SiRNA讲义

SiRNA讲义nullsiRNA TransfectionsiRNA Transfection前言前言RNA是生物体内最重要的物质基础之一，它与DNA和蛋白质一起构成生命的框架。 RNA分子从DNA那儿获得自己的顺序，然后将遗传信息转化成蛋白质。 RNA操纵着许多细胞功能通过互补序列的结合反作用于DNA ，从而关闭或调节基因的表达某些小分子RNA可以通过指导基因的开关来调控细胞的生长发育。nullTransformation and transfection RNAi Small interfering RN...

nullsiRNA TransfectionsiRNA Transfection前言前言RNA是生物体内最重要的物质基础之一，它与DNA和蛋白质一起构成生命的框架。 RNA分子从DNA那儿获得自己的顺序，然后将遗传信息转化成蛋白质。 RNA操纵着许多细胞功能通过互补序列的结合反作用于DNA ，从而关闭或调节基因的表达某些小分子RNA可以通过指导基因的开关来调控细胞的生长发育。nullTransformation and transfection RNAi Small interfering RNA (siRNA)的定义作用机理应用 RNAi的定义RNAi的定义双链RNA对基因表达的阻断作用被称为RNA干预（RNA interference, RNAi）双链RNA经酶切后会形成很多小片段，称为siRNA ，这些小片段一旦与信使RNA (m RNA)中的同源序列互补结合，会导致mRNA失去功能，即不能翻译产生蛋白质，也就是使基因“沉默”了RNAi的历史RNAi的历史1993年：将产生紫色素的基因转入开紫花的矮牵牛中，希望得到紫色更深的花，可是事与愿违，非但没有加深紫色，反而成了白色。当时认为这是矮牵牛本来有的紫色素基因和转入的外来紫色素基因都失去了功能，称这种现象是“共抑制”。RNAi的历史RNAi的历史1995年，康奈尔大学的Su Guo博士用反义RNA阻断线虫基因表达的试验中发现，反义RNA (anti sense RNA)和正义RNA (sense RNA )都阻断了基因的表达，他们对这个结果百思不得其解。 1998年，Andrew Fire的研究证明，在正义RNA阻断了基因表达的试验中，真正起作用的是双链RNA 。这些双链RNA是体外转录正义RNA时生成的,于是提出了RNAi这个词。 Small interfering RNA (siRNA) MechanismSmall interfering RNA (siRNA) MechanismnullRISC（RNA-induced silencing complex ）应用应用功能基因组学细胞信号通路分析疾病的研究----病理研究疾病治疗的研究----药物靶筛选 null选择、设计、合成siRNA双链（5种）化学合成siRNA 质粒表达siRNA 转染siRNA到靶细胞瞬时表达—— 化学合成siRNA，质粒表达siRNA 稳定表达—— 质粒表达siRNA 分析检测RNA干扰作用蛋白水平: WB/ IF/ FC mRNA水平: RT-PCR、northern blotting siRNA基因沉默实验设计nullsiRNA转染方法siRNA转染方法磷酸钙共沉淀 DEAE-葡聚糖和polybrene 电穿孔法机械法阳离子脂质体试剂阳离子聚合物病毒介导法siRNA转染试剂siRNA转染试剂INTERFERin™（ Polyplus） Lipofectamine 2000 （ Invitrogen） Oligofectamine （ Invitrogen） HiPerFect （ Qiagen） SiLentFect （ BioRad） null转染的检测转染的检测蛋白水平检测: WB/ IF/ FC转染的检测转染的检测mRNA水平检测: RT-PCR、northern blotting转染实验的注意事项转染实验的注意事项纯化siRNA 避免RNA酶污染健康的细胞培养物和严格的操作确保转染的重复性避免使用抗生素选择合适的转染试剂通过合适的阳性对照优化转染和检测通过标记siRNA来优化实验

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