次数及消化时间,对采用-70℃超低温冰箱、-20℃低温冰箱、70%乙醇液浸泡、95%乙醇液浸泡和含50mmol/L乙二胺四乙酸二钠的70%乙醇液浸泡等不同方法保存的社鼠肌肉组织提取基因组DNA,并对其进行微卫星指纹图谱分析,研究了改进方法对不同方法保存的社鼠肌肉组织提取DNA的效果,并比较了不同保存方法对DNA提取效果的影响.结果表明:改进方法可行,完全可以满足微卫星等分子标记技术的需要.关键词:社鼠;DNA提取;聚合酶链反应;动物组织;样品保存中图分类号:Q9523　　　　文献标识码:ATheimprovementformethodofDNAextractionfromanimaltissueandPCRdetectionBAOYixin,　SUNBo,　ZHANGLonglong,　ZHAOQingyang(InstituteofEcology,ZhejiangNormalUniversity,JinhuaZhejiang　321004,China)Abstract:ItwasusedthetissueofNiviventerconfucianusbydifferentpreservingmethodtoextractDNA,throughadjustingtheratioofphenolandchloroform,reducingextractionanddigestiontime.Thetissuewerepreservedindifferentwayincluding-70℃refrigeration,-20℃refrigeration,70%alcoholsoak,95%al2coholsoakand70%alcoholsoakwith50mmol/LEDTA.Microsatellitefingerprintwasusedtodetecttheex2tractedgenomeDNAinordertostudytheDNAextractioneffectfromthemuscletissuewithdifferentpreservedwayusingimprovedmethod.Itwasapprovedthattheimprovementtechniquewasfeasibleandeffective.Thismethodcouldbeusedwithmicrosatelliteandothermolecularmarker.Keywords:Niviventerconfucianus;DNAextraction;PCR;animaltissue;sampleconservation自20世纪50年代Watson和Crick提出DNA双螺旋模型以来,分子生物学技术得到了空前的发展.随着聚合酶链反应(PCR)技术的日趋成熟和完善,限制性片段长度多态法(RFLP)、随机扩增多态3收文日期:2008212205;修订日期:2009204203　基金项目:浙江省自然科学基金资助项目(Y507080)　作者简介:鲍毅新(1958-),男,浙江建德人,教授,硕士.研究方向:动物生态学.DNA(RAPD)、微卫星(SSR)、扩增片段长度多态法(AFLP)等各种分子标记(molecularmarker)技术如雨后春笋般地发展起来.这些分子标记技术在生态学、保护生物学以及遗传育种、基因图谱的构建、品种鉴定、生物遗传多样性等方面的研究中得到了广泛的应用[126].以PCR技术为核心的分子标记,无论采用哪种分子标记技术,都必须提取纯化结构完整的DNA.就目前应用较为广泛的DNA提取方法而言,高盐法提取DNA虽然简便、快速,但所提取的DNA纯度及稳定性较差,影响后期的聚合酶链反应;经典的酚2氯仿抽提法则由于消化时间长及抽提步骤繁琐,影响实验的进程.因此,有必要在动物组织DNA提取方法上进行改进.笔者以小型哺乳动物社鼠(Niviventerconfucianus)为例,参考文献[7]的方法,对经典的酚2氯仿抽提方法进行了改进,通过调整酚与氯仿的比率、减少抽提次数及消化时间,对采用-70℃超低温冰箱、-20℃低温冰箱、70%乙醇液浸泡、95%乙醇液浸泡和含50mmol/L乙二胺四乙酸二钠(EDTA)的70%乙醇液浸泡等不同方法保存的社鼠肌肉组织提取基因组DNA,将所提取的基因组DNA进行微卫星指纹图谱分析,探讨了改进方法对不同方法保存的社鼠肌肉组织进行DNA提取的效果及影响.1　材料和方法1.1　动物标本及处理笼捕社鼠5只,带回实验室处死,迅速取腿部肌肉组织分成5份,2份装入样品袋,分别置于-20℃和-70℃冰箱中保存;3份分别置于盛有约100mL95%乙醇溶液、70%乙醇溶液和含50mmol/LEDTA的70%乙醇溶液的小口塑料瓶中固定.样品保存2个月,用于模版DNA的提取.动物解剖在无菌操作台上进行,用于解剖不同个体的解剖器具严格分开和清洗,防止交叉污染.1.2　试剂细胞裂解液(10mmol/LTris2HCl(pH8.0),100mmol/LNa2EDTA(pH8.0),5g/L十二烷基硫酸钠(SDS)),核糖核酸酶A(RNaseA,60U/mg),蛋白酶K溶液(20mg/mL),Tris2饱和酚,氯仿2异戊醇(体积比24∶1),TE(10mmol/LTris2HCl(pH8.0),1mmol/LNa2EDTA(pH8.0))和灭菌双蒸水(ddH2O).1.3　肌肉组织DNA提取取固定剂固定肌肉样品,用灭菌ddH2O清洗样品表面3次,滤纸吸干表面水分.取肌肉组织150～200mg,切碎,转移至1.5mL离心管中(每份样品取2份),然后加入800μLDNA提取液(提取液预热,以抑制脱氧核糖核酸酶(DNase)的活性,加速蛋白变性,促进DNA溶解)和6.5μL蛋白酶K溶液,置于旋涡振荡器上混匀后,55℃水浴下消化约4h,不时轻摇混匀,直至溶液透明,4℃6000r/min离心8min;取上清液800μL置另一离心管中,加入1μLRNaseA溶液,混匀,37℃水浴40min,冷却至室温,加入700μLTris2饱和酚、100μL氯仿2异戊醇(体积比24∶1),混匀仪上混匀15min,4℃10800r/min离心12min;取上清液650μL置另一离心管中,加入650μL氯仿2异戊醇(体积比24∶1),混匀仪上混匀15min,4℃10800r/min离心12min;转移上清液450μL至新离心管中,加入900μL预冷的无水乙醇,-20℃沉淀DNA1～2h,4℃12000r/min离心15min;弃上清液,70%乙醇溶液400μL洗涤沉淀3次(倒掉液体后再短暂离心,将残液用移液器吸出),干燥DNA,溶于150μLTE中.1.4　DNA质量检测将样品稀释50倍,以TE做空白对照,分别在260nm、280nm波长处用紫外可见分光光度计测定DNA稀释液的吸光度值,计算DNA的含量.通过1%琼脂糖凝胶电泳检测提取的总DNA片断大小及DNA的降解情况.对提取的总DNA利用微卫星引物进行PCR扩增,检测DNA扩增情况.813浙江师范大学学报(自然科学版)　　　　　　　　　　　　　　　　2009年　1.5　PCR扩增1.5.1　微卫星位点的选择选取4对筛选自大、小鼠适用于社鼠的微卫星引物(待发表),由上海生工生物工程技术服务有限公司进行引物合成.引物相关信息如下:ACPH引物序列:上游5′2CCAATGCTTGTGACAATATCC23′,下游5′2CATTTCTGAAACGTTGTTTCCTC23′,片段长度110～140bp.PKC引物序列:上游5′2AGAACCCTTCACTGCTCACC23′,下游5′2AGAAAGTCCCAGAAAGTGGC23′,片段长度140bp.D11Mit2引物序列:上游5′2TCCCAGAGGTCTCCAAGACA23′,下游5′2CCACAGTGTGTGATGTCTTC23′,片段长度110～140bp.D9Mit23引物序列:上游5′2AAGAAGTTTCCATGACATCATGAA23′,下游5′2AGAAGAAAATTCTTGACAGCTCTG23′,片段长度210～320bp.1.5.2　PCR扩增体系PCR体系为:10×buffer(分为含Mg2+1.0,1.5和2.0mmol/L3种buffer)2.5μL、三磷酸脱氧核糖核苷(dNTP)溶液(2.5mmol/L)1.5μL、上游和下游引物溶液(10μmol/L)各0.4μL、样品DNA溶液1μL、Taq酶溶液(5U/μL)0.2μL,加水至25μL.扩增程序为:94℃预变性5min;94℃变性30s;退火温度分别为53.7℃(ACPH),58℃(PKC),56℃(D11Mit2)和53.7℃(D9Mit23),72℃延伸40s,35个循环,72℃延伸10min.扩增产物经过1%琼脂糖凝胶电泳、溴化乙锭(EB)染色,检测微卫星引物对所提取社鼠DNA扩增的结果.2　结果与分析2.1　DNA电泳结果经紫外可见分光光度计检测,所提取不同保存方法的肌肉组织DNA的吸光度值260nm/280nm为1.7～1.8,所提取的DNA纯度较好,电泳结束后在点样孔附近都有单一的高分子量条带(见图1).M:DL2000Marker,100～2000bp;1-2:-70℃冰箱保存;3-4:-20℃冰箱保存;5-6:70%乙醇液保存;7-8:95%乙醇液保存;9-10:含50mmol/LEDTA的70%乙醇液保存;11-12:新鲜组织;13:阴性对照图1　不同保存方法提取DNA的电泳结果913　第3期　　　　　　　　　　鲍毅新,等:对动物组织DNA提取方法的改进及PCR检测琼脂糖凝胶电泳检测结果显示:-20℃低温冰箱、70%乙醇液保存的样品提取的DNA稍有拖带现象出现,但不明显,DNA条带的亮度相对于其他保存方法的样品较弱;含50mmol/LEDTA的70%乙醇液、95%乙醇液处理的样品没有拖带出现,电泳条带相对较亮,点样孔10内出现亮团,说明稍有蛋白质等大分子残留,可能提取过程中DNA清洗不完全所致;-70℃超低温冰箱保存的样品,无论在条带的完整性上、还是条带的亮度上都与新鲜样品保持一致,可见-70℃超低温冰箱保存样品对样品DNA的影响最小.总体上,5种保存方法保存的社鼠肌肉组织通过改进方法提取DNA,条带都较完整,亮度也适中,虽部分样品提取的DNA稍有涂带和点样孔残留,应为实验操作所致,对于实验整体影响不大,改进方法提取的DNA理想.其中,含50mmol/LEDTA的70%乙醇液、95%乙醇液为固定剂保存的肌肉组织,提取的DNA条带的亮度、完整性明显高于-20℃低温冰箱、70%乙醇液保存的样品,可以看出,这2种方法能更好地抑制DNase对DNA的降解,达到较好的保存效果,为野外采样保存样品的首选.2.2　PCR扩增及检测4对微卫星引物对提取的DNA进行扩增,所有被扩增出的DNA都出现理想的条带(见图2),表明改进方法适合于不同保存方法保存的动物肌肉组织DNA的提取,完全可以满足进一步研究的需求.M:DL2000Marker,100～2000bp;1-6:引物PKC;7-12:引物D11Mit2;13-18:引物ACPH;19-24:引物D9Mit23.每一引物自左至右依次为:-20℃冰箱,95%乙醇液,70%乙醇液,含50mmol/LEDTA的70%乙醇液,-70℃冰箱保存和新鲜组织图2　4对微卫星引物对提取DNA扩增的电泳图谱3　讨　论建立在PCR基础上的分子标记技术,在核酸和蛋白质水平上阐明生命系统与环境系统的相互作用规律[8],能以微观的视角解释其他方法技术现在无法解决的问题.但由于PCR扩增对 模板 个人简介word模板免费下载关于员工迟到处罚通告模板康奈尔office模板下载康奈尔 笔记本 模板 下载软件方案模板免费下载 DNA的质量要求较高,DNA质量是影响分子实验结果的关键因素之一,因此,能否获得高分子量的DNA对实验的成败至关重要[9,10].经典的酚2氯仿抽提是实验室最常用的提取DNA的方法,但由于酚类物质具有高度腐蚀性,易引起严重的烧伤,故在涉及酚的所有实验操作中实验者往往须采取一定的防护 措施 《全国民用建筑工程设计技术措施》规划•建筑•景观全国民用建筑工程设计技术措施》规划•建筑•景观软件质量保证措施下载工地伤害及预防措施下载关于贯彻落实的具体措施 ;并且实验使用的酚为商品酚,易被氧化产生酚的氧化物如醌、二酸等,可破坏核酸的二酯键,并引起DNA链的交联.本研究针对经典酚2氯仿抽提中存在的诸多问题进行了部分修改.酚的变性作用大,但酚与水相有一定程度的互溶,酚抽提时会有部分DNA被带走;氯仿的变性作用不如酚效果好,但氯仿与水不相混溶,不会带走DNA.将酚与氯仿以适当比例混合,利用酚与氯仿之间互溶的特点,可减少DNA的损失,最后用氯仿2异戊醇(体积比24∶1)第2次变性蛋白质,并将残存的酚带走.实验过程操作步骤少,缩短了提取过程,减少了反复抽提对DNA的破坏及损失,保证了所提DNA的完整性和纯度.023浙江师范大学学报(自然科学版)　　　　　　　　　　　　　　　　2009年　很多实验涉及到野外采集动物组织样品,由于野外标本采集和运输过程中基本上没有冷冻保存的条件,为更好地保存好动物组织标本,为实验室研究提供优质DNA模板材料,就需要一种简便的保存方法.乙醇作为常用的固定剂,能迅速地渗透进入组织细胞,凝固蛋白质,使多种水解酶失活而不损伤DNA,从而达到保存DNA的目的.研究表明,DNA在乙醇中可保存较长的时间,说明乙醇对DNA没有或仅有较弱的降解作用[11,12];并且,以乙醇为固定剂保存的样品提取的DNA质量好[13,14].因此,乙醇被广泛应用于样品的保存.EDTA能够螯合Mg2+、Ca2+等金属离子,抑制脱氧核糖核酸酶对DNA的降解作用(DNase作用需要一定的金属离子做辅基),在70%乙醇液中加入适量的EDTA,可以迅速抑制DNA酶的活性,进一步减少DNA的降解[2].从本实验结果来看,不同含量的乙醇溶液为固定剂时,含50mmol/LEDTA的70%乙醇液与95%乙醇液效果相当,而70%乙醇液效果较差,但由于含50mmol/LEDTA的70%乙醇液需要配制,携带及使用不如95%乙醇液方便,并且以95%乙醇液为固定剂保存的动物组织可得到高质量的DNA,PCR检测效果也很好,因此,以95%乙醇液固定动物组织是野外取样的最佳保存方法.实验室内样品的保存,常规的方法是将样品放置在-20℃低温冰箱中.由本实验结果可以看出,-20℃低温冰箱对于样品的保存能力较差,仅可用于短时间内样品的存放,长时间样品的存放最好在-70℃超低温冰箱内.改进方法提取上述5种保存方法保存的肌肉组织DNA,经琼脂糖凝胶电泳,在点样孔附近都有单一的高分子量条带,提取效果总体较好;4对微卫星引物对提取的DNA进行扩增,所有被扩增的DNA都出现理想的条带.总体来说,改进方法所提取的不同保存方法保存的社鼠肌肉组织总DNA完全可以满足微卫星等相关分子标记实验的需要,是一种切实可行的方法.参考文献:[1]徐莉,赵桂仿.微卫星DNA标记技术及其在遗传多样性研究中的应用[J].西北植物学报,2002,22(3):7142722.[2]王义权,周开亚,徐珞珊,等.不同固定剂保存动物组织标本对RAPD反应的影响[J].动物学杂志,1999,34(1):33237.[3]TibayrencM,NeubauerK,BarnabeC,etal.Geneticcharacterizationofsixparasiticprotozoa:paritybetweenrandom2primerDNAtypingandmultilocusenzymeelectorphoresis[J].ProcNatlAcadSciUSA,1993,90(4):133521339.[4]PanYuxin,MaJun,ZhangGuiyin,etal.cDNA2AFLPprofilingforthefiberdevelopmentstageofsecondarycellwallsynthesisandtranscriptomemappingincotton[J].ChineseScienceBulletin,2007,52(17):235822364.[5]杨凯,宋婉,张春庆,等.荧光标记DNA扩增片段长度多态性方法的改进[J].生物化学与生物物理进展,2001,28(2):2562258.[6]LingYan,LuWeifeng,LuFan,etal.PCR2RFLPandAP2PCRofrbcLandITSofrDNAShowThat×Taxodiomeriapeizhongii(Taxodium×Cryptomeria)IsnotanIntergenericHybrid[J].JournalofIntegrativePlantBiology,2006,48(4):4682472.[7]萨姆布鲁克J,弗里奇EF,曼尼阿蒂斯T.分子克隆实验 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