分子生物学笔记（西北农林科技大学，郭蔼光讲授）

分子生物学笔记（西北农林科技大学，郭蔼光讲授） 1.1 分子生物学的含义 1.1.1 分子生物学的概念 分子生物学是从分子水平研究生命本质的科学。即是研究生命分子机理的科学。 1945年William和Astbury首先使用―分子生物学‖这一术语，意指―生物大分子的化学和物理结构研究，这显然和生命(活生物体)未紧密联系。 生命现象包括:生长、繁殖、遗传、运动、新陈代谢、物质交换、对外界刺激的反应等，这些过程均与生物化学反应相联系，而生物化学反应的基础是分子(特别是大分子)的合成和互作，分子的结构与功能。 分子生物学首先注重于研究生命本质的共性方面:分子结构、分子遗传、分子结构与功能及表型的关系。 现代分子生物学是在分子水平上研究细胞的功能，并揭示生命的本质。目前常把基因结构和表达产物功能的研究称为分子生物学。 1.1.2 分子生物学的研究范围 ?生物大分子(核酸、蛋白质、大分子糖类和复合生物大分子)的化学结构和三维结构，以及大分子之间的相互作用。 ?生物大分子的结构与功能的关系，以及生物学现象的分子生物学过程。 ?生物大分子在细胞成分中的组织结构方式，以及活细胞中合成生物大分子的过程。 ?生物信息传递和代谢调节的分子生物学过程。 分子生物学是当前生命科学中发展最快并正在与其它学科广泛交叉与渗透的重要前沿领域。 目标:在分子水平上掌握细胞的结构与功能并揭示生命的本质。 作用:分子生物学的发展为人类认识生命现象带来了前所未有的机会，也为人类利用和改造生物创造了极为广阔的前景。 1.2 分子生物学发展简史 1.2.1 分子生物学的奠基阶段 19世纪后期到20世纪50年代初，人们产生了两点对生命本质的认识上的重大突破:蛋白质是生命的主要基础物质;生物遗传的物质基础是DNA。 1.2.1.1 确定蛋白质是生命的主要基础物质 19世纪末Buchner兄弟提出酶(enzyme)是生物催化剂。 20世纪20~40年代提纯和结晶了尿素酶、胃蛋白酶、肌动蛋白等，证明酶的本质是蛋白质。并发现生命的许多现代(代谢、消化、呼吸、运动等)都与酶和蛋白质相联系。 1902年Emil Fisher证明蛋白质结构是多肽。 40年代末，Sanger创立二硝基氟苯(DNFB)法 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 肽链N端氨基酸。 Edman的异硫氰酸苯酯法分析肽链N端氨基酸。 1950年Pauling和Corey用结晶X-线衍射分析技术，提出α-角蛋白的α-螺旋结构模型。认识了蛋白质的一级结构和空间结构。 1953年Sanger和Thompson完成了第一个多肽分子——胰岛素A链和B链的氨基全序列分析。 1.2.1.2 确定了生物遗传的物质基础是DNA 1868年，F.Miescher发现核素(nuclein)，白细胞中富含磷酸的酸性物质。 1889年，R.Altmann在酵母中制备了不含蛋白的核素，称之为核酸 Nucleic acid 直到40年代以后人们对核酸的功能和结构的认识才有了进步。在此之前对携带遗传信息的侯选分子更多的是考虑蛋白质。 1925—1930年，Levene (德国)确定核酸由4种核苷酸组成 A :T :G :C = 1 :1 :1 :1 1944年O.T.Avery等证明了肺炎球菌转化因子是DNA。 1952年A.D.Hershey和M.Chase用双标记实验证明DNA是遗传物质。 噬菌体在35S培养基中外壳蛋白被标记;在32P培养基中DNA被标记;这种双标记的噬菌体感染大肠杆菌时，DNA进入细胞大量复制(只有亲本DNA链才有32P)并装配成子代颗粒，只有少量的噬菌体有32P，而无外壳有35S。 1949~52年S. Furbery等的X-线衍射分析阐明了核苷酸并非平面的空间构像，提出了DNA是螺旋结构。 1948~53年Chargaff等用新的层析和电泳技术分析组成DNA的碱基和核苷酸量，积累了大量的数据，提出了DNA硷基组成A=T、G=C的Chargaff规则，为认识DNA结构打下了基础。 1.2.2 现代分子生物学的建立和发展 1953年Watson和Crick提出的DNA双螺旋结构模型作为现代分子生物学诞生的里程碑开创了分子遗传学基本理论建立和发展的新时代。 DNA双螺旋发现的意义在于:?确立了核酸作为信息分子的结构基础;?提出了碱基配对是核酸复制、遗传信息传递的基本方式;?从而确定了核酸是遗传的物质基础，为认识核酸与蛋白质的关系及其在生命中的作用打下了基础。 1.2.2.1 遗传信息传递中心法则的建立 ? Watson和Crick发现DNA双螺旋结构的同时，提出了DNA复制的可能模型。 1958年Meselson及Stahl用同位素标记和超速离心分离实验为DNA半保留模型提出了证明。 1957年，Crick提出中心法则。Hoaglanol发现tRNA 。 1968年Okazaki(冈畸)提出DNA不连续复制模型。 1972年证实DNA复制开始需要RNA作为引物。 70年代初获得DNA拓扑异构酶，并对真核DNA聚合酶特性做了研究;认识了DNA复制的机理。 ?在研究DNA复制将遗传信息传给子代的同时，提出了RNA在遗传信息传到蛋白质过程中起着中介作用的假说。 1958年Weiss及Hurwitz等发现依赖于DNA的RNA聚合酶。 1961年Hall和Spiege-lman用RNA-DNA杂交证明mRNA与DNA序列互补;逐步阐明了RNA转录合成的机理。 ?认识到蛋白质是接受RNA的遗传信息而合成的。 50年代初Zamecnik等在形态学和分离的亚细胞组分实验中已发现微粒体(microsome)是细胞内蛋白质合成的部位。 1957年Hoagland等分离出tRNA并对它们在合成蛋白质中转运氨基酸的功能提出了假设。 1961年Brenner等观察了在蛋白质合成过程中mRNA与核糖体的结合。 1961年，Yanofsky和Brener提出Triplet(三联体)设想，后经Nirenberg和Matthai的努力于 1966年破译了全部64个遗传表明这套遗传密码。 1964年，Jacob和Monod用T4Phage感染的E.coli系统，发现了转录过程和mRNA 。 1965年，Jacob和Monod提出操纵子学说，开创了基因表达调控研究。 1970年Temin和Baltimore同时从鸡肉瘤病毒颗粒中发现以RNA为模板合成DNA的反转录酶，进一步补充和完善了遗传信息传递的中心法则。 1.2.2.2 对蛋白质结构与功能的认识 1956~58年Anfinsen和White根据酶蛋白变性复性实验，提出蛋白质的三维空间结构是由氨基酸序列确定的。 1958年Ingram证明正常的血红蛋白与镰刀状细胞溶血症病人的血红蛋白之间，亚基的肽链上仅有一个氨基酸残基的差别，使人们对蛋白质一级结构影响功能有了深刻的印象。同时对蛋白质研究的手段也有改进。 1969年Weber开始应用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量。 60年代先后分析得血红蛋白、核糖核酸酶A等蛋白质的一级结构。 1973年氨基酸序列自动测定仪问世。中国科学家在1965年人工合成了牛胰岛素。 在1973年用1.8A X-线衍射分析法测定了牛胰岛素的空间结构，为认识蛋白质的结构做出了重要贡献。 1.4 分子生物学在生命学科中的位置 分子生物学是由生物化学、生物物理学、遗传学、微生物学、细胞学、以至信息科学等多学科相互渗透、综合融会而产生并发展起来的。已形成它独特的理论体系和研究手段而成为一个独立的学科。 分子生物学不同于生物化学: 生物化学是从化学角度研究生命现象，它着重研究生物体内各种生物分子的结构、转变与代谢。 传统生物化学的中心内容是物质代谢和能量代谢及其与生理功能的联系。 分子生物学在于阐明生命的本质——生物大分子核酸与蛋白质的结构与功能、生命信息的传递和调控。 细胞生物学与分子生物学关系十分密切。细胞生物学主要研究细胞和亚细胞器的形态、结构与功能。光学显微镜和电子显微镜下所见到的规则结构是各种分子有序结合而形成的。探讨组成细胞的分子结构能深入认识细胞的结构与功能。因此现代细胞生物学的发展越来越多地应用分子生物学的理论和方法。 分子生物学则是从研究各个生物大分子的结构入手，进一步研究各生物分子间的高层次组织和相互作用，尤其是细胞整体反应的分子机理。因此产生了新的学科:分子细胞学或细胞分子生物学，成为人们认识生命的基础。 分子生物学涉及认识生命的本质，它地广泛地渗透到医学各学科领域中，成为现代医学重要的基础。 在医学各个学科中，包括生理学、微生物学、免疫学、病理学、药理学以及临床各学科分子生物学都正在广泛地形成交叉与渗透，形成了一些交叉学科，如分子免疫学、分子病毒学、分子病理学和分子药理学等，促进了医学的发展 。 分子生物学方面获诺贝尔奖的主要成就有:mRNA 前体剪切//左手螺旋DNA发现及其它多态性DNA//DNA一级结构的测定//核酸人工合成 //基因重组技术、基因工程//癌基因及癌变理论发现和建立//神经分子生物学// 基因组 计划 项目进度计划表范例计划下载计划下载计划下载课程教学计划下载 :人类、水稻、拟南芥、果蝇 1.3 分子生物学的现状和展望 70年代后，分子生物学理论和技术发展的积累导致出现了基因工程技术。利用分子生物学理论和技术，人类进入了认识生命和改造生命的新时期。 1.3.1 重组DNA技术的建立和发展 1967-1970年R.Yuan和H.O.Smith等发现的限制性核酸内切酶为基因工程提供了有力的工具。 1972年Berg等将SV-40病毒DNA与噬菌体P22DNA在体外重组成功，转化大肠杆菌， 使在真核细胞中合成的蛋白质能在细菌中表达，打破了种属界限。 1977年Boyer等首先将人工合成的生长激素释放抑制因子14肽的基因重组入质粒，成功地在大肠杆菌中合成得到这14肽。 1978年Itakura(板仓)等使人生长激素191肽在大肠杆菌中表达成功。 1979年美国基因技术公司用人工合成的人胰岛素基因重组转入大肠杆菌中合成人胰岛素。 至今我国已有人干扰素、人白介素2、人集落刺激因子、重组人乙型肝炎疫苗、基因工程幼畜腹泻疫苗等多种基因工程药物和疫苗进入生产或临床试用。 世界上还有几百种基因工程药物及其它基因工程产品在研制中，成为当今农业和医药业发展的重要方向，将对医学和工农业发展作出新贡献。 转基因和基因剔除动植物的成功是基因工程技术发展的结果。 1982年Palmiter等将克隆的生长激素基因导入小鼠受精卵细胞核内，培育得到比原小鼠个体大几倍的―巨鼠‖。 我国水生生物研究所将生长激素基因转入鱼受精卵，得到的转基因鱼的生长加快、个体增大。 转基因猪也正在研制中。 用转基因动物还能获取治疗人类疾病的重要蛋白质，导入凝血因子?基因的转基因绵羊分泌的乳汁中富含凝血因子?，能用于血友病。 1994年能比普通西红柿保鲜时间更长的转基因西红柿投放市场。 1996年转基因玉米、转基因大豆相继投入商品生产，美国最早研制得到抗虫棉花，我国科学家将自己发现的蛋白酶抑制剂基因转入棉花获得抗棉铃虫的棉花株。 到1996年全世界已有250万公顷土地种植转基因植物。 基因诊断与基因治疗是基因工程在医学领域发展的一个重要方面。 1991年美国向一患先天性免疫缺陷病(遗传性腺苷脱氨酶ADA基因缺陷)的女孩体内导入重组的ADA基因，获得成功。 我国也在1994年用导入人凝血因子?基因的方法成功治疗了乙型血友病的患者。 在我国用作基因诊断的试剂盒已有近百种之多。基因诊断和基因治疗正在发展之中。 基因工程的迅速进步得益于许多分子生物学新技术的不断涌现。 核酸的化学合成从手工发展到全自动合成，1975~1977年Sanger、Maxam和Gilbert先后发明了三种DNA序列的快速测定法。 90年代全自动核酸序列测定仪的问世。 1985年Cetus公司Mullis等发明的聚合酶链式反应(PCR)的特定核酸序列扩增技术，更以其高灵敏度和特异性被广泛应用，对分子生物学的发展起到了重大的推动作用。 1.3.2 基因组研究的发展 分子生物学已从研究单个基因发展到研究生物整个基因组的结构与功能。 1 977年Sanger测定了ΦX174-DNA全部5375个核苷酸的序列。 1978年Fiers等测出SV-40DNA全部5224对碱基序列。 80年代λ噬菌体DNA全部48,502硷基对的序列全部测出;一些小的病毒包括乙型肝炎病毒、艾滋病毒等基因组的全序列也陆续被测定。 1996年底科学家共同努力测出了大肠杆菌基因组DNA的全序列长4x106碱基对。 1990年人类基因组计划(Human Genome Project)开始实施，这是生命科学领域有史以来全球性最庞大的研究计划，将在2005年时测定出人基因组全部DNA3x109硷基对的序列、确定人类约5-10万个基因(实际只有3万个基因)的一级结构。 2000年底美国已测定出了拟南芥(Arabidopsis thaliana)DNA的全部碱基序列。 2001年初，美国测定出了水稻的基因组图谱;完成了人类基因组草图框架。 1.3.3 单克隆抗体及基因工程抗体的建立和发展 1975年Kohler和Milstein首次用B淋巴细胞杂交瘤技术制备出单克隆抗体以来，人们利用这一细胞工程技术研制出多种单克隆抗体，为许多疾病的诊断和治疗提供了有效的手段。 80年代以后随着基因工程抗体技术而相继出现的单域抗体、单链抗体、嵌合抗体、重构抗体、双功能抗体等为广泛和有效的应用单克隆抗体提供了广阔的前景。 1.3.4 基因表达调控机理 分子遗传学基本理论建立者Jacob和Monod最早提出的操纵元学说，在分子遗传学基本理论建立的60年代，主要认识了原核生物基因表达调控的一些规律，70年代后逐渐认识了真核基因组结构和调控的复杂性。 1977年最先发现猴SV40病毒和腺病毒中编码蛋白质的基因序列是不连续的，这种基因内部的间隔区(内含子)在真核基因组中是普遍存在的，揭开了认识真核基因组结构和调控的序幕。 1981年Cech等发现四膜虫rRNA的自我剪接，从而发现核酶(ribozyme)。 80-90年代，使人们逐步认识到真核基因的顺式调控元件与反式转录因子、核酸与蛋白质间的分子识别与相互作用是基因表达调控根本所在。 1.3.5 细胞信号转导机理研究成为新的前沿领域 1957年Sutherland发现cAMP、65年提出第二信使学说，是认识受体介导的细胞信号转导的第一个里程碑。 1977年Ross等用重组实验证实G蛋白的存在和功能，将G蛋白与腺苷环化酶的作用相联系起来，深化了对G蛋白偶联信号转导途径的认识。 70年代中期以后，癌基因和抑癌基因的发现、蛋白酪氨酸激酶的发现及其结构与功能的研究、各种受体蛋白基因的克隆和结构功能的探索等。 目前，对于某些细胞中的一些信号转导途径已经有了初步的认识，尤其是在免疫活性细胞对抗原的识别及其活化信号的传递途径方面和细胞增殖控制方面等都形成了一些基本的概念。 1.3.6 现代分子生物学的发展前景 在50年中，分子生物学是生命科学范围发展最为迅速的一个前沿领域，并推动着整个生命科学的发展。 分子生物学已建立的基本规律给人们认识生命的本质指出了光明的前景，但分子生物学的发展还要经历漫长的研究道路。 在地球上千姿百态的生物携带庞大的生命信息，迄今人类所了解的只是极少的一部分，还未认识核酸、蛋白质组成生命的许多基本规律; 即使我们已经获得人类基因组DNA3x109bp的全序列，确定了人的3万多个基因的一级结构，但是要彻底搞清楚这些基因产物的功能、调控、基因间的相互关系和协调，要理解80%以上不为蛋白质编码的序列的作用等等，都还要经历艰辛的研究道路。 随着分子生物学的发展和人类对生命的认识，21世纪分子生物学的发展将进入一个新时代。 功能基因组学:是应用基因组学的知识和工具来了解影响发育和整个生物体的特定序列表达谱。 蛋白质组学:一个基因组所表达的全部蛋白质;或细胞内的全部蛋白质。在特定时间、特定环境和实验条件下基因组活跃表达的蛋白质，称为功能蛋白质组学。 生物信息学:利用数据库、计算机网络和应用软件等对DNA和蛋白质序列资料中各类信息进行识别、存储、分析、模拟和传输的一门科学。 .1 DNA的一级结构 1869年F.Miescher从脓细胞中提取到一种富含磷元素的酸性化合物，因存在于细胞核中而将它命名为―核质‖(nuclein)。20年后称为核酸 (nucleic acids)，其功能不清楚。1944年Avery等，发现从S 型肺炎球菌中提取的DNA与R型肺炎球菌混合后，能使某些R型菌转化为 S型菌，且转化率与DNA纯度呈正相关。 若将DNA预先用DNA酶降解，转化就不发生。结论是:S型菌的DNA将其遗传特性传给了R型 菌，DNA就是遗传物质。 1952年A.D.Hershey和M.Cha-se用DNA35S和32P分别标记T2噬菌体的蛋白质和核酸，感染大肠杆菌的实验进一步证明了DNA是遗传物质。 2.1.1 多核苷酸链 2.1.1.1 核酸的化学成分 核酸是生物体内的高分子化合物。它包括脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid，DNA)和核糖核酸(ribonucleic acid，RNA)两大类。DNA和RNA是由单个核苷酸(nucleotide)头尾相连而形成的。RNA平均长度大约为2000个核苷酸;人DNA可长达3×109个核苷酸。 核苷酸是由碱基、戊糖和磷酸构成。 碱基(base): 嘌呤(purine) :腺嘌呤(adenine，A)、鸟嘌呤(guanine，G); 嘧啶(pyrimi-dine) :胞嘧啶(cytosine，C)、胸腺嘧啶(thymine，T)、尿嘧啶(uracil，U)。 DNA中存在:A、T、G、C; RNA中存在:A、U、G、C。 嘌呤环上的N-9或嘧啶环上的N-1是构成核苷酸时与核糖(或脱氧核糖)形成糖苷键的位置。 核酸分子中还有数十种修饰碱基(themodified component)，又称稀有碱基，(unusual component)。是五种碱基环上的某一位置被一些化学基团(如甲基化、甲硫基化等)修饰后的衍生物。 一般这些碱基在核酸中的含量稀少，在各种类型核酸中的分布也不均一。如DNA中的修碱基主要见于噬菌体DNA，RNA中以tRNA含修饰碱基最多。 戊糖:RNA中的戊糖是D-核糖，DNA中的戊糖是D-2-脱氧核糖。D-核糖的C-2所连的羟基脱去氧就是D-2脱氧核糖。 戊糖C-1所连的羟基是与碱基形成糖苷键的基团，糖苷键的连接都是β-构型。 核苷(nucleoside):由D-核糖或D-2脱氧核糖与嘌呤或嘧啶通过糖苷键连接组成的化合物。核酸中的主要核苷有8种。 核苷酸(nucleotide):核苷与磷酸残基构成的化合物，即核苷的磷酸酯。 核苷酸是核酸分子的结构单元。核酸分子中的磷酸酯键是在戊糖C-3‘和C-5‘所连的羟基上形成的，构成核酸的核苷酸为3‘-核苷酸或5‘-核苷酸。 DNA分子中是含有A、G、C、T四种碱基的脱氧核苷酸;RNA分子中则是含A、G、C、U四种碱基的核苷酸。 核酸分子中的核苷酸都以多聚核苷酸形式存在，但在细胞内有多种游离的核苷酸，其中包括一磷酸核苷、二磷核苷和三磷酸核苷。 核苷酸分子中的主要化学成分为:碱基、戊糖、核苷、 核苷酸 。 2.1.1.2 核苷酸的连接方式 核酸是由多个核苷酸以3‘,5‘-磷酸二酯键聚合成的多聚核苷酸(poly nucleotide)，相邻二个核苷酸之间以3‘,5‘-磷酸二酯键连接。 寡核苷酸(oligonucleotide):是指2至10核苷酸残基以磷酸二酯键连接而成的线性多核苷酸片段。30甚至更多个核苷酸残基的多核苷酸分子也称作寡核苷酸。寡核苷酸可由仪器自动合成，它可作为DNA合成的引物(primer)、基因探针(probe)等，在现代分子生物学研究中具有广泛的用途。 核酸链的简写式:核酸分子的简写式可简明表示高度复杂的核酸分子。简写式表示的中心含 义就是核酸分子的一级结构，即核酸分子中的核苷酸(或碱基)排列顺序。 字符式:用A、T、G、C、U代表碱基，用P代表磷酸残基。核酸分子中的糖基、糖苷键和酯键等均省略不写，将碱基和磷酸相间排列即可。不再注解―脱氧‖与否，简写式中出现T的为DNA链，出现U则为RNA链。以5?和3‘表示链的末端及方向，分别置于简写式的左右二端。 5‘pApCpTpTpGpApApCpG3‘ DNA 5‘pApCpUpUpGpApApCpC3‘ RNA 简化为: 5‘pACTTGAACG3‘ DNA 5‘pACUUGAACG3‘RNA 简写式的5?-末端均含有一个磷酸残基(与糖基的C-5‘位上的羟基相连)，3?-末端含有一个自由羟基(与糖基的C-3‘位相连)，若5?端不写P，则表示5‘-末端为自由羟基。 双链DNA分子的简写式多采用省略了磷酸残基的写法，在上述简式的基础上再增加一条互补链(complentarystrand)即可，链间的配对碱基用短纵线相连或省略。 5‘GGAATCTCAT3‘ 3‘CCTTAGAGTA5‘ 线条式:在字符书写基础上，以垂线(位于碱基之下)和斜线(位于垂线与P之间)分别表示糖基和磷酸酯键。 2.1.2 DNA的一级结构 DNA的一级结构是指DNA分子中核苷酸的排列顺序，简称为DNA顺序(或序列)。 由于核苷酸之间的差异仅仅是碱基的不同，故可称为碱基顺序。 DNA是巨大的生物高分子，如人的DNA就包含了3x10,碱基对，如此数目的碱基可容纳巨大的信息量。生物界里的遗传信息都包含在组成DNA的A、G、C、T这四种核苷酸的排列顺序之中。 DNA分子中不同排列顺序的DNA区段构成特定的功能单位，这就是基因，不同基因的功能各异，各自分布在DNA的一定区域。 基因的功能取决于DNA的一级结构，要解释基因的生物学含义，就必须弄清DNA顺序。因此，DNA顺序测定是分子遗传学中一项既重要又基本的课题。 2.2 DNA的二级结构及多态性 2.2.1 DNA的双螺旋结构 2.2.1.1 双螺旋结构建立的依据 Watson和Crick在1953年以立体化学上的最适构型建立了一个与DNA X-射线衍射资料相符的分子模型——DNA双螺旋结构模型。 它可在分子水平上阐述遗传(基因复制)的基本特征。 DNA双 螺旋结构的主要依据:多核苷酸的特定序列是遗传信息所在。 Watson和Crick集各项DNA研究成果于一体，提出了双螺旋结构的模型。对建立DNA 双螺旋结构有直接影响的主要有两方面的依据:Chatgaff对不同来源的DNA进行了碱基定量分析，得出了组成DNA的四种碱基的比例关系Wilkins等用X-射线衍射方法获得的DNA结构资料。 ?1949-1951年Chatgaff应用紫外分光光度法和纸层析等技术，对不同来源的DNA进行碱基定量分析，得出组成DNA四种碱基的比例关系。 碱基组成的共同规律: 不同来源的DNA中[A]=[T]、[C]=[G];A+G=T+C 。 不同物种组织DNA在总的碱基组成上有很大的变化，表现在A+T/G+C比值的不同， 但同种生物的不同组织DNA碱基组成相同。 ?Wilkins及其同事Franklin等用X-射线衍射方法获得的DNA结构资料。 X-射线衍射技术是一种在原子水平上间接观测晶体物质的分子结构的方法(分辨率1´10-9m)。 利用DNA纤维晶体得到精确反映DNA某些结构特征的X-射线衍射图片。影像表明了DNA结构的螺旋周期性，碱基的空间取向等。 2.2.1.2 双螺旋结构特征 ?主链(backbone):脱氧核糖和磷酸基通过酯键交替连接成反向平行的两条主链，它们绕一共同轴心向右盘旋形成双螺旋构型。主链处于螺旋的外则。 ?碱基对(base pair):碱基位于螺旋的内则，它们以垂直于螺旋轴的取向。 同一平面的碱基在二条主链间形成碱基对。 A-T、G-C。间以氢键配对。 ?大沟和小沟:大沟和小沟分别指双螺旋表面凹下去的较大沟槽和较小沟槽。小沟位于双螺旋的互补链之间，而大沟位于相毗邻的双股之间。 ?结构参数:螺旋直径2nm;螺旋周期包含10bp;螺距3.4nm;相邻碱基对平面的间距0.34nm。 2.2.1.3 双螺旋结构的意义 ?确立了核酸作为信息分子的结构基础;?提出了碱基配对是核酸复制、遗传信息传递的基本方式;?确定了核酸是遗传的物质基础，为认识核酸与蛋白质的关系及其在生命中的作用奠定了基础。 DNA的二条链是一对互补的模板(亲本)，复制时两条链分开， 每条链都作为模板指导合成与自身互补的新链，最后从原有的两条链得到两对链而完成复制。 在严格碱基配对基础上的互补合成保证了复制的高度保真性。复制得到的每对链中只保留了一条亲链，称为半保留复制(semi-conservative replication)。在满足二条链碱基互补的前提下，DNA的一级结构并不受限制。这一特征能很好的阐明DNA作为遗传信息载体在生物界的普遍意义。实验证明半保留复制是生物体遗传信息传递的最基本方式。 2.2.2 DNA二级结构的多态性 2.2.2.1 A-DNA和B-DNA DNA结构的研究手段主要是X射线衍射技术，它是通过间接观测多个DNA分子有关结构参数的平均值而获得的。根据X-射线衍射图谱在溶液中的DNA一般为B-构象，这是最常见的DNA构象。DNA的结构是动态的。在以钠、钾或铯作反离子，相对湿度为75,时，DNA分子的X-射线衍射图显示的是A-构象。A-构象不仅出现于脱水DNA中，还出现在RNA分子中的双螺旋区和DNA-RNA杂交分子中。 B-DNA与A-DNA的比较 DNA锂盐在相对湿度为66,，其构象为C-构象。这种构象仅在实验室中观察到。DNA的构象是可变的，在不同的条件下构象不同。但这些DNA都是右手双螺旋;这些螺旋中都有两个螺旋沟，分为大沟与小沟，只是它们的宽窄和深浅程度有所不同。 2.2.2.2 Z-DNA Wang和Rich等在研究人工合成的d(CGCGCG)单晶的X-射线衍射图谱时，发现这种六聚体的构象不同于B-构象。它是左手双螺旋，在主链中各个磷酸根呈锯齿(Zigzag)状排列，因此称Z-构象。 Z-构象中的重复单位是二核苷酸;Z-DNA只有一个螺旋沟，它相当于B构象中的小沟，它狭而深，大沟则不复存在。 B-DNA与Z-DNA的比较 Z-DNA的形成是DNA单链上出现嘌呤与嘧啶交替排列所成的。这种排列方式会造成核苷酸的糖苷键的顺式和反式构象的交替存在。 当碱基与糖构成反式结构时，它们之间离得远;而当它们成顺式时，就彼此接近。 嘧啶糖苷键通常是反式的，而嘌呤糖苷酸键既可成顺式的也可成反式的。 在Z-DNA中嘌呤碱是顺式的。因此在Z-DNA中嘧啶的糖苷链离开小沟向外挑出，而嘌呤上的糖苷键则弯向小沟。嘌呤与嘧啶的交替排列就使得糖苷键也是顺式与反式交替排列，从而 Z-DNA主链呈锯齿状或―Z‖字形。 DNA分子中存在有Z-DNA区。而且有一些因素可以促使B-DNA转变为Z-DNA。如胞嘧啶第五位碳原子的甲基化，在甲基周围形成局部的疏水区。这一区域扩伸到B-DNA的大沟中，使B-DNA不稳定而转变为Z-DNA。这种m5C现象在真核生物中是常见的。因此在生物B-DNA中某些区段具有Z-DNA构象是可能的。DNA是一个构象可变的动态分子。 Z-DNA的生物学意义: Z-DNA的形成通常在热力学上是不利的。因为Z-DNA中带负电荷的磷酸根距离太近了，这会产物静电排斥。但DNA链的局部不稳定区的存在就成为潜在的解链位点。DNA解螺旋却是DNA复制和转录等过程中必要的环节，因此认为这一结构位点与基因调节有关。 DNA螺旋上沟的特征在信息表达中的作用: 调控蛋白通过特定的氨基酸侧链与DNA双螺旋沟中碱基的氢原子供体或受体形成氢键，从而识别DNA上的遗传信息。沟的宽窄和深浅直接影响到调控蛋白质对DNA信息的识别。Z-DNA中大沟消失，小沟狭而深，使调控蛋白识别方式也发生变化。Z-DNA中出现的嘌呤,啶嘧交替排列，是在进化中对DNA序列与结构不断调整与筛选的结果，可能有其内在而深刻的含意。 DNA构象的可变性，即DNA二级结构的多态性的发现拓宽了人们的视野。生物体中最为稳定的遗传物质也可以采用不同的姿态来实现其丰富多采的生物的奥妙。 利用X-射线衍射技术时的样品分析条件与被测DNA分子的天然状态相差甚远。因此，在反映DNA结构真实性方面这种方法存在着缺陷。1989年，应用扫描隧道显微镜(STM)研究DNA结构克服了X-射线衍射技术的缺陷(分辨率1´10-10m) 。 STM可将被测物放大500万倍，且能直接观测接近天然条件下单个DNA分子的结构细节。它所取得的DNA结构资料更具有―权威性‖。STM证实了d(CG)重复序列的寡核苷酸片段为Z-DNA结构的事实。STM技术的应用是DNA结构研究中的重要进展。 2.2.2.3 三链DNA(H-DNA) 含(TC)n和(AG)n这样的同型嘧啶和同型嘌呤，并形成镜像重复或回文结构的序列，在低pH值条件下，双链DNA拆开后产生的多聚嘧啶链回折，并嵌入剩下的双链DNA大沟中形成分子内的三链DNA。三链DNA的第三股链可来自分子内或分子外。三链DNA中，位于大沟中的多聚嘌呤链与双链DNA中的多聚嘌呤链成平行走向，碱基按照Hoogsteen方式配对形成TAT，CGC三联体。 作用:与基因表达有关，第三股链可能阻碍一些调控蛋白或RNA聚合酶与DNA结合;干扰转录延伸;反义DNA。鸟苷酸四聚体//四螺旋结构存在于端粒中，DNA分子或染色体分子可能彼此连接形成局部的四螺旋结构，可能起着稳定染色体和在复制过程中保持其完整性的作用。 2.2.2.4 影响多态性的因素 产生多态性的原因是由于多核苷酸链的骨架含有许多可转动的单键，从而使糖环可采取不同的折叠形式和苷键采取不同构象。 湿度和盐离子的影响:在溶液或细胞中的天然DNA大多数为B-DNA，但改变湿度或由钠盐 变为钾盐、铯盐等，则会引起构象的变化，形成A-DNA、C-DNA等构象。 有机溶剂的影响:用乙醇沉淀DNA时可将DNA由B-DNA经C-DNA转变为A-DNA。 盐浓度的影响:高浓度盐溶液(4mol/L)会使B-DNA部分变构为Z-DNA。 碱基序列的影响: 人工合成的CGCGCG序列的高盐溶液中为Z-DNA构象;含(TC)n和(AG)n的同型嘧啶和同型嘌呤，并形成镜像重复的序列，在低pH值条件下，可形成分子内的三链DNA(H-DNA)。 在双螺旋结构中的碱基对中，由于Pu是双环结构大于Py的单环，因此在碱基对中会伸过中点突出到对方一侧，增加了碱基的堆积程度，也使官能团发生挤压，这种挤压随碱基序列发生变化。双螺旋结构通过局部调整来缓解这种效应，这些变化使DNA形成了精细的结构，它正是DNA发挥功能时相应蛋白因子与靶位点作专一性识别和结合的标志。 2.2.3 核酸的变性和复性 变性和复性是双链核酸分子的重要物理特性。双链DNA、RNA双链区、DNA与RNA杂种双链(hybrid duplex)以及其它异源双链核酸分子(hetero duplex) 都具有此性质。 2.2.3.1 DNA的变性(denaturation) 变性是DNA分子由稳定的双螺旋结构松解为无规则线性结构的现象。即维持双螺旋稳定性的氢键和疏水键的断裂。变性不涉及到其一级结构的改变。破坏双螺旋稳定性的因素都可使DNA变性.DNA分子中的碱基处于配对和不配对的动态平衡状态，很多因素会引起它向不配对方向转变，即引起DNA变性。 加热:高温(70?以上)可破坏碱基间的氢键。 离子强度:提高溶液的离子强度，可中和DNA分子链上磷酸基团的负电荷，降低它们之间的排斥力，稳定DNA的结构。 极端的pH值:pH，1时，DNA的磷酸二酯键会被水解;pH，11.3时，DNA的所有氢键断裂。 疏水作用:甲醇可增加碱基的溶解度，三氟醋酸钠可降低DNA分子的疏水作用，破坏双螺旋结构引起变性。 尿素及甲酰胺:它们可与碱基间形成氢键。 碱基堆积:氢键和碱基堆积是一致的，碱基堆积是一种协同作用，处于中间的碱基比两边的碱基稳定，线状双链DNA分子的两端常有7个未配对的碱基，因此少于15bp的双链DNA片段极不稳定。 变性导致DNA 一些理化及生物学性质改变变性DNA溶液粘度降低:DNA双螺旋是紧密的―刚性‖结构，变性后变成―柔软‖ 而松散的无规则单股线性结构，DNA粘度因此而明显下降。 增色效应或高色效应:(hyperchromic effect)是变性后DNA 溶液的紫外吸收作用增强的效应。变性后DNA在260nm下的紫外吸收光密度的观测值通常较变性前有明显增加。 DNA分子对紫外光的吸收峰在260nm。DNA分子中碱基间电子的相互作用是紫外吸收的结构基础，但双螺旋结构有序堆积的碱基又―束缚‖了这种作用。 变性DNA的双链解开，碱基中电子的相互作用更有利于紫外吸收，故产生增色效应。 不同来源DNA的变化不一，如大肠杆菌DNA经热变性后，其260nm的光密度值可增加40%以上，其它不同来源的DNA溶液的增值范围多在20~30%之间。 热变性使DNA分子双链解开所需温度称为熔解温度( melting temperature，简写Tm)。热变性是在很狭的温度范围内突发的跃变过程， 很像结晶达到熔点时的熔化现象，故名熔解温度。 以温度对DNA溶液的紫外吸光率作图，得到的典型DNA变性曲线呈S型。S型曲线下方平坦段，表示DNA的氢键未被破坏，待加热到某一温度处时，次级键突发断开，DNA迅速解链，同时伴随吸光率急剧上升，此后因―无链可解‖而出现温度效应丧失的上方平坦段。 Tm是被测DNA的50%发生变性(增色效应达到一半)时的温度。DNA本身性质决定了Tm (1)DNA的均一性:变性的DNA链各部分的氢键断裂所需能量较接近，Tm值范围较窄，反之亦然。样品DNA的组成是否均一:如样品中只含一种病毒DNA，Tm值范围较窄，若混杂其它DNA，则Tm值范围较宽。原因也与DNA的碱基组成有关。DNA分子中碱基组成的均一性:如人工合成的只含有一种碱基对的多核苷酸片段，比天然DNA的Tm值范围窄。因它在变性时的氢链断裂几乎可―齐同‖进行，故要求的变性温度更趋于一致。 (2)DNA的(G+C)含量:不同生物中(G+C)含量可从20%~80%。Tm值的高低取决于DNA分子中的(G+C)的含量。(G+C)含量越高，Tm值越高。G-C碱基对有3对氢键，A-T碱基对有2对氢键，DNA中(G+C)含量高能增强结构的稳定性，破坏G-C间氢键需比A-T氢键付出更多的能量，故(G+C)含量高的DNA，其变性Tm也高。 一定离子强度下(DNA溶于0.2mol/L NaCl): Tm与(G+C)含量(X) 的关系可用经验公式表示: X%(G+C)=2.44(Tm-69.3) 2.2.3.2 DNA的复性(renaturation) 变性DNA 在适当条件下，二条互补链全部或部分恢复到天然双螺旋结构的过程。热变性 DNA一般经缓慢冷却后即可复性，此过程称之为" 退火"(annealing)。 " 退火"也用以描述杂交核酸分子的形成。DNA的复性不仅受温度影响，还受DNA自身特性等其它因素的影响。 温度和时间:变性DNA溶液在比Tm低25?的温度下维持一段长时间，其吸光率会逐渐降低。将此DNA再加热，其变性曲线特征可以基本恢复到第一次变性曲线的图形。这表明复性是相当理想的。 一般认为比Tm低25?左右的温度是复性的最佳条件，越远离此温度，复性速度就越慢在很低的温度(如4?以下)下，分子的热运动显著减弱互补链结合的机会自然大大减少。维持在Tm以下较高温度，更有利于复性。复性时温度下降必须是一缓慢过程，若在超过Tm的温度下迅速冷却至低温(如4?以下)，复性几乎是及不可能的，核酸实验中经常以此方式保持DNA的变性(单链)状态。降温时间太短以及温差大均不利于复性。 DNA浓度:复性的第一步是两个单链分子间的相互作用―成核‖。这一过程进行的速度 DNA浓度的平方成正比。即溶液中DNA分子越多，相互碰撞结合―成核‖的机会越大。 DNA顺序的复杂性:简单顺序的DNA分子，如多聚(A)和多聚(T)这二种单链序列复性时，互补碱基的配对较易实现。顺序复杂的DNA，如小牛DNA的非重复部分，一般以单拷贝存在于基因组中，这种复杂特定序列要实现互补，显然要比简单序列困难得多。 复性过程可用二级反应动力学公式来处理: S+S‘=D S、S‘:单链互补DNA;D:双链DNA。根据二级反应动力学公式: C:t时间的单链浓度;k:速度常数;t:时间;Co:单链DNA初始浓度。 在一个指定实验中，Co是已知的，C可测定， 当有一半单链DNA复性时，即(1) 代入下式(2) 则:(3) 在复性实验中，若将初始浓度、温度、离子强度、片段大小都确定后，则唯一可变的因素就是顺序的复杂性。实验表明，速度常数k与DNA的复杂性N成反比: Cot1/2的大小代表了基因组的大小和DNA顺序的复杂程度。 原核生物基因组为非重复顺序，故以非重复核苷酸对表示的复杂性直接与基因组大小成正比，对于真核生物基因组中的非重复片段也是如此。在核酸复性研究过程中，确定一定的温度、离子强度、核酸片段大小等条件下，以C/Co 对Cot作图，可以得到Cot曲线。在 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 条件下(0.18ml/L阳离子浓度，400核苷酸的长的片段)测得的复性率达0.5时的Cot值称Cotl/2，它与核苷酸对的复杂性成正比。对于原核生物核酸分子， Cotl/2可代表基因组的大小及基因组中核苷酸对的复杂程度。真核基因组中因含有许多不同程度的重复序列(repetitive sequence)，所得到的Cot曲线很复杂。 2.2.4 核酸分子杂交 核酸分子杂交技术是目前分子生物学中应用很广的技术，它可以鉴定核酸分子之间的同源性，是分子克隆技术的重要组成部分。 分子杂交(简称杂交，hybridization) 是应用核酸分子的变性和复性的性质，使两条来源不同的具有一定同源性(即具有碱基互补关系)的DNA单链分子或DNA单链分子与RNA分子经退火形成双链DNA分子或DNA-RNA异质双链分子(heteroduplex)的过程。 杂交双链可以在DNA与DNA链之间，也可在RNA与DNA链之间形成。杂交首先透过加热或碱处理使双螺旋解开成为单链，然后在一定条件下使互补核酸链实现复性。 2.2.4.1 杂交分类: ?溶液杂交(solution hybridization):将不同来源的DNA变性后在溶液中进行杂交。 ?滤膜杂交(filter hybridization):用硝酸纤维素制造的滤膜，可以吸附单链DNA或RNA，可将变性的DNA或RNA吸附到膜上进行杂交。 ?探针(probe ):探针是一小段(十几至数百)用 32P、35S或生物素等标记了末端或全链的特异性多聚核苷酸单链。探针可与靶序列互补形成的杂交双链，以适当方法接受来自杂交链的信号，即可对靶序列DNA的存在及其分子大小加以鉴别。 放射性标记物 生物素标记:与dUTP的U的5位C相连，它可相当于dTTP的作用参入DNA。可利用抗生物素蛋白或链菌抗生物素蛋白-酶结合检测这些生物素标记的探针，通过硝酸纤维膜上的呈色区带或斑点可显示探针。 地高辛:与UTP的U的C5相连。碱性磷酸酶使BCIP(5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸)的吲哚环脱下的H还原NBT。 辣根过氧化物酶催化:AH2+H2O2®A+2H2O A:二氨基联苯胺(BAD，产物为红棕色沉淀)或四甲基联苯胺(TMB，产物为兰色)。 荧光素:荧光物质异硫氰酸荧光素(黄绿色)、试卤灵(红色)和羟基香豆素(兰色)等。用荧光素标记核酸;用荧光素标记抗生物素蛋白或抗地高辛抗体。 2.2.4.2 杂交方法及应用 ?Southern杂交分子杂交技术:以发明者Southern命名的分子杂交技术，是基因分离和鉴定的必不可少的手段，广泛用于遗传多态性分析。 DNA样品经限制性内切酶消化后，DNA片段在电泳凝胶中分离。凝胶经变性处理(加碱性缓冲液)，使其中的DNA双链分子变性成单链;利用毛细管作用原理将凝胶中的单链DNA分子转移并固定到固相支持物表面上(硝酸纤维素膜或尼龙膜)。此时DNA片段还保留着在凝胶中的分布图式。用探针与膜上的DNA片段杂交，根据与probe有同源性的DNA片段在膜上的位置可通过放射自显影而得知。Southern分子杂交技术灵敏度很高，可以检测出相当于人的基因组中只出现一次的DNA序列(10-6)。它与绘制的DNA物理图谱相结合，可以确定目的基因在图谱中的位置及其限制性酶切点位置。 ?Northern分子杂交技术:由于与Southern分子杂交技术类似而得名。 mRNA样品经电泳分离后，转移到硝酸纤维素膜(或叠氮化活性滤纸，尼龙膜)上，与放 射性标记的DNA探针进行杂交，经放射自显影，即可检测特异性mRNA分子在样品中存在与否，及其长度大小和量的多少。 与Southern分子杂交技术不同之处:Northern分子杂交技术用于检测特异性mRNA的存在。 用于研究特异性mRNA分子在细胞处于不同条件下发生量和质的变化，或不同组织器官中基因表达的差异。 ?Western 杂交技术 另一项与前两种相类似的技术称为Western蛋白质杂交技术。经分离的蛋白质被转移到硝酸纤维滤膜上，然后用放射性或酶标记的特异抗体来检测相应抗原(蛋白质)的存在。 Eastern 杂交技术 在现代分子生物学实验中，探针的制备和使用是与分子杂交相辅相成的技术手段。核酸分子杂交作为一项基本技术，已应用于核酸结构与功能研究的各个方面。在医学上，目前已用于多种遗传性疾病的基因诊断(gene diagnosis)，恶性肿瘤的基因分析。病原体的检测等领域中，其成果大大促进了现代医学的进步和发展。 2.2.5 DNA的超螺旋结构 2.2.5.1 超螺旋(superhelix or supercoil)的发现 1965年电镜发现SV40和多瘤病毒的环形DNA的超螺旋; 绝大多数原核生物DNA都是共价封闭环(covalently closed circle, CCC)分子， 双螺旋环状分子 噬菌体的DNA含48502bp，DNA与病毒粒子长度比为17.5/0.19。人单倍体细胞基因组含有3×109bp，一条染色体包含一条DNA双链分子，若将所有染色体(双倍体细胞)相连并充分伸展，长度达2m左右。如果设想将人体细胞中的DNA分子绕地球一周，那么，每个碱基大约只占1~5厘米，而一个2~3kb的基因只相当于地球上一条数十米长，数厘米宽的线段～ 巨大的DNA链必需高度压缩形成一定的高级结构，才能贮存于小小的细胞核中。 2.3.2 核小体是DNA在细胞中存在的形态 虽然游离DNA在能力学上趋向于形成松弛态，事实上，所有原核和真核生物的DNA都是以负超螺旋状态存在。在溶液中，DNA主要以相互盘绕的形态存在。 在细胞中DNA与蛋白质结合以螺旋管形态存在。这种形式对DNA的压缩作用更大。 2.3.2.1 染色质的化学组成 (1)DNA是染色质的主要化学成分，也是遗传信息的载体。它与组蛋白质相结合。 (2)染色体中的蛋白质 染色体上的蛋白质包括组蛋白和非组蛋白。组蛋白是染色体的结构蛋白，它与DNA组成核小体。 用2mol/L NaCl或0.25mol/L的HCl/H2SO4处理使组蛋白与DNA分开。 组蛋白为一类富含Arg和Lys的带正电荷(碱性蛋白)的小蛋白。分为H1、H2A、H2B、H3、H4共5种基本类型，其中H3、H4富含精氨酸，H1富含赖氨酸;H2A、H2B介于两者之间。 每种生物中的组蛋白差异很小。 ?组蛋白 所有真核生物染色体中均含有这五种组蛋白。组蛋白的含量与DNA含量之比约为1:1。 组蛋白在N-端皆含有数个Lys。它们的R基在生理条件下带正电，而DNA的磷酸根带负电，成为组蛋白与DNA结合之间的相互作用的主要化学力之一。 其它三种组蛋白在不同种属之间存在着较大的差异。组蛋白对染色体中DNA的包装有十分重要的作用。 组蛋白的一般特性 a 进化上的极端保守性。牛、猪、大鼠的H4氨基酸序列完全相同。牛的H4序列与豌豆序列相比只有两个氨基酸的差异。H3的保守性也很大，鲤鱼与小牛胸腺的H3只差一个氨基酸，小牛胸腺与豌豆H3只差4个氨基酸。 这种生物进化上的高度保守性预示着其功能的重要性。 b 无组织特异性。到目前为止，仅发现鸟类、鱼类及两栖类红细胞染色体不含H1而带有H5，精细胞染色体的组蛋白是鱼精蛋白。 c 肽链上氨基酸分布的不对称性。碱性氨基酸集中分布在N-端的半条链上。例如，N-端的半条链上净电荷为+16，C端只有+3，大部分疏水基团都分布在C-端。 组蛋白的修饰作用。包括甲基化、乙基化、磷酸化及ADP核糖基化等。 ?非组蛋白(non-histone protein，NHP)是染色体中组蛋白以外的其它蛋白质，它是一类种类繁杂的蛋白质的总称。估计总数在300~600之间， 它与基因表达及染色体高级结构的维持等有关。参与基因复制、转录及核酸修饰的酶类(如DNA和RNA聚合酶等)就是重要的非组蛋白。 非组蛋白的一般特性 染色体上除了存在大约与DNA等量的组蛋白以外，还存在大量的非组蛋白。 螺旋化成为超螺旋结构。超螺旋是双螺旋DNA进一步扭曲盘绕形成的三级结构。 有些单链环形染色体(如φ×174)或双链线形染色体(如噬菌体l)，在其生活周期的某一阶段，染色体也变为超螺旋结构。真核生物的染色体多为线形分子，但DNA均与蛋白质相结合，同样具有超螺旋形式。 2.2.5.2 超螺旋的形成 DNA双螺旋结构中，一般每转一圈有10个核苷酸对，平时，双螺旋总处于能量最低状态。若正常DNA双螺旋额外地多转或少转几圈，使每一圈的核苷酸数目大于或小于10，就会出现双螺旋空间结构的改变，在DNA分子中产生额外张力。若此时双螺旋的末端是固定的或是环状分子，双链不能自由转动，额外的张力不能释放，导致DNA分子内部原子空位置的重排，造成扭曲，出现超螺旋。 负超螺旋:形成超螺旋时，旋转方向与DNA双螺旋方向相反，旋转结果使DNA分子内部张力减小，称为松旋效应。在自然条件下共价封闭环状DNA呈负超螺旋结构。 正超螺旋:与负超螺旋相反，形成超螺旋时的旋转方向与DNA双螺旋方向相同，结果加大了DNA分子内部张力，有紧旋效应。 天然的DNA都呈负超螺旋，但体外可得到正超螺旋。 溴化乙锭(ethidium bromide)能与DNA紧密结合，使DNA的密度降低。它插入DNA分子碱基对之间，引起DNA分子松旋，随着EB量的增加，负超螺旋DNA就转变为松弛态;EB的进一步增加，DNA就转变为正超螺旋。 超螺旋使环状DNA分子变得更致密，在超速离心和在凝胶电泳中的迁移速度都增加。琼脂糖凝胶电泳可将超螺旋仅差一圈的DNA分离开。真核生物中，DNA与组蛋白八聚体形成核小体结构时，存在着负超螺旋。DNA拓扑异构酶可导致产生DNA超螺旋或消除超螺旋。 2.2.5.3 超螺旋的意义 ?超螺旋形式是DNA分子复制和转录的需要;生物体内DNA结构是处于动态之中。超螺旋的引入就提高了DNA的能量水平，而超螺旋程度的改变介导了DNA结构的变化。即超螺旋多余的能量可能使DNA双股链分开，或局部熔解。这种结构上的变化对DNA分子复制和转录等的启动很重要。 • ?超螺旋可使DNA分子形成高度致密的状态从而得以容纳于有限的空间。 DNA molecules are the largest macromolecules in the cell and are commonly packaged into structures called ―chromosomes‖, most bacteria & viruses have a single chromosome where as Eukaryotic cells usually contain many. 2.3 染色体结构 2.3.1 染色质的概念 狭义的概念染色体是指细胞分裂时出现核内的易被碱性染料着色的物质。广义的概念染色体指存在于病毒、细菌、真核生物及其细胞器内所含的核酸分子。染色体是由DNA、组蛋白和非组蛋白组成，是遗传信息或基因的载体，是遗传的主要物质基础。 染色体存在于细胞核中，经染色后可见细丝状颗粒物质，一般在细胞分裂时才能看到。 不同物种染色体数目不同，一般以2条成对的同源(homologous)染色体的形式存在，且数目恒定。人有23对(22对为常染色体，1对为性染色体) 46条染色体。 在分裂期间，染色体对可自身复制成含二个拷贝的姐妹染色体(sister chromatid)。 染色体在体细胞增殖时，以有丝分裂(mitosis)的方式，使姐妹染色体一分为二进入子代细胞，从而保证了染色体数目的恒定; 任何一条染色体上都带有许多基因，一条高等生物的染色体上可能带有成千上万个基因，一个细胞中的全部基因序列及其间隔序列统称为genomes(基因组)。 DNA是生物大分子。 ?组蛋白八聚体位于颗粒中央，外绕1.75圈左走向的DNA链，每圈约85bp，螺距2.8nm。组蛋白主要为α-螺旋，靠静电引力与DNA结合。 DNA小沟朝向组蛋白侧常含2~3个连续的AT，在大沟朝向组蛋白处常有2~3个GC，核小体常位于这种变形区内。处于DNA双螺旋的大沟中。 ?相邻核心颗粒由连接区DNA连接，其伸展长度约20nm，据认为天然状况下由于核小体是紧挨着的，此空间距离可能并不存在。H1结合在靠核心颗粒的连接区DNA上。 2.3.3 染色体的包装 细胞核DNA在双螺旋基础上的进一步结构变化，形成更高层次的超螺旋。使巨大的DNA链包装成染色体。 2.3.3.1 染色体DNA的一级包装——核小体 核小体是由直径2nm的DNA双螺旋链绕组蛋白形成直径11nm的核小体―串珠‖结构。 若以每碱基对沿螺旋中轴上升距离为0.34nm计，200bp DNA的伸展长度为68nm，形成核小体后仅为11nm，长度压缩了6~7倍。 2.3.3.2 二级包装——染色质螺线管 (chromatin solenoid) 念珠状染色质浓缩时，每一个核小体与一个H1结合(核小体纤维)，进一步盘绕形成一种中空螺线管，其外径为30nm，每圈含6个核小体。 在较高离子强度下，并保留H1，电镜可观察到10nm纤维会折转成较粗的30nm纤维，这就是染色体DNA的二级包装——螺线管纤维(solenoidal fiber)。 螺线管的形成使DNA一级包装又压缩了6倍。 对于充分伸展的DNA双螺旋，每个螺线管包含了408nm(6×68nm)长度的DNA链，而每圈螺线管的长度几乎等于核小体直径，即11nm，故染色体的二级包装相当于将DNA长度压缩了近40倍。 H1在维持毗邻核小体的紧密度及核小体纤维折转形成螺线管中起了重要作用。 2.3.3.3 三级包装——染色质纤维环 (loops of chromatin fiber) 染色质纤维环是在螺线管纤维基础上的更高一级包装。 螺线管纤维缠绕在非组蛋白构成的中心轴(central axis)骨架(支架蛋白质)上形成染色质纤维环。 螺线管纤维相隔一定间距的某些区段被"拉拢"固定在蛋白轴上，从而产生了许多从骨架上伸出的纤维环(loops)。 每个环的DNA长度约为75kb。主要的支架蛋白质包括拓朴异构酶II，它的功能是避免DNA形成缠结。 与支架蛋白质结合的DNA序列大部分是A和T，涵盖数百bp，称支架联结区(scaffold association region，SAR)，其分布密度与染色体的带状图形很有关系。 动物细胞中每个纤维环包含了50~100kb的DNA，这使螺线管纤维得到了较大程度的压缩。 纤维环的形成是基因表达较理想的结构，这些环状区是基因表达的活性单位所在。因为纤维环 a 非组蛋白的多样性。非组蛋白的量大约是组蛋白的60%,70%，但它的种类却很多，约在20-100种之间，其中常见的有15-20种。 b 非组蛋白的组织专一性和种属专一性。 几类常见的非组蛋白 a. HMG蛋白(high mobility group protein)。这是一类能用低盐(0.35mol/L NaCl)溶液抽提、能溶于2%的三氯乙酸、相对分子质量较低的非组蛋白，相对分子质量都在3.0×104以下。 b. DNA结合蛋白。用2mol/L NaCl除去全部组蛋白和70%非组蛋白后，还有一部分蛋白必须用2mol/L NaCl和5mol/L尿素才能与DNA解离。 这些蛋白分子量较低，约占非组蛋白的20%，染色质的8%。 2.3.2.2 核小体(nucleosome)的结构 (1)核小体的组分 用可使DNA降解的小球菌核酶(micro coccal nuclease)处理提取的染色质，可以得到单个的核小体颗粒。即核酸内切酶将颗粒之间 ―裸露‖的DNA(细线)切断了。 在一定酶切条件下，颗粒中所包含的DNA长度总是稳定在200bp左右。 DNA片段大小通过凝胶电泳鉴定，对染色质进行部分酶解处理，使之产生一系列不同长度的DNA片段，结果发现这些片段之间有一个共同的"阶差"，而此"阶差"值恰好等于单个核小体的DNA片段大小，即200nbp左右。 以密度梯度离心法制备核小体单体，对其中的蛋白质进行化学分析得知:每一个单体中含有H2A、H2B、H3和H4各2分子(它们构成一个8聚体)，1分子H1。 核小体多聚体的分析结果显示:相邻多聚体之间的DNA―阶差‖等于核小体单体中的DNA长度(200bp左右)，且多聚体分子量总是单体分子量的整倍数。 核小体是染色体的基本结构单位。 不同生物(或同种生物的不同细胞)的核小体，其DNA片段长度的有所差别。 一种细胞通常有特定的平均值，一般为180~200bp。每一核小体所含的DNA与组蛋白的量大致相等。 (2)核小体的结构 核小体由核心颗粒(coreparticie)和连接区DNA(linker DNA)组成。 核小体单体被小球菌核酸酶处理后，随着时间延长，其降解产物(DNA片段)会逐渐缩短，从200bp降至146bp，至此很难再进一步降解。这种稳定结构为核心颗粒，它是由146bp的DNA片段和H2A、H2B、H3和H4各2分子组成。 在DNA被降解至160bp以后，提取物中H1丢失，表明H1位于―裸露‖DNA与核心颗粒的毗邻区，即核心颗粒外，―裸露‖的DNA长度为60bp左右，称为连接区DNA。 连接区DNA的长度在不同物种差异较大，其范围在10~140bp。 核小体的结构 染色质中的DNA双螺旋链，等距离缠绕组蛋白8聚体形成众多核心颗粒，各颗粒之间为带有H1组蛋白的连接区DNA。这种组成染色质的重复结构单位就是核小体。 ?核心颗粒外观呈椭圆形，轴比为0.5，颗粒直径11nm，高5.5nm。绕颗粒的DNA长度为50nm(146bp)，连接区DNA长度为20nm(约60bp)。 DNA比其它区域有更伸展的结构。 2.3.3.4 染色体(chromosome)形成 染色质浓缩时，纤维环会再绕成直径600nm的螺旋。若用染料染色，即呈现观察到的染色体。 这种更高层次上的包装机理，目前尚无明确定论。 从螺线管纤维环到包装形成染色体是DNA压缩程度最高的阶段，估计在200~240倍。 经各级包装后染色体DNA总共被压缩了数千倍，这样才能使每个染色体中几厘米长(人染色体的DNA分子平均长度为4cm)的DNA分子容纳在直径数μm(人细胞核的直径为6-7μm)的细胞核中。 具环形区的螺线管纤维进一步以某种方式盘绕、折叠，最终完成细胞生长和繁殖的不同时期的染色体包装。 染色质基本单位的核小体。 由核小体螺旋化盘绕形成螺线管。 由螺线管纤维缠绕形成染色质纤维环。 由染色质纤维环会再绕成螺旋形成染色体。 DNA双螺旋结构模型的建立时即提出了DNA自我复制的可能机制:碱基互补 ——两条链互补，碱基配对—— 模板式复制。 DNA复制中的问题 1. 细胞中的DNA是在双链螺旋的基础上进一步与蛋白质形成染色质的高级结构形式存在，而复制只在单链进行。 2.在细胞周期中，DNA复制的起始和终止的调控。 3.DNA分子很长，复制起始是随机的，还是固定的, 4.不同DNA分子如环形、线形DNA复制如何终止。 5. DNA复制的酶和蛋白因子。 6. DNA复制的保真机制。 7. DNA序列多态性的形成机制。 8. DNA损伤及修复机制。 3.1 DNA复制概述 为了保证遗传的稳定性，在每次细胞分裂之前，遗传信息载体必须精确地复制自己。 3.1.1 DNA复制研究选材 原核细胞是研究DNA复制的最佳的实验系统。 ?细胞小，生活周期短，易在人工条件下培养，原核生物易获得各种突变体。 原核生物中的大肠杆菌是在各方面研究最深入的一种。 ?噬菌体(phage)是研究复制机制的 一个重要实验系统。 优点:基因组小，易操作;DNA分子有线形、环形、单链和双链形式，可代表不同类型DNA的复制。如:线型，θ式，D型等复制。 已研究过的典型噬菌体系统:Phage φx174, T4 3.1.2 DNA复制的半保留性 DNA复制(replication):在亲代双链DNA分子的每一条链上按碱基互补配对而准确地合成一条新的互补链，结果生成两个与亲代链相同的DNA双链的过程。 DNA复制的3种假说 ?半保留复制(semi conservation replication) 在复制过程中双螺旋解旋并分开，然后以每条链为模板，按碱基互补配对原则，由DNA聚合酶催化合成新的互补链，结果由一条链成为互补的两条链，这样新形成的两个DNA分子与原来的DNA分子的碱基序列完全相同。 由于每个子代DNA的一条链来自亲代DNA，另一条链则是新合成的。这种复制方式称为半保留复制。 ?半保留复制的证据 1958年Meselson和Stahl的同位素标记和密度梯度离心实验支持了半保留复制方式。 将大肠杆菌放在15NH4C1培养基中生长15代，使DNA被15N标记后，再将细菌移到只含有14NH4C1的培养基中培养。分别取0代、1代、2代、3代的细胞，提取DNA，进行密度梯度离心。 离心后从管底到管口DNA分子就停留在与其相当的CsC1密度处，紫外光下可以看到形成的区带。 14N-DNA密度较轻(1.7g/cm3)，停留在离管口较近的位置;15N-DNA密度较大停留在较低的位置。 3.2.3 DNA拓扑异构酶 3.2.4 引物酶 3.2.5 DNA聚合酶 3.2.6 DNA连接酶 DNA复制实际上就是DNA指导的DNA合成代谢，需要有DNA作为复制的模板。 体外复制实验证明，新合成DNA的特异性完全取决于事先加入的模板DNA。三磷酸核苷酸(dNTP)是合成原料。 细胞内还有许多酶和蛋白质参与DNA的复制。 3.2.1 解旋酶(Helicase) DNA复制时，解旋酶在ATP的作用下可促使DNA母链不断解开形成单链。 大肠杆菌中的解旋酶DnaB作为引发体的成员，参与复制叉的形成，并结合于一个复制叉，利用ATP水解的能量解开双螺旋，推动复制叉向前延伸。 3.2.2 单链DNA结合蛋白(SSB) 解旋酶沿复制叉方向推进产生了一段单链区，细胞内大量的单链DNA结合蛋白(single strand DNA binding protein SSB)能和单链DNA结合，防止其重新配对形成双链DNA。 单链结合蛋白通过与磷酸骨架结合使DNA单链相互分开，它们离开暴露的碱基，所以那些碱基可以作为DNA合成的模板。SSB与解旋酶不同，它不具备酶的活性。在大肠杆菌细胞中主要SSB是177肽所组成的四聚体，可以和单链DNA上相邻的32个核苷酸结合。 SSB的作用:使DNA单链保持一种伸展构象，作为模板;使解开的单链不形成发卡结构;保护DNA单链不受Dnase水解。 SSB结合DNA单链有协同性(cooperative binding):一个SSB四聚体结合于单链DNA上可以促进其他SSB四聚体现相邻的单链DNA结合。 3.2.3 DNA拓扑异构酶 (DNA Topisomerase) 拓扑异构体(topoisomer) :具有不同螺旋数的同一DNA分子两种异构体。 拓扑异构酶:可使DNA的两种拓扑异构体互变的酶。 DNA在细胞内以超螺旋状态存在，DNA拓扑酶催化同一DNA分子不同超螺旋状态之间的转变。 拓扑异构酶的功能:与DNA形成共价结合中间体，使DNA磷酸二酯键断裂，形成DNA nick，DNA的一条链进行解旋，旋转而改变DNA分子的拓扑状态。 拓扑异构酶可使DNA发生连环化(catenate)、脱连环化(decatenate)、打结(knot)和解结(unknot)。 拓扑异构酶参与DNA的复制、转录的重组等过程。 拓扑异构酶的种类分为?型和?型。 原核拓扑构酶?:MW=100kD，单肽链，含3~4个Zn。 作用是暂时切断一条DNA链，形成酶-DNA共价中间物而使超螺旋DNA松弛，然后再将切断的单链DNA连接起来。每次改变一个连环数。 原核拓扑构酶?作用机制: ?酶与DNA结合使双链解旋;?使一条链切开，但酶与切口的两端结合阻止了螺旋的旋转;?酶使另一条链经过缺口，然后再将两断端连接起来;?酶从DNA上脱落，两条链复原，得到的DNA比原来少一个负超螺旋。 拓扑异构酶? 当含有15N-DNA的细胞在14NH4C1培养液中培养一代后，只有一条区带介于14N-DNA与15N-DNA之间，表明DNA一条链来自15N-DNA，另一条链为含有14N的新合成链。 培养两代后则在14N-DNA区又出现一条带。 按照半保留复制方式培养两代，只能出现14N和14N/15N DNA两种分子，随着代数的增加14N-DNA逐渐增加。而14N-15NDNA区带逐渐减弱。 3.1.3 DNA复制过程的顺序性 3.1.3.1 边解链边复制 DNA的复制是边解链边合成 从SV40复制的早期电镜照片可见复制部分和未复制部分。 3.1.3.2 复制起点 DNA复制是从DNA分子上特定位置(原点，origin )开始，此位置称复制起点(Origin of replication，ori)。 3.1.3.3 复制方向 DNA可进行单向和双向复制，大多数DNA的复制是双向的。 放射性标记的不同密度可区别单向和双向复制。 ?双向复制:大多数DNA如此复制，两侧对称;双向不对称。 ?单向进行:两侧不对称，滚筒式属单向复制。 SV40为环形分子，5224bp，上有1个EcoR?切点。复制中，用EcoR?切复制中的SV40，得到复制眼大小不同的系列DNA分子，可见随复制眼扩大，两侧DNA变短， 说明 关于失联党员情况说明岗位说明总经理岗位说明书会计岗位说明书行政主管岗位说明书 复制从原点开始双向复制。 ?真核一般为多起点复制。 The position of the origin and the number of replicating forks determine the shape of a replicating restriction fragment, which can be followed by its electrophoretic path. DNA正在复制的分叉部位称为复制叉(replication fork) 非复制DNA的旁边复制的DNA在电镜下象只眼睛称复制眼(泡) 3.1.4 DNA的半不连续复制 DNA复制是半保留复制，且是半不连续复制(Semi-discontinuous replication) 。 DNA双螺旋的两条链是反向平行的，因此，在复制起点处两条DNA链解开成单链时，一条是5??3‘方向，另一条是3??5‘方向。 DNA复制时，新生链延伸方向一条为3??5‘，另一条为5??3‘。但生物细胞内所有催化DNA聚合酶都只能催化5??3‘延伸。 3.1.4.1 半不连续复制的证据 Okazaki(冈崎)于1968年通过H3–脱氧胸苷(H3–dT)标记实验证明了半不连续复制。 ?实验 材料 关于××同志的政审材料调查表环保先进个人材料国家普通话测试材料农民专业合作社注销四查四问剖析材料 T4感染的E.coli:野生型phage–T4;mutant T4(连接酶突变) ?实验系统 H3–dT标记E.coli ;phage–T4感染;密度梯度离心。检测标记DNA在不同时间合成的情况。 ?实验结果 ?短时间内，首先合成较短的DNA(冈崎片段)，接着出现较大分子DNA。 ? 突变型连接酶T4中，大片段DNA很少或无。 ?半不连续合成，放射性标记一半出现于短片段(冈崎片段)，另一半出现在长片段DNA中。 ?结论 DNA复制是半保留半不连续复制。 3.1.4.2 半不连续复制 在复制起点两条链解开形成复制泡(replication bubbles)，DNA向两侧复制形成两个复制叉(replication forks)。 以复制叉移动的方向为基准，一条模板链是3'?5'，以此为模板的新生DNA链合成沿5'?3'方向连续进行，这条链称前导链(leading strand)。 另一条模板链的方向为5??‘3?，以此为模板的新链合成方向也是5‘?3?，但与复制叉前进方向相反，且是分段的不连续合成，这条链称滞后链(lagging strand)，合成的片段为冈崎片段(Okaxaki fragments) 。 冈崎片段由DNA连接酶连成完整的DNA链。 前导链的连续复制和滞后链的不连续复制，称为DNA合成的半不连续复制。 3.1.5 复制子 DNA复制从起点开始双向进行直到终点为止。 ?复制子 复制子或复制单元(replicon)是基因组中具有一个复制起点( origin，ori)和一个复制终点(terminus，ter)并能在细胞中自主复制的单位。 ?原核生物中，只有一个复制原点，每个DNA分子上只有一个复制子; ?真核生物中，每个DNA分子有多个复制子，每个复制子长约50-200kb;其DNA复制是由多个复制子共同完成的。 每个细胞中，染色体DNA复制子一般只复制一次。 大肠杆菌DNA复制1次需42min;人类复制叉前进100bp/s，复制整个基因体需8hr;果蝇复制整个基因体仅需3~4分钟。 ?染色体外遗传元件的复制子 染色体外遗传元件包括:原核生物细胞中的质粒和噬菌体;真核生物细胞中的线粒体、叶绿体和病毒的DNA。 ,但为多次复制，为多拷贝。 染色体外遗传元件一般为单复制子(只有一个origin) 真核生物的线粒体和叶绿体复制一般与核DNA同步或稍滞后;原核生物的染色体DNA和质粒(噬菌体)一般不同步，但整合后同步。 质粒整合前为è式或滚筒式复制，整合后为一个复制子。 质粒为双向复制。 E.coli温敏型突变体在30?复制正常，42?时，E.coli复制起动受阻，而以质粒origin开始的单向复制。说明复制起始是受调控的。 3.2 DNA的复制酶和相关蛋白 3.2.1 螺旋酶 3.2.2 单链DNA结合蛋白 拓扑异构酶?也称旋转酶。广泛存在于各种生物中。使正超螺旋转化为负超螺旋，每次改变两个连接数。 大肠杆菌中的DNA旋转酶(DNA gyrase)，能将负超螺旋引入DNA分子，在ATP供能时酶能暂时性地切断和重新连接双链DNA。 几乎所有天然状态的双链DNA均以负超螺旋的方式存在，特别是进行半保留复制的DNA均以种种拓扑异构体的形式存在。 负超螺旋是DNA复制的必需条件，负超螺旋可使DNA双链碱基对打开所需要的能量降低4.1KJ/mol，因而，有利于DNA的双链分开。 真核生物拓扑异构酶 酵母、两栖类动物、昆虫、哺乳动物和植物的拓扑异构酶的特性相似，但与原核的酶有明显差异。 ?型:MW=95kD，单体蛋白，不需ATP。 ?型:MW=150~180kD，均为二聚体，需ATP和Mg2+。 3.2.4 引物酶(Primase) 引物酶以单链DNA为模板，利用核糖核苷酸合成RNA作为DNA合成的引物。 引物的意义在于减少致死突变。DNA合成中最初几个核苷酸正确性远比其后的低。引物RNA 随后被降解，从而减少了复制错误。 DNA合成以RNA为引物的实验证据 Reiji 以á–32P–NTP 标记，未标记dNTP为底物。引发合成后，用稀碱处理。 32P出现在水解产物中(RNA水解)，证明RNA为引物。 引物酶催化引物RNA分子的合成，但它不同于RNA聚合酶。引物酶对 利福平()不敏感，而RNA聚合酶则敏感;引物酶只在复制起点处合成RNA引物而引发DNA的复制，而RNA聚合酶则是启动DNA转录合成RNA从而将遗传信息由DNA传递到RNA。 大肠杆菌的引物酶由一条多肽链组成，MW为60KD，每个细胞中有50~100个分子，由大肠杆菌的dnaG基因编码。 但在单链噬菌体M13 DNA和质粒Co1E1 DNA复制时，引物的合成是由RNA聚合酶催化的。 噬菌体T7的Gene4蛋白，T4的Gene41和61蛋白等也具有引物酶的活性和具有大肠杆菌引物酶相似的功能。 3.2.5 DNA聚合酶(DNA Polymerase) DNA聚合酶的性质 ?以脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)为前体催化合成DNA; ?需要模板和引物的存在; ?不能起始合成新的DNA链; ?催化dNTP加到生长中DNA链的3?-OH末端; ?催化DNA合成的方向是5'?3'。 原核DNA聚合酶有三种:DNApolymerase?、DNApolymerase ?和DNApolymerase ? DNA pol的发现 1956年，Kornberg用无细胞E.coli系统证明DNA是模板合成。 1957 年发现DNApol?。 3.2.5.1 大肠杆菌DNA polymerase (pol?) 1956年Kornberg发现DNA聚合酶，又称Kornber酶。 此酶已经研究清楚且代表了其他DNA聚合酶的基本特点。 ?酶的性质 DNA pol?由一条多肽链组成，约含1000个氨基酸残基，MW为109KD。分子含有一个二硫键和一个SH基。每个分子中含有一个Zn2+，在DNA聚合反应起着很重要的作用。 每个大肠杆菌细胞中含有约400个分子，每个分子37?下能催化667nt/min掺入正在生长的DNA链。 DNA pol?可被枯草杆菌蛋白酶裂解成2个片段，大片段MW为76KD，称为Klenow片段，具聚合酶和3‘?5‘外切酶的活性，由两个结构域组成。 小片段的MW为34KD，具有5‘?3‘外切酶活性。 Some DNA polymerases have a common structure DNA Pol?在空间结构上近似球体，直径约65Å，在酶的纵轴上有一个约20Å的深沟(cleft)，带有正电荷，是酶的活性中心位置。 酶的活性中心位置上至少有6个结合位点: a. 模板DNA结合位点; b. DNA生长链或引物结合位点; c. 引物末端结合位点; d. 脱氧核苷三磷酸结合位点; e. 5??3‘外切酶活性位点，用以结合生长链前方的5?-端脱氧核苷酸并切除之; f. 3'?5'外切酶活性位点，用以结合和切除生长链上未配对的3'-端核苷酸。 ?功能 a. 聚合作用 在引物的3?-OH末端，以dNTP为底物，按模板DNA上的指令由DNA pol?逐个聚合上核苷酸。 酶的专一性主要表现为新进入的脱氧核苷酸必须与模板DNA配对时才有催化作用。dNTP进入结合位点后，可能使酶的构象发生变化，促进3‘-OH与5?-PO4结合生成磷酸二酯键。 b. 3??5‘外切酶活性(校对作用) 3??5‘外切酶活性是从3??5‘方向识别和切除不配对的DNA生长链末端的核苷酸。 错误核苷酸进入pol?的结合位点不能与模板配对，无法改变酶的构象而被3'?5'外切酶活性位点所识别并切除。 在T4噬菌体突变株中分离得到的T4 DNA聚合酶的3??5‘外切酶活性很低，使DNA复制的真实性降低，而易发生突变。 具有抗突变能力的T4突变株中的DNA聚合酶的3??5‘外切酶活性比野生型高得多，因此，其DNA复制真实性好，变异率低。 3‘?5?外切酶活性的主要功能是校对作用。维持了DNA复制真实性。 c. 5??3‘外切酶活性(切除修复作用): 5??3‘外切酶活性是从5??3‘方向水解DNA生长链前方的DNA链。它只作用具切口的双螺旋 1956年，Kornberg用无细胞E.coli系统证明DNA是模板合成。 1957 年发现DNApol?。 3.2.5.1 大肠杆菌DNA polymerase (pol?) 1956年Kornberg发现DNA聚合酶，又称Kornber酶。 此酶已经研究清楚且代表了其他DNA聚合酶的基本特点。 ?酶的性质 DNA pol?由一条多肽链组成，约含1000个氨基酸残基，MW为109KD。分子含有一个二硫键和一个SH基。每个分子中含有一个Zn2+，在DNA聚合反应起着很重要的作用。 每个大肠杆菌细胞中含有约400个分子，每个分子37?下能催化667nt/min掺入正在生长的DNA链。 DNA pol?可被枯草杆菌蛋白酶裂解成2个片段，大片段MW为76KD，称为Klenow片段，具聚合酶和3‘?5‘外切酶的活性，由两个结构域组成。 小片段的MW为34KD，具有5‘?3‘外切酶活性。 Some DNA polymerases have a common structure DNA Pol?在空间结构上近似球体，直径约65Å，在酶的纵轴上有一个约20Å的深沟(cleft)，带有正电荷，是酶的活性中心位置。 酶的活性中心位置上至少有6个结合位点: a. 模板DNA结合位点; b. DNA生长链或引物结合位点; c. 引物末端结合位点; d. 脱氧核苷三磷酸结合位点; e. 5??3‘外切酶活性位点，用以结合生长链前方的5?-端脱氧核苷酸并切除之; f. 3'?5'外切酶活性位点，用以结合和切除生长链上未配对的3'-端核苷酸。 ?功能 a. 聚合作用 在引物的3?-OH末端，以dNTP为底物，按模板DNA上的指令由DNA pol?逐个聚合上核苷酸。 酶的专一性主要表现为新进入的脱氧核苷酸必须与模板DNA配对时才有催化作用。dNTP进入结合位点后，可能使酶的构象发生变化，促进3‘-OH与5?-PO4结合生成磷酸二酯键。 b. 3??5‘外切酶活性(校对作用) 3??5‘外切酶活性是从3??5‘方向识别和切除不配对的DNA生长链末端的核苷酸。 错误核苷酸进入pol?的结合位点不能与模板配对，无法改变酶的构象而被3'?5'外切酶活性位点所识别并切除。 在T4噬菌体突变株中分离得到的T4 DNA聚合酶的3??5‘外切酶活性很低，使DNA复制的真实性降低，而易发生突变。 具有抗突变能力的T4突变株中的DNA聚合酶的3??5‘外切酶活性比野生型高得多，因此，其DNA复制真实性好，变异率低。 3‘?5?外切酶活性的主要功能是校对作用。维持了DNA复制真实性。 c. 5??3‘外切酶活性(切除修复作用): 5??3‘外切酶活性是从5??3‘方向水解DNA生长链前方的DNA链。它只作用具切口的双螺旋 a 130 ε 27.5 θ 10 τ 71 γ 47.5 δ 35 δ‘ 33 × 15 Ö 12 β 40.6 层次 持续性 刺激因子 pol ? 10 无 pol ?‘ 60 亚精胺 pol ?* 200 SSB 全酶 ，105 SSB pol ?全酶的结构是一种非对称二聚体。 pol ? 在细胞内数量少(每个大肠杆菌细胞中只有10~20个酶分子)，但催化dNTP掺入 DNA链的速率是DNA pol?的15倍。 pol?具有聚合酶和3??5‘外切酶活性。 pol ?是细胞内DNA复制所必需的酶，缺乏该酶的温度突变株在限制温度(non permissive temperature)内是不能生长的，此种突变株的裂解液也不能合成DNA，但加入pol ?则可 以恢复其合成DNA的能力。 3.2.6 DNA连接酶(DNA ligase ) DNA在随后链上的复制是不连续的，合成的DNA片段需要连接酶连接。 DNA连接酶的主要功能是借助ATP或NAD水解提供的能量，催化双链DNA上的单链间隙 的5?-端与3‘-端生成磷酸二酯键，封闭DNA双链上的缺口。 DNA连接酶的作用条件 ?被连接的两链必须与另一链(模板链)互补; ?两链相邻; ?每次只能连接一个切口; ?使一条链的5′-P与另一链的3′-OH形成磷酸二酯键。 ?连接能量来自NAD(如E.coli或T4诱导的连接酶，动、植物中的酶)。 ?缺口缺失核苷酸不连接。 连接酶作用机制 ¢ÙNAD+»òATP½«ÆäÏÙÜÕõ£»ùתÒƵ½DNAÁ& frac12;ÓøµÄÒ»¸öÀ& micro;??Ëá²Ð»ùµÄå-??»ùÉÏ¡£ ¢Úø-ÏÙÜÕËáÖÐ&fra c14;äÎïÉϵÄÏÙÜÕ&ot ilde;£»ùתÒƵ½DNAµÄ5?-&Aa cute;×Ëá»ùË。 ¢Û?»¼?»îµÄ5?-Á×õ&poun d;»ù˺ÍDNAµÄ3‘-OHË生成 Á×Ëáþõ¥¼ü¡£ DNA连接酶催化的连接反应是可逆的。逆反应过程可在AMP存在时，使共价闭环超螺旋DNA产 生有缺口的DNA-腺苷酸，生成松弛的闭环DNA。 大肠杆菌的DNA连接酶(MW 75KD)被胰蛋白酶水解形成的小片段仍具有部份活性，可以催化酶与NAD(不是ATP)反应形成酶-AMP中间物，但不能继续将AMP转移到DNA上促进磷酸二酯键的形成。 大肠杆菌细胞中约有300个分子的DNA连接酶。与DNA聚合酶?的分子数相近。 连接酶在DNA复制、修复和重组中起重要作用，连接酶有缺陷的突变株不能进行DNA复制、修复和重组。 在真核生物细胞中的DNA连接酶，分为连接酶?和?，反应中利用ATP所提供的能量。 DNA连接酶?分子量约为200KD，主要存在于生长旺盛细胞中， DNA连接?分子量约85KD，主要存在于生长于不活跃的细胞中(resting cell)。 在DNA复制过程中还有许多蛋白质参与，如大肠杆菌细胞中就有三十多种蛋白质参与DNA复制，许多蛋白质的功能目前尚不明了。 DNA复制过程中还有许多未知的因子参与，DNA复制过程中许多具体的细节尚不十分清楚。 T4Ligase 特性 ?可连接DNA与DNA，也可连接RNA与RNA。 ?可连接DNA中的单链切口，也可连接粘性末端切口和平齐末端切口。 T4Ligase 可作为重组工具酶。 3.3 原核生物的DNA复制 3.3.1 原核DNA复制概况 3.3.2 DNA复制的引发 3.3.3 DNA链的延伸 3.3.4 DNA复制的终止 3.3.1 原核生物DNA的复制概况 尽管原核生物是较简单的单细胞生物体，但其复制过程很复杂，并且是一个顺序性过程，涉及到多种酶和蛋白因子，是这些酶和蛋白因子协同作用的结果。 对E.coli DNA复制机制的认识是利用E.coli突变体和öx174的复制进行初步研究的结果。 研究方法:?获得突变体，对突变基因研究获得其功能;?反义RNA基因工程;?点突变基因工程。 大肠杆菌复制基因 利用噬菌体研究原核DNA复制 噬菌体DNA有线型、环型、单链、双链，其复制机制可表明各种形式的DNA复制模式;噬菌体利用寄主的基因产物进行复制，复制行为与寄主相似。 öx174的复制模式 Φx174的DNA复制除模板外，复制系统均由寄主提供。 Φx174(+)链(SS)®合成öx174(-)链，形成RF öx174(SS?RF) ®RF繁殖(RF?RF) ®新的öx174(+)链产生(RF ? SS) 3.3.1.1 fX174的(,)链合成(SS?RF) ?fxl74的(+)链进入寄主细胞，除分子中的发夹结构外，其它部分被SSB覆盖。(,)链合成(SS? RF) 需引物体(primosome)参与。 在基因F和G间的70nt片段是引物体组装位点(primosome assembly site，pas)，pas形成44nt组成的发夹结构可被PriA识别，在PriB和PriC参与下形成复合物。 ?由PriA、PriB和PriC组成的复合物与DnaT、DnaB和DnaC组装成预引物体(preprimosome)。其中DnaB和DnaC形成由ATP稳定化的B6C6复合物。预引物体与引物酶结合成引物体。 ?PriA利用ATP使引物体在(+)链上沿5‘?3‘移动。 ?引物体在(+)链上随机选定的位置从3‘?5‘移动，并在多个位置合成RNA引物。DnaB有依赖于DNA的ATP酶活性，它驱动引物体在ssDNA上的移动，但方向与PriA相反。 ?Pol?全酶从引物延伸合成DNA片段。 ?Pol?切除RNA引物填补缺口，连接DNA片段。形成的双链DNA称为RF。 引物体继续与DNA相结合以备参与(+)链的合成。 fxl74(,)链合成是不连续的。 3.3.1.2 fX174的(+)链合成(RF?SS) (+)链合成涉及噬茵体编码的gpA和大肠杆菌的Rep。gpA(60kD)对 (+)链原点具有专一性的核酸内切酶活力。gpA的功能是引发复制起始。 ?gpA借引物体结合于识别位点，专一性切割4305和4306间的磷酸二酯键产生切口。gpA通过其酪氨酸残基与4306位5‘端结合，保存链能。 ?Rep蛋白结合于gpA处的(,)链。Rep蛋白从(+)链使gpA复合物从(+)链的5′端开始使双链DNA解链，分离出的(+)链被SSB保护。 ?pol?全酶从(+)链3‘端使DNA链不断延伸，形成环化的滚环结构(looped rolling structure)。而原来的(+)链在复制叉移动时仍与gpA相连，如同逐步被剥离。 ?复制绕(,)链超过完整一周后产生1个双股复制原点，gpA在此再做专一切割，再与新形成的5?端共价结合，gpA的第2次切割产生单位长度的fX174 DNA，它的3‘-OH向gpA5‘-P 做亲核攻击形成环状分子(+链)。 每个gpA分子含2个活性酪氨酸，故可完成相继地切割，并与5?-端相连。 在由fx174感染的中期，每个新合成的(+)链指导(,)链合成从而形成RP。在感染的后期，新合成的(+)链通过噬菌体编码的病毒成熟蛋白和衣完蛋白(gpB、E、D、F、G和H)形成新的病毒粒子。 -)链合成为随后链复制模式。可用于研究E.coli 随后链的合成机制，不连续öx174( 合成。 öx174(+)链合成为主导链复制模式。可用于研究E.coli 主导链的合成机制。连续合成。 大肠杆菌基因组是双股环形DNA，其复制是由单一原点(origin)开始的q式复制。 origin处形成复制叉，经过先导链的连续复制和滞后链的不连续复制，到达终点完成复制。 3.3.2 DNA复制的引发 E.coli的DNA复制起始指从origin(原点)开始的 起始过程，这一过程不同于随后链上冈崎片段的起始。 DNA复制的引发包括:起始识别?解链? 解旋? 引发体组装。 3.3.2.1 复制原点(origin) DNA复制不是随机的从DNA分子上的任何一点起始，而是从特定的区域开始。 大肠杆菌的复制起始点(oriC)位于其基因组天冬酰胺合成酶和ATP合成酶操纵子间，oriC包含245bp。 ori的特性 复制起点几乎都是富含A-T的序列; 已经分离出大肠杆菌染色体DNA复制起点oriC。由245bp的DNA片段组成。 oriC含有2个系列的重复单位，其中有3个13bp重复序列和4个9bp重复序列，均富含AT。 ori在所有细菌复制起始位点中都是保守的 oriC在不同原核生物中有同源性，很多细菌的ori区在结构上相似，在核苷酸序列上有相当的保守性，且在分类关系上愈接近的细菌间其同源性愈高，表明DNA复制起点的重要性。 将一个复制起点连接到任一DNA上，都能支持其复制。 9bp(A位点)为DnaA蛋白识别位点。 3.3.2.2引发体的形成 复制开始的是形成引发体，这需要很多蛋白因子的参与。 ¢ÙDnaA蛋白识别起始序列并结合于oriC的9bp重复序列，形成oriC负超螺旋包裹在外，20~40个DnaA蛋白在内的复合物。 ? HU蛋白参与并促进DnaA蛋白识别3个13bp串联重复序列使DNA熔链形成开放复合物。 用核酸酶P1 (作用ssDNA)证明解链部分约为45bp。 ?DnaB和DnaC(引发体成员)蛋白进入熔链区形成前引物复合体。 ?SSB结合在被解开的单链上，由PriA、PriB、PriC、dnaT、dnaB和dnaC等6种蛋白质组成引发前体(preprimosome)。 ¢ÝÒý?¢Ç?Ìå½ø&Ogr ave;»²½ÓëÒýÎïø ;(DnaG， primase)×é×?³ÉÒý?¢Ìå(primosome)&iexc l;£ ?在SSB和旋转酶(拓扑异构酶)的参与下，引发体可在单链DNA上移动，在DnaB亚基的作用下识别DNA复制起点位置。引发体先在前导链上由引物酶催化合成RNA引物，此过程称为转录激活(transcriptional activation)。 ?DNA pol? 组装和复制叉上二聚体形成。 ?引发体在滞后链上沿5??3‘方向相对移动，并在模板链上断断续续地引发生成滞后链的引物RNA，供DNA聚合酶?合成冈崎片段使用。在RNA引物3′端DNA开始聚合。 许多因子协同作用才使引发体在滞后链上移动，识别合适的引物合成位置，并将核苷酸在引发位置上聚合成RNA引物。 在同一种生物体细胞中这些引物都具有相似的序列，表明引物酶要在DNA滞后链模板上比较特定的位置(序列)上才能合成RNA引物。 RNA引物形成后，DNA pol ?的亚基组装成非对称DNA聚合酶?二聚体，它催化将第一个脱氧核苷酸按碱基互补原则加在RNA引物3'-OH端而进入DNA链的延伸阶段。 3.3.3 DNA链的延伸 3.3.3.1 正超螺旋的消除 螺旋酶在复制叉处边移动边解开双链，DNA聚合酶?催化DNA新生链的合成。 DNA解链时必产生正超螺旋，当达到一定程度后就会造成复制叉难以继续前进而终止DNA复制。而细胞内DNA复制不会因出现拓扑学问题而停止。 解除正超螺旋的机制 ?DNA在生物细胞中本身就是负超螺旋，当DNA解链而产生正超螺旋时，可以被原来存在的负超螺旋所中和。 ?DNA拓扑异构酶?可打开一条链，使正超螺旋状态转变成松弛状态;同时DNA拓扑异构酶?(旋转酶)也可以在复制叉前方地将负超螺旋引入双链DNA。 3.3.3.2 复制体(replisome)的形成 DNA复制体是在复制叉附近，由DNA pol?二聚体、引发体和DnaB等构成的类似核糖体大小的复合体。 复制体在DNA前导链模板和滞后链模板上移动时便合成了连续的DNA前导链和由许多冈崎片段组成的滞后链。 不同系统(噬菌体、E.coli、动物、植物病毒)中的复制体组分虽有差异，但功能相似。 复制体包括Ori的复制体(主导链和随从链的是否相同)和复制起始后延伸过程的复制体两种。 延伸过程的复制体为非对称的DNApol ? 二聚体、DnaB、 随从链上的SSB 和引发体等组成。 3.3.3.3 DNA链的延伸 前导链和滞后链由同一pol ? 二聚体延伸。 前导链的合成:由DnaG(primase)在复制起始位点附近合成1个10~60 nt的RNA引物，然后由pol ?把dNTP加到该引物上。 滞后链的合成:产生Okazaki fragments，消除RNA引物并由DNA pol I补上一小段DNA序列，由DNA Ligase把两个片段相连。 DNA滞后链与主导链合成的不同步 在DNA复制叉处由一个非对称DNA pol?二聚体，同时分别进行复制DNA前导链和滞后链。 位于滞后连的引发体，在合成引物后DnaG可将模板链提起(或成环)，使RNA引物3′端位于pol ?处，然后再折向与未解链的双链DNA在同一方向上，则滞后链的合成可以和前导链的合成在同一方向上进行。 pol ? 的每一个催化中心合成一个子链。DnaB负责在复制叉上向前移动。引发体拖着一条DNA链通过。 DNA pol?沿着滞后链模板催化在RNA引物上聚合DNA链。滞后模板链被SSB结合，随冈崎片段延伸priA可利用ATP供能除去SSB。 当合成的DNA链到达前一次合成的冈崎片段的位置时，滞后链模板及新合成的冈崎片段便从DNA聚合酶?上释放出来。 复制叉不断迁移便又产生了一段滞后链模板，它重新环绕pol?，并合成冈崎片段。 因此，前导链合成不会超过滞后链太多。且这样引发体在DNA链上和pol?同速移动。 当冈崎片段形成后，DNA pol?通过其5??3‘外切酶活性切除冈崎片段上的RNA引物;同时，利用后一个冈崎片段作为引物合成DNA。 最后的缺口由DNA ligase连接形成完整的滞后链。 DNA复制过程 在复制叉形成复制体(DnaB、â亚基与DNA结合，引发体形成，2×pol ?复合体形成) 3.3.4 DNA复制的终止 3.3.4.1 E.coli DNA复制的终点 在DNA上存在着复制终止位点，复制叉在此位点相遇(forks meet)。 E.coli的DNA复制终点序列(23bp): AATTAGTATGTTGTAACTAAAGT TTAATCATACAACATTGATTTCA 终止序列可被tus蛋白(tus基因编码)识别，并结合于其上(它只让一侧复制叉通过)，使DNA复制在终止位点终止。 E.coli的两个复制叉在相距终点100kb时，复制速度减慢，从而协调2个复制叉到达的时间。 终止的调节:在终止点Forks meet 两侧各有几个短序列，如:terE、D、A;terC、B。当一侧复制叉前进的快，而另一侧前进的慢时，快侧复制酶则会在ter位点停止，等待直到慢侧跟上时。似乎构成一个―replication fork trap‖ 3.3.4.2 DNA复制后的末端问题 DNA复制时，当RNA引物被切除后，中间所遗留的间隙由DNA聚合?所填充。 而线性DNA分子以5'?3'为模板的滞后链的合成，末端的RNA引物被切除后是无法被DNA聚合酶所填充的。 ?T7-DNA复制方式 T7-DNA两端的DNA序列区有160bp长的序列完全相同。 T7-DNA复制时，产生的两个子代DNA的3‘-端尾巴以互补结合。再由DNA pol?填充和DNA连接酶连接后，形成2个单位长度的T7-DNA分子。 这样复制下去，便可形成多个单位长度的T7DNA分子。 这样的T7-DNA分子可被特异的内切酶切开，用DNA pol?填充，形成与亲代DNA完全一样的双链T7DNA分子。 ?痘病毒DNA的复制 痘病毒DNA在两端都形成发夹环状结构。DNA复制时，在线性分子中间的一个复制起点开始，双向进行，将发夹环状结构变成双链环状DNA。 在发夹中央将不同DNA链切开，使DNA分子变性，双链分开。在每个分子两端形成单链尾端，再以自我互补，形成完整的发夹结构，与亲代DNA分子一样。 环状DNA的复制的末端终止阶段则不存在问题。 环状DNA复制到最后，由DNA拓扑异构酶?切开双链DNA，将两个DNA分子分开成为两个完整的与亲代DNA分子一样的子代DNA。 3.3.5 DNA复制的保真机制 在长期的进化中，DNA复制过程形成了一系列保真机制，保证复制准确和遗传稳定。 E.coli每复制109~1010nt便出现1个误差。由于E.coli DNA有4.5×106bp，这样每1000个细胞经过1次分裂会产生1个错误核苷酸。 单纯以碱基对原则维持其DNA复制准确性时么误差出现的频率为10-4~10-5。 最后的缺口由DNA ligase连接形成完整的滞后链。 DNA复制过程 在复制叉形成复制体(DnaB、â亚基与DNA结合，引发体形成，2×pol ?复合体形成) 3.3.4 DNA复制的终止 3.3.4.1 E.coli DNA复制的终点 在DNA上存在着复制终止位点，复制叉在此位点相遇(forks meet)。 E.coli的DNA复制终点序列(23bp): AATTAGTATGTTGTAACTAAAGT TTAATCATACAACATTGATTTCA 终止序列可被tus蛋白(tus基因编码)识别，并结合于其上(它只让一侧复制叉通过)，使DNA复制在终止位点终止。 E.coli的两个复制叉在相距终点100kb时，复制速度减慢，从而协调2个复制叉到达的时间。 终止的调节:在终止点Forks meet 两侧各有几个短序列，如:terE、D、A;terC、B。当一侧复制叉前进的快，而另一侧前进的慢时，快侧复制酶则会在ter位点停止，等待直到慢侧跟上时。似乎构成一个―replication fork trap‖ 3.3.4.2 DNA复制后的末端问题 DNA复制时，当RNA引物被切除后，中间所遗留的间隙由DNA聚合?所填充。 而线性DNA分子以5'?3'为模板的滞后链的合成，末端的RNA引物被切除后是无法被DNA聚合酶所填充的。 ?T7-DNA复制方式 T7-DNA两端的DNA序列区有160bp长的序列完全相同。 T7-DNA复制时，产生的两个子代DNA的3‘-端尾巴以互补结合。再由DNA pol?填充和DNA连接酶连接后，形成2个单位长度的T7-DNA分子。 这样复制下去，便可形成多个单位长度的T7DNA分子。 这样的T7-DNA分子可被特异的内切酶切开，用DNA pol?填充，形成与亲代DNA完全一样的双链T7DNA分子。 ?痘病毒DNA的复制 痘病毒DNA在两端都形成发夹环状结构。DNA复制时，在线性分子中间的一个复制起点开始，双向进行，将发夹环状结构变成双链环状DNA。 在发夹中央将不同DNA链切开，使DNA分子变性，双链分开。在每个分子两端形成单链尾端，再以自我互补，形成完整的发夹结构，与亲代DNA分子一样。 环状DNA的复制的末端终止阶段则不存在问题。 环状DNA复制到最后，由DNA拓扑异构酶?切开双链DNA，将两个DNA分子分开成为两个完整的与亲代DNA分子一样的子代DNA。 3.3.5 DNA复制的保真机制 在长期的进化中，DNA复制过程形成了一系列保真机制，保证复制准确和遗传稳定。 E.coli每复制109~1010nt便出现1个误差。由于E.coli DNA有4.5×106bp，这样每1000个细胞经过1次分裂会产生1个错误核苷酸。 单纯以碱基对原则维持其DNA复制准确性时么误差出现的频率为10-4~10-5。 最后的缺口由DNA ligase连接形成完整的滞后链。 DNA复制过程 在复制叉形成复制体(DnaB、â亚基与DNA结合，引发体形成，2×pol ?复合体形 成) 3.3.4 DNA复制的终止 3.3.4.1 E.coli DNA复制的终点 在DNA上存在着复制终止位点，复制叉在此位点相遇(forks meet)。 E.coli的DNA复制终点序列(23bp): AATTAGTATGTTGTAACTAAAGT TTAATCATACAACATTGATTTCA 终止序列可被tus蛋白(tus基因编码)识别，并结合于其上(它只让一侧复制叉通过)，使DNA复制在终止位点终止。 E.coli的两个复制叉在相距终点100kb时，复制速度减慢，从而协调2个复制叉到达的时间。 终止的调节:在终止点Forks meet 两侧各有几个短序列，如:terE、D、A;terC、B。当一侧复制叉前进的快，而另一侧前进的慢时，快侧复制酶则会在ter位点停止，等待直到慢侧跟上时。似乎构成一个―replication fork trap‖ 3.3.4.2 DNA复制后的末端问题 DNA复制时，当RNA引物被切除后，中间所遗留的间隙由DNA聚合?所填充。 而线性DNA分子以5'?3'为模板的滞后链的合成，末端的RNA引物被切除后是无法被DNA聚合酶所填充的。 ?T7-DNA复制方式 T7-DNA两端的DNA序列区有160bp长的序列完全相同。 T7-DNA复制时，产生的两个子代DNA的3‘-端尾巴以互补结合。再由DNA pol?填充和DNA连接酶连接后，形成2个单位长度的T7-DNA分子。 这样复制下去，便可形成多个单位长度的T7DNA分子。 这样的T7-DNA分子可被特异的内切酶切开，用DNA pol?填充，形成与亲代DNA完全一样的双链T7DNA分子。 ?痘病毒DNA的复制 痘病毒DNA在两端都形成发夹环状结构。DNA复制时，在线性分子中间的一个复制起点开始，双向进行，将发夹环状结构变成双链环状DNA。 在发夹中央将不同DNA链切开，使DNA分子变性，双链分开。在每个分子两端形成单链尾端，再以自我互补，形成完整的发夹结构，与亲代DNA分子一样。 环状DNA的复制的末端终止阶段则不存在问题。 环状DNA复制到最后，由DNA拓扑异构酶?切开双链DNA，将两个DNA分子分开成为两个完整的与亲代DNA分子一样的子代DNA。 3.3.5 DNA复制的保真机制 在长期的进化中，DNA复制过程形成了一系列保真机制，保证复制准确和遗传稳定。 E.coli每复制109~1010nt便出现1个误差。由于E.coli DNA有4.5×106bp，这样每1000个细胞经过1次分裂会产生1个错误核苷酸。 单纯以碱基对原则维持其DNA复制准确性时么误差出现的频率为10-4~10-5。 真核基因组可分为多个复制子，在一个细胞分裂周期中每个复制原点仅活动一次，这是由细胞中的一些蛋白因子控制的。 准许复制因子来源于细胞质，进入细胞核控制DNA复制，DNA复制后因子失活，同时细胞质产生两个准许因子进入G2期，核膜消失，胞质中的准许因子进入核，核质分裂为二，细胞分裂，2个准许因子分别进入两个子细胞的核，这是细胞质因子对复制的调控作用(核质互作)。 Licensing factor in the nucleus is inactivated after replication. A new supply of licensing factor can enter only when the nuclear membrane breaks down at mitosis. 在酵母中，ORC (origin recognition complex) 蛋白与ARS结合。 ORC由6个蛋白组成，结合于A1和邻近的B1元件上，识别并保护ori区。ORC在整个细胞周期中都与ARS结合。转录因子ABF1结合到B3位点。 Cdc6蛋白(cdc: cell division cycle genes)是短命蛋白(半衰期5min)，但其在G1期不断合成。Cdc6与ORC的结合，形成起始复合物，复制起始。Cdc6此时起保护位于B1上的Dnase敏感位点。 Cdc6的存在允许Mcm蛋白(准许因子的组分)与DNA以及ORC结合形成前起始复合物， DNA双螺旋解开，复制起始。 细胞进入S期，Cdc6合成减少而使Mcm脱落，DNA复制。 G2期ORC仍结合于ori ，但由于无Cdc6和Mcm ，复制不能起始。 细胞周期控制着Cdc6的合成，而Cdc6又控制着复制。 2.4.3 真核生物的DNA pol和蛋白因子 2.4.3.1 真核生物DNA pol 由于真核生物研究材料突变体少，酶纯化困难。因此对真核DNA pol 了解较少。 真核生物中的DNA聚合酶与大肠杆菌的聚合酶相似，但都没有外切酶活性，其聚合反应机制与原核生物的相同。 真核DNA pol的种类 ?DNA polá:含量最高(占总量80-90%) ，有4或5个亚基， MW为300KD，负责合成RNA引物和iDNA(initiator DNA，起始DNA)。形成RNA–iDNA引物，具引物酶活性，无3‘?5‘活性，错配频率高。 主要负责染色体DNA的复制。 ?DNA polä:无合成引物功能，有3‘?5‘外切活性，负责合成延伸前导链和滞后链的冈崎片段(延伸)。 ?DNA polâ和å:分子量为45KD，仅含有一条链，可能与修复有关。 ?DNA polã:MW为140KD，存在于线粒体内，负责催化线粒体DNA的复制。 2.4.3.2 复制有关的细胞因子 ?PCNA(proliferating cell nuclear antigen):增殖细胞核抗原，为同源三聚体复合物，结构为环形。 功能类似于E. coli DNA pol ? â (clamp)，使DNA polä 有持续合成能力。 ?RFC(Replication factor C):复制因子C 功能:依赖于DNA的ATPase，其ATP酶活性由PCNA激活; RFC是促进活性复制复合物组装的蛋白;引物合成后取代pol á ，使polä 继续延伸DNA。 ?RNaseH?/FEN1(flap endonuclease) ?DNA聚合酶的校对作用 DNApol?有两个结构域:大结构域有直径2nm裂缝，DNA可结合于此而使裂缝关闭，DNA可在裂缝中前后滑动;小结构域含核苷酸结合部位;当新合成DNA中含错配核苷酸时，因双螺旋变形而不能在裂缝中向前滑动，只能后移，3′?5′外切酶激活，切除错配核苷酸。 DNA pol的校对作用可将错误的核苷酸切掉，重新加上正确的核苷酸。 每个核苷酸的掺入有两次被选择机会，按碱基配对原则，错误核苷酸掺入机率为10-4~10-5，DNA聚合酶本身的校对作用又可使错误核苷酸掺入的机率为10-4~10-5。 这样每掺入一个核苷酸，发生错误的机会只有10-8~10-10。 ?RNA引物起始复制可减少复制错误 DNA复制开始时形成的短核苷酸序列掺入的核苷酸容易出错，DNA合成起始时及冈崎片段合成开始时都有RNA引物。RNA最终被切除可提高DNA复制的准确性。 真核生物DNA聚合酶无3??5‘外切酶活性。因此，可能存在其他校正机制以保证DNA复制的准确性。 ?修复系统有多种机制和酶。 3.4 真核生物的DNA复制 2.4.1 研究真核生物DNA复制机制的选材 一般选用结构简单的真核生物如:酵母、四膜虫以及真核病毒为材料。 真核病毒DNA复制机制与真核染色体DNA复制相同，如SV40。 2.4.2真核生物的复制子 复制时期在S 期。 ?多复制起点 真核和原核生物DNA复制的基本特征是相同的，但真核DNA比远比原核DNA大，且大多数真核生物是由多细胞组成的，因此在DNA复制上有所不同。 真核生物的每一个染色体皆含有许多个复制子(replicon)。复制叉前进的速度大约只有大肠杆菌的1/10。 可能原因是真核生物的DNA与组蛋白构成核小体，对复制叉的前进造成阻碍。 人类的复制叉每秒约前进100bp;复制整个基因体需8h。 果蝇的复制整个基因体仅需3~4min。 ?复制原点的特征 酵母菌的复制起点称为ARS(autonomously replicating sequence)，有100多个bp。 ARS由2个功能域组成:A功能域为ARS的中心，可能是起始蛋白的结合位点。A的序列为(T/A)AAATA(T/C)AAA(T/A); B功能域富含AT，可能是DNA熔链区。 ARS包括一个共有序列(A)和附加元件(B1~B3)，ARS 序列突变对复制有影响。 真核生物Yeast约有400个自主性复制序列(ARS)分布于16条染色体中。每一个复制子长约36kb。 真核DNA的各个区域不是全部同时复制的，一般是20~80个相邻复制子一次被活化，S期中不断有新的复制子被活化，直至整个染色体完全复制。 DNA复制后立即与组蛋白八聚体结合(全保留方式)形成染色质。 ?复制起点复合物 RNaseH I:内切酶切除5′端RNA引物，但剩余引物最后一个N。 FEN1:5′?3′外切酶，切去引物最后一个N。 ?Dna2解旋酶/FEN1(内切酶活性) Dna2解旋酶:在引物消除中起作用。依赖DNA的ATPase活性，使polä合成的片段从模板DNA上置换下前一个冈崎片段的引物，形成flap，再由FEN1内切酶活性切除引物。 ? RFA为真核单链DNA结合蛋白; ?Ligase?:连接两个冈崎片段。 2.4.4 真核生物DNA复制 以哺乳动物SV40为材料研究 真核生物DNA复制叉，需DNA polα和DNA polδ两种酶。 ?起始:Polá¡úRFC¡ú组装PCNA?polá?RFC复合物。 ?RNA-iDNA引物合成:primase/polα先合成RNA引物，再合成一个短的iDNA形成RNA-iDNA引物。 ?DNA polá/ä转换 RFC结合在iDNA的3‘端，并装载着polδ和PCNA， PCNA结合在引物链模板上释放polα，由polδ结合到生长链3′端进行链的延伸。 在复制叉有两个polδ二聚体分别合成前导链和滞后链。 ?冈崎片段的引物切除和片段连接 滞后链新冈崎片段合成在遇到前一个冈崎片段时停止。RNaseHI/FEN1切除引物。iDNA在Dna2解旋作用后被新生的冈崎片段置换，再被FEN1切除，形成的空隙由DNA polä(or å)负责填补。(实际合成中后一个冈崎片段和前一个冈崎片段引物后是连续的,)。 Ligase?连接冈崎片段。 DNA polä和DNA polá转换的意义,