OEP及卵黄浓度对蓝狐冻融精子质量的影响

OEP及卵黄浓度对蓝狐冻融精子质量的影响 动物学报 50 4 :583 - 592 , 2004 A cta Zoologica S inica 3 OEP及卵黄浓度对蓝狐冻融精子质量的影响 133 2 3 1 1 李新红 顾孝连 邹兴淮 朱淑文 华修国 11 上海交通大学农业与生物学院 , 上海 201101 21 苏州科技学院石湖校区生物系 , 江苏 苏州 215009 31 东北林业大学野生动物资源学院 , 哈尔滨 150040 摘 要 人工采取 6 只优质芬兰雄性蓝狐精液 , 利用不同 OEP及卵黄含量的 Tris2果糖 - 柠檬酸钠稀释液稀释 , 制成细管冻精 , 透射电镜下观察精子冷冻前后质膜和顶体超微结构 , 荧光免疫方法 检测 工程第三方检测合同工程防雷检测合同植筋拉拔检测方案传感器技术课后答案检测机构通用要求培训 不同培养时间冻融精子 μ 的质量。结果表明 , 蓝狐精子顶体外膜双层膜的厚度为 01020 m , 冷冻 - 解冻过程中易发生质膜膨胀、顶体外 膜融合现象。顶体产生的囊泡分两种类型 , 一种是体积较大的中空囊泡 , 平均直径为 1125μm。另一种是体积较 小的实体囊泡 , 内充满顶体内容物 , 平均直径为 0183μm , 两种囊泡的 数量不定。OEP能有效抑制顶体囊泡形 成 , 影响顶体囊泡类型、体积大小及囊泡数量 , 添加适宜剂量 OEP能使 顶体囊泡的体积明显缩小 , 囊泡的总数 及中空囊泡的数量显著降低。蓝狐冻融精子质量与 OEP及卵黄剂量有关 , 在卵黄存在的前提下 , OEP有利于维 持冻融过程中质膜 5613 % 、顶体的完整性 5718 % , 显著提高冻融精子活 力 5417 % 。在蓝狐精液稀释液 中 , OEP、卵黄的适宜含量分别为 1 %、20 % [动物学报 50 4 : 583 - 592 , 2004 ]。 关键词 蓝狐 精子 低温保存 特性 OEP Effect of different concentrations of Orvus ES Paste and egg2yolk on quality of frozen2 3 tha wed spermatozoa in the blue fox Alopex lagopus 133 2 3 1 1 L I Xin2Hong , GU Xiao2Lian , ZOU Xing2Huai , ZHU Shu2Wen , HUA Xiu2Guo 1. College of Agriculture & Biotechnology , Shanghai Jiaotong University , Shanghai 201101 , China 2. Department of Biology , Suzhou Science & Technology University , Suzhou 215009 , Jiangsu , China 3. College of Wildlife Resources , Northeast Forestry University , Harbin 150040 , China Abstract Six high quality male blue foxes from Finland were chosen for collection of semen by digital manipulation and semen samples were mixed and divided into three fractions which were diluted with the first cryopreservative of Tris2fruc2 tose2citrate supplemented with different concentration of egg yolk 0 % , 10 % , 20 % v/ vAfter being equilibrated for 2 h at 5 ?, the three fractions diluted semen were divided into four sub2fractions that were added same volume second cry2 opreservative supplemented with different concentration of OEP 0 % , 015 % , 1 % , 2 % v/ v , respectively. Semen sam2 ples were packed in 015 ml straws and frozen on a rack at 5 cm above liquid nitrogen and thawed at 70?for 9 s. Ultra2 structure of spermatozoa was studied by transmission electron microscopy TEM and quality of frozen2thawed spermato2 zoa was evaluated in different culture time by fluorescent immunoassay. The results showed that the thickness of two lay2 ers of outer acrosome membrane was 01020μm and the space between inner acrosome membrane and nuclear membrane was 01015μm. The acrosome vesicles were divided into two types during frozen2thawed. In the first type , vesicles were hollow and the average diameter of the vesicle was 1125μm hat which was bigger than the second type of vesicles. In the second type , vesicles were solid and full of acrosomal content and its average diameter was 0183μm , vesicle numbers were indeterninate. Acrosomal vesiculation was inhibited and types , bulks and numbers of acrosome vesicles were influenced by OEP obviously. Vesicle bulks , total numbers of vesicles and numbers of hollowed vesicles were reduced by appropriate OEP. Quality of frozen2thawed spermatozoa was correlated with doses of OEP and egg yolk. Once supplemented with egg yolk , OEP helped to maintain the integration of plasma membrane 5613 % and acrosome 5718 % , to improve se2 men motility obviously 5417 %The optimal concentrations of egg yolk and OEP were 20 % and 1 % in cryopreser2 2004201209 收稿 , 2004204212 接受 3 国家“948”引进资助项目 No. 9824220 、上海交通大学校基金资助项 目 No. A2571A [ This research was funded by the grants from“948”Introduced Foundation of China No. 9824220 and Foundation of Shanghai Jiaotong University No. A2571A ] 33 通讯作者 Corresponding author E2mail : lixinhong7172 @yahoo1com1cn n 2004 动物学报 Acta Zoologica Si nica动 物 学 报 50 卷 584 vative of blue fox spermatozoa [ Acta Zoologica Sinica 50 4 : 583 - 592 , 2004 ]. Key words Blue fox , A lopex lagopus , Spermatozoa , Cryopreservation , Characteristics , OEP 犬科动物中许多种类的精子已经被成功低温冷 筛选出有利于蓝狐精子冷 冻保存的最佳稀释液和防 冻剂。 冻保存 , 如各种宠物犬 Rota et al. , 1997 ; Yu et al. , 2002 ; Pe na et al. , 2003 、狼 Canis ruf us 1 材料和方法 Goodrowe et al. , 1998 、银狐 V ul pes v ul pes Farstad et al. , 1992a 等 , 但蓝狐 A lopex lago2 111 精液采集 在繁殖期 , 选取 6 只 2 - 4 年龄、具有繁殖史 pus 精子成功保存的例子不多。同自然繁殖及鲜 的优质芬兰雄性蓝狐 1999 年从芬兰引进 , 用手 精液人工输精繁殖相比 , 用冷冻保存的蓝狐精子人 按摩法分别收集第二次射出的精液作为样品 , 37 ? 工输精繁殖的受孕率、产仔率均较低 Farstad , 下迅速送回实验室内。精液经纱布过滤除去胶体杂 1996 。其原因是蓝狐精子冻融过程中对低温损伤 质后 , 立即检查精子质量。在每次收集到的多份样 抗性较弱 , 超低温冷冻时细胞内冰晶的形成或溶液 品中 , 选取活力、质膜完整率及顶体完整率均高于 中电解质浓度的变化 , 造成细胞毒性或渗透性损 6 90 %、密度在 600 ×10 个/ ml 以上的样品进行实 伤 , 精子膜蛋白变性 , 导致精子被膜或内部结构肿 验。 胀或损伤 Hofmo and Berg , 1989 , 解冻复苏后精 112 精液稀释及细管冻精制备 子活力下降 , 而且冻融精子体外存活的时间相对较 为减少蓝狐不同个体间精子质量差异所产生的 短 李新红等 , 2003 。养殖中普遍采用鲜精液稀 实验误差 , 在处理前先将选取的精液样品混合。将 释后进行人工授精的方式繁殖 , 而未使用冻精。因 混合精液分为三等份并在室温下 300 ×g 离心 10 此 , 合理选择防冻剂及配置合适的防冻液 , 充分利 min , 弃去上清液 , 分别用稀释液一同进行 2 倍体 用优良种源并长期低温保存优质蓝狐精液是目前亟 积稀释。再把每份稀释后的精液分成四组 , 每组中 待解决的问 题 快递公司问题件快递公司问题件货款处理关于圆的周长面积重点题型关于解方程组的题及答案关于南海问题 。 分别加入等体积不同 OEP 含量的第二稀释液 Orvus ES Paste OEP 是一种表面活性剂 , 其 0 %、1 %、2 %、4 % , v/ v , OEP 的最终浓度为 组成中含有十二烷基硫酸钠 SDS 复合物 , 是猪 0 %、015 %、1 %、2 % v/ v , 然后置于 5 ?冰箱 和犬类动物精液冷冻时常用的稀释防冻成分 内平衡 2 h。稀释液的组成见表 1 成分参考 Pursel et al. , 1978 ; Rota et al. , 1995 , 1999 ; Farstad et al. , 1992a , 其中果糖、柠檬酸三钠、 Pe na and Linde2Forsberg , 2000 , 主要作用是防止 甘油等成分的剂量为本研究组筛选 , 卵黄液和 低温对精子的损伤 , 对精子膜结构有保护、修补作 OEP提前一周相混合并于 5 ?冰箱保存 , 实验前离 用 , 能够提高冻融精子活力、存活率及质膜完整率 心收集上清液。OEP 试剂购于美国 Noval 公司 , Tsutsui et al. , 2000 。目前关于 OEP保护作用的 Hoechst 33258 染液、CTC 染液、PVP240、果糖、 机理提出双重假设 : 一方面 OEP 具有乳化类脂的 Tris、柠檬酸钠购于美国 Sigma 公司 , 其它试剂均 作用 , 对精子膜结构中的类脂有稳定作用 , 降低或 为上海化学试剂公司产品。细管冻精制备及解冻方 者阻碍由冷冻保存所引起的似获能性变化 Pe na et 法参照李新红等 2003 方法进行。 al. , 2003 ; 另一方面 OEP通过分散卵黄中的类脂 113 电镜样品的制备及检测 形成聚合体 , 使这些类脂物更易进入精子质膜 , 而 所有电镜样品的制备过程均与 Hofmo and Berg 不是直接作用于精子膜结构 Pontbriand et al. , 1989 方法相似 , 但在 300 ×g、5?条件下离心 , 1989 , 即 OEP 发挥作用的前提必须有卵黄存在 以防精子膜结构的机械损伤。冻精解冻后立即用戊 Yi et al. , 2002 。 二醛固定液 011 mol 二甲砷酸盐缓冲液 , pH 714 但迄今为止 , OEP 在蓝狐精子冷冻方面的应 固定 12 h , 再经 2 %锇酸双重固定 2 h , 日本产 H2 用研究未见报道 , 而且 OEP 起保护作用的机理尚 600型 TEM 观察精子超微结构。TEM 检测时 , 取 无直接证据。本文通过对蓝狐精子冻融后质量及质 每个待测样品包埋块切面若干个 , 要求保证每个切 膜、顶体超微结构变化的研究 , 测定不同浓度 面是不连续的 , 避免一个精子头部纵切面的重复出 OEP及卵黄稀释液中蓝狐冻融精子的质量及顶体 现。记数顶体囊泡类型及顶体纵切面中囊泡总数。 囊泡状况 , 进一步探讨 OEP 保护作用机理 , 从而4 期 李新红等 : OEP 及卵黄浓度对蓝狐冻融精子质量的影响 585 表 1 蓝狐精液冷冻稀释液的组成 能着色精子顶体 , 根据精子头部亮黄绿色荧光的有 Table 1 Composition of cryopreservative for blue fox semen 无及亮暗程度 , 头部出现亮黄绿色荧光的精子为顶 3 3 3 成 分 Ingredient TFC EYT2FC? EYT2FCII 体完整的精子。用血细胞计数器计数 200 个精子 , 稀释液一 First cryopreservative 重复 5 次 , 计算精子质膜完整率和顶体完整率。 三羟甲基胺基甲烷 Tris g/ 100 ml 214 214 214 2 结 果 卵黄 Egg yolk ml/ 100 ml ? 1010 2010 果糖 Fructose g/ 100 ml 318 318 318 211 TFC型稀释液对冻融精子质 量的影响 柠檬酸三钠 Citric acid g/ 100 ml 118 118 118 表 2 为解冻后不同培养 时间 TFC 型稀释液中 青霉素 Penicillin IU 1 20010 1 20010 1 20010 精子的质量。经检测冷 冻前精子的活力、质膜完整 33 率及顶体完整率分别为 9117 %、9314 %、9411 %。 蒸馏水 Distilled water ml 10010 10010 10010 稀释液二 Second cryopreservative 解冻后 0 h , TFC 型稀释液中精子的 质量均较低 , 卵黄 Egg yolk ml/ 100 ml ? 1010 2010 添加 OEP试验组精子质膜、顶体 完整率差别不显 著 One2way ANOVA , P 0105 ; 015 %剂量组 甘油 Glycerol ml/ 100 ml 810 810 810 精子活力最高 818 % , 2 %剂量组最低 516 % , OEP ml/ 100 ml 0 , 1 , 2 , 4 0 , 1 , 2 , 4 0 , 1 , 2 , 4 两剂量组间差异显著 P 0105 , 而 015 %剂量组 青霉素 Penicillin IU 1 20010 1 20010 1 20010 ? 与 0 %剂量组间精子活力差异不显著 P 0105 。 蒸馏水 Distilled water ml 10010 10010 10010 说明无卵黄时 , OEP 对冻融精子保护作用不明显 , 3 TFC为不含卵黄的稀释液 , EYT2FCI 和 EYT2FCII 为含卵黄量 且高浓度 OEP 对冻融精子的破坏作用增强 , 这与 不同的两种稀释液。33 蒸馏水定容 100 ml。 3 EYT2FCI and EYT2FCII are cryopreservative with different concen2 Pursel et al1 1978 报道的结果相似。 tration egg yolk. TFC are cryopreservative without egg yolk. 212 EYT2FCI型稀释液对冻融精子质量的影响 33 Final volumes for all diluents after dissolving the ingredients are 100 ml. 表 3 为解冻后不同培养时间 EYT2FCI 型稀释 114 冻融前后精子质量测定 液中精子的特性。解冻后 0 h , 015 %剂量组精子活 11411 精子活力的测定 在冻融精子培养 0、2、 力 4615 % 、质膜完整率 4817 % 、顶体完整率 4、6 h 时 , 分别取各实验组中的冻融精液 50μl 放 5011 % 均最高 , 活力与 0 %剂量组差异显著 入 1 ml 孵育液中 , 在 37 ?下孵育 5 min。从中再取 One2way ANOVA , P 0105 , 而质膜完整率、 μ 20 l 滴在保温 37 ?的血细胞计数板上 , 盖上盖玻 顶体完整率差异不显著 P 0105 ; 培养 4 h 后 , 片 , 在 40 倍相差显微镜下观察 6 个视野 , 重复 5 015 %剂量组精子活力、质膜完整率及顶体完整率 次 , 每次检测 200 个精子并计算精子活力。 均与 0 剂量组间差异极显著 P 0101 。随着检 11412 精子质膜完整率及顶体完整性的检查 采 测时间延长 , 各组精子特性数值均有不同程度的减 用 CTC2Hoechst 33258 活体荧光染料联合染色法检 少 , 同时 015 %、1 %剂量组与 0 剂量组间精子特 测精子质膜完整率及顶体完整率 Harayama et 性差异显著 , 说明适宜剂量的 OEP 有利于维持冻 μ al. , 2000 。取出 50 l 精液用 1 ml 孵育液稀释后 , 融精子质膜、顶体的完整性。 在 37 ?下孵育 20 min。取 200μl 精子悬浮液与 196 213 EYT2FCII型稀释液对冻融精子质量的影响 μ μ l PBS相混合 , 然后加入 4 l Hoechst33258 染液。 表 4 为解冻后不同培养时间 EYT2FCII型稀释 混匀后避光室温染色 3 min。在 115 ml 离心管中放 液中精子的特性。解冻后 0 h , 从冻融精子活力、 入 1 ml 3 %的 PVP240 溶液 , 再把染色精液轻轻铺 质膜完整率及顶体完整率等特性来看 , 均为 1 %剂 在 PVP240 溶液上 , 500 ×g离心 6 min , 去上清液。 量组最高 5417 %、5613 %、5718 % , 1 %剂量组 μ 取 200 l PBS 悬浮离心后沉淀下来的精液 , 再加 与 0 剂量组相比 , 精子活力、质膜完整率及顶体完 μ μ 入 200 l CTC 750 m , 混匀后闭光孵育 30 s。 整率分别增加 914 P 0105 、919 P 0105 、 μ 然后 , 再加入 36 l 1215 %的多聚甲醛溶液混匀。 819 P 0101 个百分点 ; 同 EYT2FCI型稀释液 取 15μl 精子悬液 , 加入等量增光剂 , 混匀后加盖 类似 , 随着检测时间的延长 , 各组冻融精子质量均 片 , 用无色指甲油封片 , 避光保存并尽快用荧光显 有不同程度降低 , 但 OEP 各试验组精子质量均高 微镜观察记数。Hoechst33258 染色呈阳性的死精子 于 0 剂量组 ; 4 h后 0、1 %两剂量组间精子质量差 头部呈蓝色荧光 , 活精子不发光。CTC 荧光染料 异极显著 P 0101 , 015 %剂量组与 0 剂量组间586 动 物 学 报 50 卷 质膜完整率、顶体完整率差异显著 P 0105 , 量组精子活力、质膜完整率及顶体完整率均在 其它各组间差异不显著 P 0105 ; 6 h 时 1 %剂 20 %左右。 1 表 2 不同培养时间 TFC型稀释液冻融精子的活力、质膜完整率及顶体完整率 % Table 2 Motility , plasma membrane integrity and acrosome integrity values % of semen frozen with TFC cryopreservative in different incubated time after tha wing at 37 ? OEP浓度 Concentration of the OEP % , v/ v 特 性 培养时间 h Characteristics Incubation time 0 015 1 2 a a a b b 活力 0 715 ? 219 818 ? 215 613 ? 312 516 ? 117 a a a b a b Motility 2 513 ? 217 618 ? 216 315 ? 116 311 ? 019 a a a a 4 211 ? 113 219 ? 019 117 ? 018 112 ? 016 a a a a 6 0 0 0 0 a a a a 质膜完整率 0 1013 ? 312 1314 ? 316 818 ? 216 714 ? 212 a a a a Plasma membrane 2 715 ? 215 817 ? 218 714 ? 318 610 ? 115 a a b b integrity 4 519 ? 210 615 ? 215 318 ? 119 314 ? 213 a a a a 6 213 ? 114 316 ? 118 217 ? 113 213 ? 111 a a a a 顶体完整率 0 1219 ? 413 1417 ? 314 1016 ? 214 915 ? 311 a a a a Acrosome integrity 2 916 ? 312 1017 ? 213 912 ? 218 711 ? 216 a a a a 4 712 ? 219 719 ? 118 619 ? 310 517 ? 117 a a a a 6 414 ? 216 517 ? 211 313 ? 115 219 ? 019 1 : n 5。数据采用 One2way ANOVA 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 。在同一横行中 , 上标小写字母 不相同者差异显著 P 0105 , 大写字母不同者差异极显著 P 0101 , 下表同此。 Data were analyzed with One2way ANOVA procedure from SAS. In each row , different lowercase in superscript showed significant differences P 0105 and different uppercase showed extremely significant differences P 0101 , the following tables are the same. 表 3 不同培养时间 EYT2FCI型稀释液冻融精子的活力、质膜完整率及顶 体完整率 % Table 3 Motility , plasma membrane integrity and acrosome integrity values % of semen frozen with EYT 2FCI cryopreser2 vative in different incubated time after tha wing at 37 ? OEP浓度 Concentration of the OEP % , v/ v 特 性 培养时间 h Characteristics Incubation time 0 015 1 2 a b ab a 活 力 0 3918 ? 514 4615 ? 712 4116 ? 617 3916 ? 518 a b ab ab Motility 2 2817 ? 613 3712 ? 610 3219 ? 512 3211 ? 517 Aa Bb ab ab 4 1715 ? 414 2713 ? 516 2218 ? 419 2314 ? 513 Aa Bb b a 6 712 ? 311 1519 ? 412 1116 ? 318 916 ? 217 a a a a 质膜完整率 0 4211 ? 619 4817 ? 611 4315 ? 712 4114 ? 815 a a a a Plasma membrane 2 2917 ? 811 3518 ? 613 3318 ? 715 3110 ? 617 Aa Bb b ab integrity 4 1914 ? 415 2718 ? 518 2616 ? 318 2112 ? 417 Aa Bb b ab 6 1115 ? 313 1916 ? 319 1715 ? 310 1717 ? 416 a a a a 顶体完整率 0 4318 ? 811 5011 ? 914 4214 ? 616 4219 ? 712 a b ab ab Acrosome integrity 2 3018 ? 319 3812 ? 316 3518 ? 411 3212 ? 414 Aa Bb b ab 4 1914 ? 416 3018 ? 319 2618 ? 418 2415 ? 513 Aa Ba b ab 6 1315 ? 210 7>2014 ? 217 1818 ? 318 1517 ? 3194 期 李新红等 : OEP及卵黄浓度对蓝狐冻融精子质量的影响 587 表 4 不同培养时间 EYT2FCII型稀释液冻融精子的活力、质膜完整率及顶 体完整率 % Table 4 Motility , plasma membrane integrity and acrosome integrity values % of semen frozen with EYT 2FCII cryopreser2 vative in different incubated time after tha wing at 37? OEP浓度 Concentration of the OEP % , v/ v 特 性 培养时间 h Characteristics Incubation time 0 015 1 2 a ab b ab 活 力 0 4513 ? 811 5116 ? 711 5417 ? 717 4914 ? 513 a ab b ab Motility 2 3612 ? 517 3815 ? 419 4411 ? 412 3915 ? 311 Aa ab Bb ab 4 2714 ? 311 3018 ? 319 3614 ? 418 2819 ? 413 Aa ab Bb ab 6 1112 ? 218 1516 ? 212 1916 ? 317 1316 ? 319 a ab b ab 质膜完整率 0 4614 ? 617 4814 ? 714 5613 ? 812 4914 ? 512 a ab b ab Plasma membrane 2 3915 ? 411 4017 ? 415 4618 ? 513 3911 ? 417 Aa b Bb ab integrity 4 2517 ? 415 3118 ? 318 3215 ? 517 2718 ? 413 Aa b Bb ab 6 1515 ? 213 1918 ? 210 2318 ? 312 1715 ? 316 Aa ab Bb ab 顶体完整率 0 4819 ? 614 5316 ? 812 5718 ? 716 5418 ? 512 Aa ab Bb ab Acrosome 2 3715 ? 415 4318 ? 611 4412 ? 510 3917 ? 614 Aa b Bb ab integrity 4 2612 ? 311 3216 ? 516 3618 ? 415 2912 ? 317 a b Bb ab 6 1515 ? 218A 2215 ? 415 2516 ? 315 1912 ? 319 214 OEP及卵黄浓度对冻融精子质膜、顶体超微 5 , 7 ; 质膜断裂、顶体脱落消失 图版 ?: 8 , 结构的影响 9 。冷冻 - 解冻后精子顶体形成的囊泡共有两种类 蓝狐精子冷冻前顶体外膜双层膜的厚度约为 型 , 一种是中空的囊泡 , 此类囊泡体积较大 , 最大 01020μm , 顶体内膜与核膜间距约为 01015μm 直径为 2119μm , 平均直径为 1125μm ; 另一种是 图版 ?: 1 , 2 。冻融过程中质膜、顶体超微结构 实体囊泡 , 囊泡内充满顶体内容物 , 此类囊泡体积 μ 的变化与其它哺乳动物精子相似 , 质膜产生轻微或 较小 , 平均直径为 0183 m。精子冻融后顶体囊泡 极度膨胀 , 而顶体未发生变化 图版 ?: 3 , 4 , 总数及不同类型数量均与 OEP、卵黄的浓度有关 5 , 顶体外膜双层膜的厚度及顶体内膜与核膜间距 图 1 。TFC 0 % OEP 型稀释液中顶体纵切面 均与鲜精相同 ; 质膜极度膨胀 , 顶体囊泡化 , 顶体 囊泡总数平均为 33112 , 且中空囊泡数量 20112 内膜完整 图版 ?: 6 , 图版 ?: 1 , 3 ; 顶体内膜 多于实体囊泡数量 1415 图版 ?: 5 , 6 ; 囊泡化或消失 , 赤道段顶体囊泡化 图版 ?: 4 , EYT2FCI 015 % OEP 型稀释液中冻融精子顶体 图 1 不同 OEP、卵黄含量的稀释液中冻融精子顶体囊泡数量 数据表示为平均值?标准误 Fig11 Numbers of acrosome vesicle in frozen2tha wed spermatozoa at different con2 centration of OEP and egg2yolk cryopreservative Data are expressed as means?SD588 动 物 学 报 50 卷 囊泡总数 24125 及各种类型数量有所减少 ; 与 表明 , 添加 OEP三个组与无 OEP 组相比较 , 冻融 TFC 0 % OEP 型稀释液相比 , EYT2FCII 1 % 精子的质量均有显著提高或者有提高的趋势 , 同时 OEP 型稀释液中冻融精子顶体纵切面囊泡总数 随着培养时间的延长 , 015 %、1 %两个试验组中质 20125 、中空囊泡数量 5175 均极显著降低 膜完整率、顶体完整率显著高于对照组 , 由此 证明 住所证明下载场所使用证明下载诊断证明下载住所证明下载爱问住所证明下载爱问 P 0101 , 其中体积较小的实体囊泡数量较多 , OEP有利于维持冻融精子质膜、顶体的完整性。 而体积较大的中空囊泡数量较少 图版 ?: 1 , 2 。 从 OEP各试验组中冻融精子质量来看 , OEP 对蓝 这在形态结构上进一步证实适宜剂量 OEP、卵黄 狐冻融精子的保护作用与卵黄剂量有关 : 在无卵黄 能有效抑制冻融精子顶体囊泡的形成。 存在情况下 , OEP 对冻融精子保护作用不明显 , 相反高剂量 OEP 对冻融精子具有损伤作用趋势 ; 3 讨 论 10 %卵黄含量时 , 015 %剂量 OEP 的保护效果最 311 OEP、卵黄对蓝狐精子冻融过程中顶体囊泡 佳 ; 20 %卵黄含量时 , 1 %剂量 OEP的保护效果最 形成的影响 佳 , 这与 Arriola and Foote 1987 在牛精子冷冻 哺乳动物精子超低温冷冻保存时 , 常以冻融精 稀释液中添加 SDS 时所得的结果相似。此结果提 子活力、活率、顶体完整率等特性作为冻融精子质 示 : 在蓝狐冻融精子保护效果方面 , OEP 和卵黄 量的检测指标 , 来衡量冻融精子的受精能力 Gar2 两者间存在剂量相适 性 , 二者之间具有协同作用。 ner et al. , 1997 ; Thomas et al. , 1998 ; Cardoso et 其原因可能是 OEP 的保护作用是通过卵黄间接实 al. , 2003 。对于动物精子超低温冷冻保存而言 , 现的 , 尤其是本试验中卵黄、OEP 两者提前混合 , 虽然顶体囊泡化的精子失去受精能力 , 但顶体囊泡 卵黄经过 OEP 长时间乳化作用后 , 使得卵黄中大 数量的多少、体积的大小可直接反映出冻融精子的 量的类脂物分散出来 , 离心后的卵黄上清液中类脂 损伤程度 , 囊泡数量多、体积大说明冻融精子受低 物相对有所增加 , 这些类脂物更易进入精子质膜 , 温损伤程度强 , 相反较弱 , 所以顶体囊泡数量的多 从而更有效保护冻融精子的膜结构。根据冻融精子 少、体积的大小亦可作为冻融精子质量的检测指 质量及顶体囊泡等形态变化 , 本研究结果支持 Yi 标 , 但目前尚无此方面的研究报道。与精子获能后 et al. 2002 的观点 , 即 OEP 与卵黄对冻融精子 发生顶体反应的结构相似 , 蓝狐冻融精子质膜明显 起到协同保护作用。卵黄中是否有其它成分而不是 肿胀或断裂 , 顶体外膜融合导致囊泡化及顶体内容 卵磷脂对精子保护效果更佳 , 或者是 OEP 通过卵 物溃散 , 即所谓“假顶体反应” Pursel and John2 黄中的其它成分来降 低质膜的流动性而起到保护精 son , 1975 ; Hofmo and Berg , 1989 ; 陈大元等 , 子质膜和顶体的完整性还未得到证实 , 在此方面亟 1992 ; 秦鹏春等 , 1995 。但顶体产生的囊泡却出 待进一步研究。 现两种类型 , 一种是中空的囊泡 , 此类囊泡体积较 313 蓝狐精子超低温冷冻稀释液中 OEP的适宜剂 大 ; 另一种是实体囊泡 , 囊泡内充满顶体内容物 , 量 此类囊泡体积较小 , 同时两种类型囊泡数量亦存在 在犬类和猪等哺乳动物精液冷冻稀释液中 一定的差别。本研究结果证实 , 稀释液中无 OEP、 OEP的含量一般均为 015 % v/ v Rota et al. , 卵黄时 , 冻融精子囊泡体积增大 , 大体积中空囊泡 1997 , 1999 ; Tsutsui et al. , 2000 ; Yi et al. , 的数量及囊泡的总量增加。添加适宜剂量 OEP、 2002 。蓝狐精子冷冻稀释液中 OEP的最适含量是 卵黄后 , 冻融精子囊泡体积和数量均有所减少 , 同 否与犬科其它动物相似许加成等 2000 、岳德 时中空大型囊泡数量显著降低。其原因可能是 山等 2001 曾报道了利用蓝狐冻精人工繁殖的结 OEP与卵黄类脂共同完成对质膜及顶体膜结构的 果 , 但冻融精子活力、质膜及顶体完整率并未确切 保护作用 , 阻碍顶体内容物的渗透、扩散 , 同时防 测定 , 只给出活力在 40 %以上。从 EYT2FCII 型 止顶体囊泡的形成与扩胀。这从形态学上进一步证 稀释液中冻融精子质量来看 , 1 %剂量组中精子活 实 OEP对蓝狐精子冻融过程中顶体囊泡的形成起 力、质膜完整率及顶体完整率均最高 5417 %、 到抑制作用。 5613 %、5718 % , 且优于 Farstad et al. 1992b 312 OEP对精子冻融过程中质膜、顶体保护作用 的报道结果。所以在 20 %卵黄的前提下 , 1 %OEP 的机理 为蓝狐精子冷冻稀释液中的适宜添加量。目前 , 虽 本研究 EYT2FCI、EYT2FCII型稀释液的结果 然国内偶见蓝狐冻精人工繁殖的报道 , 但利用冻精4 期 李新红等 : OEP及卵黄浓度对蓝狐冻融精子质量的影响 589 341 - 354. 人工繁殖的受孕率及产仔率依然低于自然繁殖状 Pursel V G , Johnson LA , 1975. Freezing of boar spermatozoa : fertiliz2 态 , 未在实际生产中广泛使用 , 有关利用蓝狐冻精 ing capacity with concentration semen and a new thawing proce2 dure. JAnim. Sic. 40 : 99 - 102. 人工授精繁殖还需进一步研究证实。 Pursel V G , Schuman LL , Johnson LA , 1978. Effect of Orvus Es Paste on acrosome morphology. JAnim. Sci. 47 : 198 - 202. 参考文献 References Qin PC , Tan J H , Wu G. M , Xu LL , Yang QZ , 1995. Ultrastruc2 tural studies on capacitation and acrosome reaction of pig spermato2 Arriola J , Foote RH , 1987. Glycerolation and thawing effects on bull zoa i n vit ro. Acta Zool. Sin. 41 2 : 207 - 212 In Chinesespermatozoa frozen in detergent2treated egg yolk and whole egg ex2 Rota A , Str?m B , Linde2Forsberg C , 1997. Effects of Equex STM tenders. JDairy Sci. 70 : 1 664 - 1 670. Paste on i n vit ro viability of frozen2thawed dog spermatozoa sub2 Cardoso RCS , Silva AR , Uchoa DC , Silva LDM , 2003. Cryopreser2 jected to a thermoresistance testTheriogenology 47 : 1 093 - vation of canine semen using a coconut water extender with egg 1 101. yolk and three different glycerol concentrations. Theriogenology Rota A , Str?m B , Linde2Forsberg C , 1995. Effects of seminal plasma 59 : 743 - 751. and three cryopreservative on canine semen stored at 4 ?. Theri2 Chen D Y , Song XF , Duan CW , Meng L , 1992. Formation of Acro2 ogenology 44 : 885 - 900. some Membrane Vesicles in Mammalian Spermatozoa. Acta Zool. Rota A , Iguer2Ouada M , Verstegen J , Linde2Forsberg C , 1999. Fer2 Sin. 38 1 : 60 - 63 In Chinesetility after vaginal or uterine deposition of dog semen frozen in a tris Farstad W , Fougner JA , Torres CG , 1992a. The effect of sperm num2 cryopreservative with or without Equex STM Paste. Theri2 ber on fertility in blue fox vixens A lopex lagopus artificially insemi2 ogenology 51 : 1 045 - 1 058. nated with frozen silver fox V ulpes v ulpes semen. Theriogenology Thomas CA , Garner KL , DeJarnette J M , Marshall CE , 1998. Effect 37 : 699 - 711. of cryopreservation on bovine sperm organelle function and viability Farstad W , 1996. Semen cryopreservation in dogs and foxes. Animal as determined by flow cytometry. Biol. Reprod. 58 : 786 - 793 Reproduction Science 42 : 251 - 260. Tsutsui T , Hase M , Hori T , Ito T , Kawakami E , 2000. Effects of Farstad W , Fougner JA , Torres CG , 1992b. The optimum time for ar2 Orvus Es Paste