磺胺二甲嘧啶及有关物质HPLC检测方法验证

第27卷 第4期 2008年4月 分析测试学报 FENXI CESH[XUEBAO(Journal of Instrumental Analysis) Vo1．27 No．4 430—433 磺胺二甲嘧啶及有关物质 H PLC检测方法验证 滕久委 ，方 军，李德 良 (中国广州分析测试中心 广东省化学危害应急检测技术重点实验室，广东 广州 510070) 摘 要：建立了磺胺二甲嘧啶及其可能存在的 5种杂质成分：对氨基苯磺酸、4，6一二甲基一2一羧基嘧啶、磺胺 脒、磺胺和2一氨基4，6-S_t0基嘧啶的高效液相色谱分离和定量分析方法。采用C。 色谱柱，pH 4．0的乙腈 一 醋酸(体积比1：9)流动相，分离有关杂质，而水一乙腈 一冰醋酸(体积比87：12：1)流动相用于主成分磺 胺二甲嘧啶(SM2)含量的测定；二极管阵列检测器，检测波长275 nln。上述5种杂质的检出限分别为0．023、 0．023、0．009、0．009、0．030 mg／I ，满足测定要求。 关键词：方法验证；高效液相色谱；磺胺二甲基嘧啶；杂质 中图分类号：0657．72；TQ468．1 文献标识码 ：A 文章编号：1004—4957(2008)04—0430—04 Validation of a High Performance Liquid Chromatographic Method for the Determination of Sulfadimidine and Its Related Substances TENG Jiu．wei，FANG Jun，LI De—liang (Guangdong Provincial Key Laboratory of Emergency Test for Dangerous Chemicals， China National Analytical Center，Guangzhou 510070，China) Abstract：A high performance liquid chromatographic method with UV detection for the determination of sulfadimidine(SM2)and five related substances，namely P—aminobenzenesulfonic acid(SA1)， 4，6一dimethyl一2一hydroxylpyrimidine(SA2)，sulfaguanidine(SA3)，sulfanilamide(SA4)and 2一amino． 4，6一dimethylpyrimidine(SA5)were developed and validated．The separation of sulfadimidine and the five related substances were performed on a Phenomenex Luna ”C 18(4．6 mm X 250 mm，5 m)col— Hmn．A mixture of acetonitrile and 0．025 mol／L acetic acid(1：9．by volume)at pH 4．0 was used as mobile phase for the five related substances，while a mixture of deionized water，acetonitrile，and acetic acid(87：1 2：1．by volume)was used for the main component--sulfadimidine．A diode ar— ray detector was used for the detection at 275 nm．The detection 1imits for SA 1．SA2， SA3． SA4 and SA5 were 0．023，0．023，0．009，0．009，0．030 mg·L～ ，respectively． Key words：method validation；HPLC；sulfadimidine；impurity 中国是世界上的头号原料药(医药活性物，active pharmaceutical ingredient，API)生产国。但是目前 中国的API销售主要是国内市场和利润较低的世界非 规范 编程规范下载gsp规范下载钢格栅规范下载警徽规范下载建设厅规范下载 市场。要进入规范的欧美等市场，API生产 商必须按规定向客户提供DMF(drug master file)文件、国际GMP达标及其它证书和文件。原料药及其 有关物质检测方法的验证通常是其中必须的文件之一。 磺胺二甲嘧啶(简称 SM2)是一种短效磺胺类抗菌药物，临床用于流脑及一般感染，目前普遍用作 饲养鸡和猪等动物的饲料添加剂。SM2在酸性条件下可分解为对氨基苯磺酸(SAI)，4，6．二甲基．2．羟 基一嘧啶(SA2)，2一氨基4，6一二甲基嘧啶(SA5)。SM2产品中可能存在的杂质还有磺胺脒(SA3)或对．氨 基苯磺酰胺(磺胺，SA4)。 何玲玲等 利用两种展开剂，双向展开薄层色谱法检测了磺胺二甲嘧啶中SAI～SA5和对氨基酚 6 种杂质。但薄层色谱法检测有关物质时很难对药品质量做出准确的评价，已不能满足药物质量控制的 要求 。高效液相色谱已广泛用于药物及其有关物质的分析 J，也已应用于磺胺类药物残留的检 测。。 ，但至今未见对磺胺二甲嘧啶有关物质测定的报道。本文利用高效液相色谱方法简便快速地对 磺胺二甲嘧啶及其可能存在的5种杂质进行了分离和测定。 收稿日期：2007—04—13；修回日期：2007—06—07 基金项目：广东省自然科学基金资助项目(5000565) 第一作者：滕久委(1962一)，男，湖南怀化人，研究员，博士，Tel：020—37656307，E—mail：jt2000w@yahoo．com 维普资讯 http://www.cqvip.com 第4期 滕久委等：磺胺二甲嘧啶及有关物质 HPLC检测方法验证 43l 1 实验部分 1．1 仪器与试剂 高效液相色谱仪：Agilent 1100系列，配有G1315A二极管阵列检测器(DAD)；色谱柱：Phenomenex Luna C18(2) 4．6 mm×250 mm，5 m，10 nm；流速：1．0 mL／min；进样体积：10 ；温度：25℃。 对氨基苯磺酸(p-aminobenzenesulfonic acid)，代码 SA1，批号：990801，北京市西中化工厂；4，6． 二甲基．2．羟基嘧啶(4，6-dimethyl-2．hydr0xylpyrimi(1ine)，代码 SA2，批号：900360000，东京化成工业； 磺胺脒(sulfaguanidine)，代码 SA3，批号：lot n．1，欧洲药典对照品；磺胺(sulfanilamide)，代码 SA4， 批号：lot n．1，欧洲药典对照品；2．氨基4，6一二甲基嘧啶(2-amino4，6．dimethylpyrimi(1ine)，代码 SA5， 批号：10359100，美国进口对照品；磺胺二甲嘧啶(sulfamethazine，sulfadimidine)，代码 SM2，USP对 照 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 品(LOT G一3 CAT No．62900)。磺胺二甲嘧啶样品(Sample SM2)，Batch No．250601015，由广 东某药厂生产并提供。乙腈为色谱纯，韩国 Burdick&Jackson产品。冰醋酸、氢氧化钠及其它试剂均 为分析纯，购自广州化学试剂厂。磺胺二甲嘧啶及有关物质的化学结构式见图1。 O％s／ ／O H( ~ i．N CHs NH 2 H N c id(SA1) I 热A2) suH嘲 (SA3) ilamide(sA4) 图 1 磺胺二甲嘧啶及有关物质的化学结构式 Fig．1 Structures of sulfadimidine and its related substances ．． 乏 1．2 实验方法 本方法使用两种流动相。流动相 MP1用于有关杂质的测定：乙腈一0．025 mol·L。。冰醋酸(体积比 10：90)，用 1 mol·L 的 NaOH溶液调 pH至 4．0；流动相 MP2用于主成分 SM2含量的测定：水 一乙 腈 一冰醋酸(体积比 87：12：1)。 磺胺二甲嘧啶标准溶液的配制：精确称量 0．100 0 g经 105℃干燥后的磺胺二甲嘧啶对照标准品 (SM2)，置 100 mL容量瓶中，加乙腈 10 mL、1 mol·L NaOH 1 mL和水30 mL，超声处理使其溶解 ， 用水稀释至刻度，制成质量浓度为 1 g／L的标准溶液，在 4℃冰箱中避光保存。其它浓度的 SM2标准 溶液均由上述标准溶液以相应的流动相稀释而成。 取磺胺二甲嘧啶样品(Sample SM2)，按照上述相同方法配制磺胺二甲嘧啶供试液。 磺胺二甲嘧啶有关物质对照溶液的配制：分别取 SA1、SA2、SA3、SA4、SA5对照品各 100 mg， 按上述方法配制。 进样体积 10 。3次连续重复检测，取平均值。保 。 留时间定性，峰面积通过标准曲线定量。 。 2 结果与讨论 。 2．1 检测波长的选择 通过对 1 mg／L的 SM2标准溶液及有关物质对照溶 液的分析，得到它们在紫外区(190～400 nm)的最大吸收 波长 ：SM2 240和 265 nm，SA1 200和 250 nm，SA2 215 和 295 nm，SA3 200和 260 nm，SA4 200和 260 nm，SA5 220和 295 nm。本研究选择 275 nm为检测波长，可兼顾 SM2和 SA1～SA5的检测灵敏度，见图2。 2．2 流动相的选择 流动相 MP1用于 SM2有关物质 SA1～SA5的分离和 检测时，主要色谱性能参数能充分满足要求，其中对称 l 6 1 2 5 l J I ⋯ L f／ITIl12 图2 SM2和有关物质在波长 A=275 Bin 时的色谱图 Fig．2 Chromatogram of SM2 and its related substances at 275 Bin SA1一SA5：5．0 mg·L～ ，SM2：500 mg·I 一 ； mobile phase MP1；peak：1．SA1，2．SA2， 3．SA3，4．SA4，5．SA5，6．SM2 一 N m n k n L1 1^ f 2 维普资讯 http://www.cqvip.com 432 分析测试学报 第27卷 性大于0．75，塔板数大于】0 000，分辨率大于 1．5，选择性大于1．1，SA1一SA5的保留时间在2．6—6．8 rain之间，而 SM2在31 rain左右洗脱，见图2。参照 USP29磺胺嘧啶含量测定的方法，选择流动相 MP2用于SM2含量的检测，保留时间在 19 rain左右。使用流动相 MP2，SA1一SA5不能有效地分离， 因此不适合用于它们的测定。本方法采用等度洗脱。 2．3 准确度 SA1一SA5的检测准确度通过在500 mg／L的SM2供试溶液中加入不同浓度(0．25、0．50、1．00 mg／L) 的相应的对照溶液的回收率结果来验证，见表 1。表中的杂质浓度以其相对于主成分的质量分数来表 示。通过对已知浓度 SM2标准溶液(20．0、80．0、100．0、125．0 mg／L)的检测，计算得 SM2回收率为 95．O％ 一99．6％ ，RSD 0．2％ ～4．4％ 。 表 l 样品加入不同浓度有关物质的回收率(n=6) Table 1 Recovery results of SA1一SA5f n=6) $0．10％ and 0．050％ arethethreshold valuesf0rimpurityidentification and report，respectively set by FDA(0 10％和0．050％分别为 FDA 规定杂质需鉴定和报告的 值) 2．4 精密度 方法的精密度由重复性、对同一对照品连续重复检测的相对标准偏差(RSD)和批间精密度、相同 浓度对照品不同时间检测的相对标准偏差(RSD)来表达。主要成分 SM2及 SA1一SA5的定量分析精密 度分别列于表 2中。从表 2可以看出，重复性小于0．5％，批问精密度小于 15％。 表 2 SM2及 SA1～SA5的定量分析的精密度(n=3) Table 2 Precision of quantitative analysis of SM2 and SA1一SA5(n=3 1 $Solution of main component SM2 was 500 m I ，and the related substance was mixture of 1 0 nlg／L each(主成分SM2标准的质量浓度为 500 nlg／L，有关物质混合对照液质量浓度各为 1 0 mg／L) 2．5 专属性 主成分 SM2、杂质SA1～SA5相互之问完全分离，而且在检测区域，空白对照没有干扰。 2．6 校正曲线、检出限与定量下限 分别配制6份不同浓度的 SM2标准溶液和 SA1～SA5对照液进行线性实验，结果表明质量浓度 (mg／L)与峰面积(mAU·S)呈良好的线性关系，见表 3。仪器检出限(LOD)为 3倍信噪比(S／N=3)时 被测物的浓度。定量下限(LOQ)为 S／N=10时杂质浓度，列于表 3。 维普资讯 http://www.cqvip.com 第4期 滕久委等：磺胺二甲嘧啶及有关物质 HPLC检测方法验证 433 2．7 实际样品的检测 配制质量浓度为 100和 500 mg／L的磺胺二甲嘧啶样品(Sample SM2，Batch No．250601015)供试 液，以上述方法对主成分及其有关物质进行检测 ，结果显示样品含 99．6％SM2(RSD为0．20％)，而有 关物质 SA1～SA5的含量均低于定量下限。 3 结 论 本工作严格按照美国药典 USP29((1225}简明方法的验证 和((621》色谱通则、ICH指南 Q2A[珀 和 ICH Q2B¨ 以¨及中国药典的有关法规 对原料药磺胺二甲嘧啶及其有关物质(杂质或降解物 )SA1～ SA5的．HPLC分析方法进行了方法学的验证。准确度、精密度、专属性、定量下限、线性范围完全能 够满足这些文件的要求，而且方法简便快速，适用于原料药磺胺二甲嘧啶及其有关物质的检测。 参考文献 ： 何玲玲，王新，兰丽艳．薄层层析法检测磺胺二甲嘧啶中杂质[J]．沈阳化工学院学报，2005，19(4)：311— 313． 谢沐风．薄层色谱法检测有关物质时存在的问 题 快递公司问题件快递公司问题件货款处理关于圆的周长面积重点题型关于解方程组的题及答案关于南海问题 [J]．中国医药工业杂志，2005，36(10)：651—652． NI Yongnian，QI Zhengbao，KOKOT S．Simultaneous ultraviolet—spectrophotometric determination of sulfonamides by multivariate calibration approaches[J]．Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems，2006，82：241—247． 付靖，刘菘，暴娜，等．高效液相色谱法检测替考拉宁组分及其有关物质[J]．河北化工，2006，29(8)：62— 63． 李妮，郁韵秋，沈顺．反相高效液相色谱法测定盐酸齐拉西酮及其有关物质[J]．分析化学，2004，32(7)：916— 918． 王曼霞，林黎明，刘心同，等．高效液相色谱法测定动物组织中8种磺胺类药物残留量[J]．化学分析计量， 2004，13(2)：14—16． 张素霞，李俊锁，钱传范．猪肌肉组织中磺胺类药物的 MSPD净化和 HPLC测定[J]．畜牧兽医学报，1999，30 (6)：531—535． 庞国芳，曹彦忠，张新杰，等．液相色谱 一串联质谱同时测定家禽组织中 16种磺胺残留[J]．分析化学，2005， 33(9)：1252—1256． U．S．FDA(Food and Drug Administration)．Guidance 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