4.高效液相色谱法

null高效液相色谱法高效液相色谱法常州工程职业技术学院制药系 吴朝华2011年7月14日主要内容主要内容基本原理 仪器 日常维护与简单故障排除null液相色谱法是指流动相为液体的色谱技术。采用颗粒十分细的高效固定相，并采用高压泵输送流动相，全部工作通过仪器来完成，这种新的色谱法称为高效液相色谱法。 它可用来做液固吸附、液液分配、离子交换、空间排阻色谱 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 。高效液相色谱法null高压：液体作为流动相流经色谱柱时，受到 的阻力较大，施加高压能使液体迅速通过，一般高达150-350 ×105Pa。 高速：载液在色谱柱内的流速较之经典液相色谱法高得多，一般可达1-10mL/min。 高效：高效液相色谱法的柱效能可达3万塔板/米，而气相色谱法的柱效能仅为2000塔板/米。 高灵敏度：采用高灵敏度的 检测 工程第三方检测合同工程防雷检测合同植筋拉拔检测方案传感器技术课后答案检测机构通用要求培训 器，进一步提高了分析的灵敏度，荧光检测器可达10-11 g 。高效液相色谱法特点高效液相色谱与气相色谱的比较高效液相色谱与气相色谱的比较样品的热不稳定性 样品分子量HPLC室温或低于室温均可作分析测试气相色谱样品必须在高温进样口及色谱柱均不会受到任何破坏HPLC气相色谱理论上讲，没有上限 实际上有溶解性的限制通常情况下 小于 500 amu高效液相色谱与气相色谱的比较高效液相色谱与气相色谱的比较样品制备 进样量HPLC固定相和流动相均参与气相色谱溶剂必须具有挥发性，且其通常比被分析物沸点低HPLC气相色谱进样量取决于色谱柱内径通常情况下为1-5 L高效液相色谱与气相色谱的比较高效液相色谱与气相色谱的比较分离机理 检测器HPLC固定相和流动相均参与气相色谱流动相仅作为样品载体HPLC气相色谱最常见的是紫外-可见光度计 很广范围的非破坏性检测器 三维检测器 灵敏度可达 pg对有机化合物最常见的是 FID液相色谱分离原理液相色谱分离原理 液相色谱是如何完成混合物的分离？ 混合物中各组分在固定相和流动相之间会发生吸附、溶解或其他亲和作用，这种作用存在差异，从而使各组分在色谱柱中的迁移速度不同得到分离。高效液相色谱仪高效液相色谱仪液相色谱仪最基本的组件是高压输液泵、进样器、色谱柱、检测器和数据系统（记录仪、积分仪或色谱工作站）。此外，还可根据需要配置流动相在线脱气装置、梯度洗脱装置、自动进样系统、柱后反应系统和全自动控制系统等。液相色谱仪的工作过程：输液泵2将流动相以稳定的流速（或压力）输送至分析体系，在色谱柱之前通过进样器3将样品导入,流动相将样品带入色谱柱4,在色谱柱中各组分因在固定相中的分配系数或吸附力大小的不同而被分离，并依次随流动相流至检测器5，检测到的信号送至数据系统6记录、处理或保存。高效液相色谱法的分类高效液相色谱法的分类通常将液相色谱法按分离机理分成吸附色谱法、分配色谱法、离子色谱法和凝胶色谱法四大类。但在实际应用中由于 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 与应用对象的独特，往往采用如下一些比较固定的名称。高压输液泵高压输液泵基本要求 流量准确可调。可控制流动相的流速在0.5-2mL/min，流量控制精度小于±0.5%。 耐高压。要求泵的输出压力在30-60MPa。 流动相液流稳定。输出的液流应无脉动，或配套脉冲抑制器。 泵的死体积小。为了快速更换溶剂和适于梯度洗脱，泵的死体积通常要求小于0.5mL。 泵的结构材料应耐化学腐蚀。 常见高压输液泵 输液泵一般分为恒流泵与恒压泵，恒流泵应用更广泛。 气动放大泵（恒压） 双柱塞往复泵（恒流）脱气脱气脱气原因 流动相溶液往往因溶解有氧气或混入了空气而形成气泡。气泡进入检测器后会在色谱图上出现尖锐的噪音峰。小气泡慢慢聚集后会变成大气泡，大气泡进入流路或色谱柱中会使流动相的流速变慢或出现流速不稳定，致使基线起伏。气泡一旦进入色谱柱,排出这些气泡则很费时间。在荧光检测中,溶解氧还会使荧光淬灭。溶解气体还可能引起某些样品的氧化或使溶液pH值发生变化。 方法 超声波振荡脱气 惰性气体鼓泡吹扫脱气 真空脱气装置梯度洗脱1梯度洗脱1高压梯度： 一般只用于二元梯度，即用两个高压泵分别按设定的比例输送A和B两种溶液至混合器，混合器是在泵之后，即两种溶液是在高压状态下进行混合的。高压梯度系统的主要优点是，只要通过梯度程序控制器控制每台泵的输出，就能获得任意形式的梯度曲线，而且精度很高，易于实现自动化控制。其主要缺点是使用了两台高压输液泵，使仪器价格变得更昂贵，故障率也相对较高，而且只能实现二元梯度操作。梯度洗脱2梯度洗脱2低压梯度： 只需一个高压泵，与等度洗脱输液系统相比，就是在泵前安装了一个比例阀，混合就在比例阀中完成。因为比例阀是在泵之前，所以是在常压（低压）下混合，在常压下混合往往容易形成气泡，所以低压梯度通常配置在线脱气装置。来自于四种溶液瓶的四根输液管分别与真空脱气装置的四条流路相接，经脱气后的四种溶液进入比例阀，混合后从一根输出管进入泵体。多元梯度泵的流路可以部分空置。吸附色谱1（adsorption chromatography）吸附色谱1（adsorption chromatography）原理 基于被测组分在固定相 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 面具有吸附作用，且各组分的吸附能力不同，使组分在固定相中产生保留和实现分离。 固定相 固定相通常是活性硅胶、氧化铝、活性炭、聚乙烯、聚酰胺等固体吸附剂，所以吸附色谱也称液固吸附色谱。活性硅胶最常用。 活性硅胶： 一种多孔性物质,因-O-Si(-O-)-O-Si(-O-)-O-结合而具有三维结构,表面具有硅羟基,作吸附剂的硅胶需经加热处理,除掉其表面吸附水,使之活化。按其孔径分布分为表面多孔和全多孔两类。硅胶既是吸附色谱最常用的固定相，也是分配色谱、离子色谱等色谱固定相的常用基质。吸附色谱2（adsorption chromatography）吸附色谱2（adsorption chromatography）流动相： 弱极性有机溶剂或非极性溶剂与极性溶剂的混合物，如正构烷烃（己烷、戊烷、庚烷等）、二氯甲烷/甲醇、乙酸乙酯/乙腈等等。 分离过程： 硅羟基呈微酸性，易与氢结合，是吸附的活性点。流动相溶剂在吸附剂表面形成单分子或双分子吸附层，当样品分子进入色谱柱，样品主要靠氢键结合力吸附到硅羟基上，与流动相分子竞争吸附点。样品分子反复地被吸附，又反复地被流动相分子顶替解吸，随着流动相的流动而在柱中向前移动。因为不同的样品分子在固定相表面的吸附能力不同，因而吸附-解吸的速度不同，各组分被洗脱的时间（保留时间）也就不同，使得各组分相互分离。 应用： 早期的HPLC中应用较多，目前主要用于结构异构体分离和族分离。如农药异构体分离、石油中烷、烯、芳烃的分离。分配色谱1（partition chromatography）分配色谱1（partition chromatography）原理 主要基于样品分子在流动相和固定相间的溶解度不同（分配作用）而实现分离的液相色谱分离模式。 键合固定相 分配色谱原本是基于样品分子在包覆于惰性载体（基质）上的固定相液体和流动相液体之间的分配平衡的色谱方法，因此也称液-液分配色谱。因为作固定相的液体往往容易溶解到流动相中去，所以重现性很差，不大为人们所采用。后来发展起来的键合固定相以化学键合的方法将功能分子结合到惰性载体上，固定相就不会溶解到流动相中去了。这种化学键合型固定相是当今HPLC最常用的固定相，大约占HPLC固定相的四分之三。 极性键合固定相 键合在载体表面的功能分子是具有二醇基、醚基、氰基、氨基等极性基团的有机分子。 分配色谱2（partition chromatography）非极性键合固定相 键合在载体表面的功能分子是烷基、苯基等非极性有机分子。如最常用的ODS（Octa Decyltrichloro Silane）柱或C18柱，它是将十八烷基三氯硅烷通过化学反应与硅胶表面的硅羟基结合，在硅胶表面形成化学键合态的十八烷基，其极性很小。 正相HPLC（normal phase HPLC）： 是由极性固定相和非极性（或弱极性）流动相所组成的HPLC体系。其代表性的固定相是改性硅胶、氰基柱等，代表性的流动相是正己烷。 反相HPLC（reversed phase HPLC）： 由非极性固定相和极性流动相所组成的液相色谱体系，与正相HPLC体系正好相反。其代表性的固定相是十八烷基键合硅胶，代表性的流动相是甲醇和乙腈。是当今液相色谱的最主要分离模式，几乎可用于所有能溶于极性或弱极性溶剂中的有机物质的分离。分配色谱2（partition chromatography）检测器（Detector）检测器： 连续监测柱后流出物组成与含量变化的装置。检测器（Detector）紫外-可见光（UV-VIS）检测器紫外-可见光（UV-VIS）检测器原理 基于Lambert-Beer定律，即被测组分对紫外光或可见光具有吸收，且吸收强度与组分浓度成正比。 多数有机分子都具紫外或可见光吸收基团，有较强的紫外或可见光吸收能力，因此UV-VIS检测器既有较高的灵敏度，也有很广泛的应用范围。 由于UV-VIS对环境温度、流速、流动相组成等的变化不是很敏感，所以还能用于梯度淋洗。一般的液相色谱仪都配置有UV-VIS检测器。 用UV-VIS检测时，为了得到高的灵敏度，常选择被测物质能产生最大吸收的波长作检测波长，但为了选择性或其它目的也可适当牺牲灵敏度而选择吸收稍弱的波长，另外，应尽可能选择在检测波长下没有背景吸收的流动相。二极管阵列检测器（Diode-array Detector,DAD）二极管阵列检测器（Diode-array Detector,DAD）以光电二极管阵列作为检测元件的UV-VIS检测器。它可构成多通道并行工作，同时检测由光栅分光，再入射到阵列式接受器上的全部波长的信号，然后，对二极管阵列快速扫描采集数据，得到的是时间、光强度和波长的三维谱图。与普通UV-VIS检测器不同的是，普通UV-VIS检测器是先用单色器分光，只让特定波长的光进入流动池。而二极管阵列UV-VIS检测器是先让所有波长的光都通过流动池，然后通过一系列分光技术，使所有波长的光在接受器上被检测。HPLC的日常维护1HPLC的日常维护1流动相的要求 高效液相级色谱醇，二次蒸馏水，缓冲盐一定要过滤； 流动相脱气至关重要（可采用抽滤，超声波脱气等方法） 吸滤头：特殊情况下可拆下滤头抽取以判断其中是否堵塞；亦可用注射器吸取流动相通过吸滤头打出以判断其是否堵塞。若有堵塞情况可用异丙醇超声波清洗；清洗不成功则需要更换。 单向阀：如遇到泵压不稳或流动相不能抽取，则可能是单向阀出现问 题 快递公司问题件快递公司问题件货款处理关于圆的周长面积重点题型关于解方程组的题及答案关于南海问题 ，卸下用异丙醇超声波清洗，清洗时须按其安装的方向放置在小烧杯中，切记不可与安装方向倒置超洗！ 泵头：泵头漏液或出现其它故障一般要申请维修（如漏液，或更换柱塞杆及其密封垫等） 过滤器：当色谱峰出现异常情况时，有可能是此部件被污染， 拆下用异丙醇超洗或更换过滤垫片。HPLC的日常维护2排液阀：此处不能完全密封或漏液时一般是其中的垫片污染或磨损，可卸下后取出其垫片用异丙醇超声波清洗或更换垫圈。 手动进样器：平时应注意用二次蒸馏水和甲醇在装载状态及进样分析状态清洗；如出现漏液现象，原因极可能为转子密封垫磨损或污染，一般须申请维修或更换配件。 流通池：在色谱峰不正常时会可能是此部件补污染。可拆卸后取出其中的垫片用异丙醇超洗（可根据说明书进行操作或申请维修）。 工作站：出现死机可重启计算机；非正常运行时，首先可更换电脑测试硬件故障；或在本机上重新插拔接口、重新安装软件。 手动进样器冲洗：用备件中的针管和专用冲洗针头对手动进样器的装载状态和进样状态分别进行冲洗3-4ml的蒸馏水，然后再冲洗3-4ml的纯甲醇。 HPLC的日常维护2HPLC的日常维护3HPLC的日常维护3泵头冲洗：用备件中的针头和针管分别用蒸馏水和纯甲醇冲洗3-5ml。 缓冲盐的使用：流动相含有盐分时，做完实验后一定要进行流路冲洗；首先用水冲洗，打开排液阀用PURG键转换出原有含盐的流动相，然后关闭排液阀打开泵冲洗全部流路45分钟以上，如此更换流动相为水和甲醇混合液冲洗全部流路30分钟（此步骤一般可省去，根据实验而论），最后更换纯甲醇冲洗全部流路45分钟以上。  确保每次做完实验，所有流路中充满纯甲醇！ 色谱柱的保养：C18柱绝对不能进蛋白样品、血样，生物样品。要注意柱子pH值范围（一般为2-8），不得注射强酸强碱样品。长时间不用仪器，应将柱子取出用堵头封好保存。不能用纯水封存柱子，而应该用有机相（如甲醇）封存，因为纯水易长霉。 null