植物病原真菌及重寄生菌分离鉴定与侵染性研究(可编辑)

植物病原真菌及重寄生菌分离鉴定与侵染性研究(可编辑) 植物病原真菌及重寄生菌分离鉴定与侵染性研究 己:. . 。。齄,: .摘要 导致的菌 由白粉菌口导致的白粉病和核盘菌“ 核病是两种危害农作物较为严重的真菌病害。 白粉菌危害严重,且防治困难。白粉寄生孢“ 作为自粉菌上 较为重要的重寄生菌,能够在大多数白粉菌上寄生,并对用来防治白粉菌的化学药物具 有抗药性,因此自粉寄生孢具有防治植物白糟病的作用。但由于来源不同的自粉寄生孢 菌株间存在一定的遗传差异,所以在利用自粉寄牛孢防治白粉病时具有一定局限性.所 以明确白粉寄生孢的资源状况,筛选新的有潜力的生防菌株就显得及其重要。 由核盘菌侵染引起的菌核病是一种严重病害.核盘菌是一种放线状子囊真菌,其寄 丰范围和地理分布十分广泛,尤其在南方油菜产区发病严重,该病害在发病严重年份病 株章可达?%,严重制约油菜品质和产量,造成经济上的损失,是危害油菜最严重 的病害之一。 本文对周口地区番茄白粉菌和分离自风仙花白粉病上的白粉寄生孢以及蒋染了菌 核病油菜上的核盘菌进行了显微观察、生物学特性、分子生物学以及致病性等研究,并 取得了以下丰要结果: 对周口地区检出的番茄白粉菌进行了显微形态分析、核糖体转录间隔区 、进行扩增及进化分析。结果表明:在扫描电子显微镜下 惰菌分生孢子呈圆柱形或椭圆形,无支链,序列与来自日本番茄上的 同源性最高 和来自美国番茄上的 聚为一支,序列同源性达到%,分析结果表明,来自周口地区的番茄白粉菌为 。 机河南省周口市采集感染白粉瘸的风仙花植株,采用单孢分离法分离得到白粉 寄生孢,对该菌进行苗落和显微形态分析,初步证明该菌株为一.。利用真菌通 大小的片段? 用引物对所分离的菌株内转录间隔区进行扩增,得到 经过克隆测序和在血中进行分析,发现与德国和美国自粉寄生抱/序列 的同源性达到%进一步证明该分离菌株为一。并将白粉寄生孢接种在患有 白粉病的大叶黄杨叶面上,经一周时间检查发现.白粉菌菌体由无色渐变成浅黄色或浅褐色,并渐渐萎缩至自粉层消失, 说明 关于失联党员情况说明岗位说明总经理岗位说明书会计岗位说明书行政主管岗位说明书 从周口地区风仙花白粉病病株上分离得到的白粉 寄生孢具有防治白粉病的效果。 通过探究白粉寄生孢最适的生长环境研究发现,其温度生长范围较广:?, 菌株生长和产孢的最适温度为?。白粉寄生孢在州一时均可生长及产孢,其 值为时最适宜其产孢。最适合生长的理想源为葡萄糖。最适合的源为蛋白胨,持续 光照对菌株的生长及产孢具有明显的促进作用。 从河南省周口市采集感染菌核病的油菜.对核盘菌进行分离和鉴定。采用单孢分 离法分离得到该菌系,对该苗系进行了菌落和显微形态分析,初 步证明该菌株为 。利用真菌通用引物和对所分离的单菌系序列进行 扩增得到大小的片段,经过克隆测序和在中进行分析,发 现与己知核盘菌属菌核病菌序列的同源性达到%,进一步证明该分离菌株为 。 通过研究不同温度、值、源和源、光照、培养基对核盘菌的最适台生长 环境的研究表明,核盘菌温度生长范围较广:??,其中是菌株生长及产孢的 最适温度。核盘菌在?时均可生长及产孢,其中值为时最适宜其产孢。菌落 生长较为理想的源和源为蔗糖和酵母浸膏,持续光照对菌株的生长及产孢影响不 显著。 将菌悬液分别接种在耐菌核病型油菜和易感菌核病型油菜上,天后用台盼兰染 色观察,发现耐病型和易感型均可被感染,菌丝侵入的方式两个基因型也没有差别,但 菌丝长度不同。用菌核病侵染番茄和拟南芥植物时发现这两种植物也均可被核盘菌侵 染。下一步的工作,将研究白粉寄生孢能否对核盘菌具有生物防 治作用。 关键词:白粉菌,白粉寄生孢,核盘菌,单孢分离,序列,鉴定,致病 性分析 衄 卸 自弘? 既 ? 觚、 酬 ?.即 四 , ” . %,?. “? ?/ . ? 雌: 器 咄目 瑚“口 ??, 一 肌目 哪 、, .. / 』 。???日 仃% ?目一“醛” %.?? 】. , , . 四?一 ?? 。 眦 . 一.删 “? . ? , % ”. 四 ? /。 .旭 四“ 日 朗, 曲 卸 蚰 盯 日 即 ,,? . :四』 目 录 摘要 , . 目录 第一章前言 白粉菌. 白粉菌的分类 自粉菌的危害? 白粉寄生孢? 白粉寄牛孢的牛物学分类 . 白粉寄生孢的寄主范围? 白粉寄生孢在生防中的应用?.. 核盘苗 核盘菌的生物学特性 .核盘菌的侵染循环 .标记 ?的结构及优点. 分子标记在植物病原菌检测中的应用 本研究的目的和意义 第二章周口地区番茄自粉菌的鉴定前言 .材料和 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 ? .供试材料? . 病菌显微形态鉴定 . 病菌分子生物学鉴定 .结果与分析.病原菌形态特征. 区的扩增和测序 . 各地部分已鉴定白粉菌种娄 .小结 第三章白粉寄生孢的分离鉴定及防治效果测定 前言 材料和方法 供试材料 . 供试培养基? 白粉寄生孢的分离纯化与显微形态鉴定. .. .. 白粉寄生孢序列分析病原菌防治效果测定? .结果与分析.风仙花白粉病症状? . 风仙花白粉菌寄生孢的分离 .? 风仙花白粉蓝寄生孢的特征 区的扩增和测序. 自粉寄生孢防治效果测定? .小结第四章白粉寄生孢最佳生长条件研究 .材抖与方法 .供试菌株来源温度对白粉寄生孢生长的影响 . 值对白粉寄生孢生长的影响 、源对白粉寄生孢生长的影响 . 光照对自粉寄生孢生长的影响 结果与分析 捞如如 .温度对白粉寄生艳生长和产孢的影响. 值对自粉寄生孢牛长及产孢的影响、源对自粉寄生孢菌落生长和 产孢量的影响? ”? . 光照对白粉寄生孢生长及产孢的影响 小结 第五章核盘菌的分离鉴定 . 前言.材料和方法 .供试材料. 供试培养基 . 核盘菌的分离 .. .. 核盘菌的纯化 核盘苗的显微形态分析? . 核盘菌序列分析结果与分析? 弛 一一 强 弘 油油油 菜菜菜 菌菌苗核核核 病病病的病病 特原原征菌菌 一的的 ~分形 一离态 一特 一征 . 区的扩增和测序 第六章核盘菌最佳生长条件研究前言 .材料与方法 .供试菌株来源. 温度对核盘菌牛眭的影响. 值对核盘苗生长的影响 . 、源对核盘菌生长的影响“? . 光照对核盘菌牛长的影响 .结果与分析 ?“? .温度对核盘菌生长和产孢的影响? . 值对核盘菌生长及产孢的影响??.、源对核盘菌苗落生长和产孢 量的影响光照对核盘菌牛长及产孢的影响 .小结 第七章核盘菌病原菌侵染实验 前言 材料和方法供试菌株和供试植物 和台盼蓝染色试剂核盘菌侵染植物叶片 和台盼兰同时染色法 .结果与分析? .. 耐菌核病型油巢和易感营核病型油菜病原致病性分析 . 拟南芥植物和番茄植物病原致病性分析 .小结 第八章结论与展望 结论 .研究展望 参考文献 致谢 攻读学位期间发表的学术论文目录 独创性声明 关于论文使用授权的说明 ?第一章前言 第一章前言 由自粉菌引起的植物白粉病和核盘菌感染导致的菌核病均是危 害我国常见农作物 的重要真菌病害,多在每年春夏季爆发。感染了白粉病的作物新梢变白、皱缩畸形、生 长受阻,并影响其观赏性。感染菌核病的作物表现为茎基部腐烂,产生空杆、白杆、叶 片受损发黄,作物严重减产,对我国农业生产造成了严重的经济损失。 白粉病菌在自然界中广泛存在,主要侵染植物的叶片和嫩稍组织大量生长在植株 表面形成白色粉层,危害农作物,导致作物减产、影响植被的观赏性?。白粉寄生孢也 是一种真菌,常寄生于白粉菌的菌丝、来成熟闭囊壳及分生孢子梗内口,影响自粉菌产 孢细胞的形成,导致寄主苗原生质降解,因而可作为白粉菌的生物防治因子来开发利用 避免了使用化学农药防治白粉病时对作物本身造成的危害?】。近年来.随着作物种植 方式的改变和温室大棚使用的增多,植物白粉病的爆发愈加频繁。目前,国内防治植物 白糟病的方法主要是喷洒化学杀菌剂,大量农药的使用和残留造成了严重的环境污染问 题,不能满足绿色可持续农业发展的需求,因此,越来越多的人们 将关注的目光转向了 生物农药领域。由美国公司研制的做为防治植物白粉病的生物杀菌剂, 其主要有效成分即是白粉寄生孢,产品的商业化也证明了白粉寄生孢作为防治白 粉病的生物杀菌剂的可行性。因此,研究白粉寄生孢与白粉菌之间的相互作用机理、探 讨其代谢机制、开发安全高效的生物杀菌剂,对于保证农业生产的可持续发展,维持生 态平衡的稳定都具有重要的理论意义和应用价值”圳。 由核盘菌侵染引起的菌核病是是世界范围的一种严重病害,在我国届油菜大病害 之首,是影响油菜产量和品质的主要因素,它能侵染十字花科、菊科、豆科、茄科等 科种作物,其中尤以油菜的受感染程度较高。由接盘菌侵染引起的油菜菌核病,俗 称白秆、空杆.是我国油菜种植过程中经常遭遇的一种真菌病害。该菌可侵染的油菜植 该病在雨水丰 株从苗期到成熟期.其中尤以中后期发病最为普遍,危害也最严重。 富的年份和季节更易爆发,发病率一般为%.%,患病后的油菜平均 减产%?% 因此该病不但影响油菜的品质且严重制约油菜产量,使油菜生产造成巨大的经济损失。植物病原真菌及重寄生菌的分离鉴定与侵染性研究 白粉菌 ..白粉菌的分类 白粉菌属于子囊菌,核菌纲.白粉菌目, 白粉菌科口.在我国记载的菇有个属共个种】。在世纪末以前,传统 的白粉菌分类主要以形态特征为主.比如根据闭囊壳中的子囊数目和附属丝的结构,但 复杂环境的改变,病菌的变异以及寄主的进化.使形态鉴定的结果不能客观准确的反应 白粉菌真实的亲缘进化关系,近年来。分子生物学技术发展迅速,已成为分类系统研究 极为重要的依据。根据白粉菌不同分生孢子娄型将白粉菌属分为个组, 根据无性型分为个组,和将叉丝壳属和钩丝壳属 洳加妇列入白粉菌属,从而将白粉菌属根据附属丝特征分成个组【”。“。近些年来自 粉菌属的分类变化很大,新的属级分类已经形成,并被广大学者所接受,在新的属级分 类中,有性型属个,包括节丝壳属,布氏白粉菌属,巴西壳属 ,离壁壳属,白粉菌属岳”垆船,戈洛文属内丝 白粉菌属,新白粉菌属,球针壳属,半内生钩丝壳属 ,叉丝单囊壳属,叉钩丝壳属,棒丝壳禹, 拟钩丝壳属,簇丝壳属。无性型属个,包括粉孢属, 拟粉孢属 ,拟小卵孢属?一唧括和旋梗菌属斯印泖卉“?【。 .白粉菌的危害 白粉菌是植物上常见的一类重要的病原菌类群,属于囊菌纲,菌丝体由许多短的单 核细胞组成,世纪年代首次在欧洲发现该病,它可侵袭超过属植物的 多个种类,其中以双子叶植物居多,小麦、葡萄、玫瑰等许多粮食、经济及观赏植物都 是其侵袭的对象,在植物的茎、叶、花序、果实表面形成灰白色粉层,植物由于白粉病 危害所产生的损失及其严重,可使三叶革减产%,大麦减产%,黄瓜减产%,桃 减产可达到%。目前.在我国河南、黑龙江、云南、辽宁、台湾和新疆等地都有发生 。近些年,我国温室蔬菜逐渐增多,由于温室或塑料大棚内温度高、湿度大、空气 不流通等原因,白粉病也在我国部分地区开始传播并发生严重危 害.且有逐年加重趋势, 一般年份发病在%.%,严重地块达%一%.已经成为无公害蔬菜的大敌。第一章前言 白粉寄生孢 ..白粉寄生孢的生物学分类 白粉寄生孢在分类学地位上属于真菌,半知苗亚门、腔孢纲、球壳目、球壳孢科。 年,”首次记载了』是白粉寄生萄的一种重寄生苗,之前植物病理 .。 学家们把它看作是产生分生孢子 或有产孢器官附属物 年, 一捌首次对自耪寄生饱的寄生特性做了系统性研究,又将其命名为 月。 即?,这个名字沿用了很长一段时间。直到年,‰为关于白 粉寄生孢的命名较为混乱,应当统一使用最初的一.作为白粉寄生孢的正式命 名.并一直沿用至今。在对自粉寄生孢的早期研究中.人们认为虽然其在形态或培养性 状上存在差异,但在分类学地位上应该属于同一个种。直到年,和”“ 从分子水平研究了自粉寄生孢,发现了其基因具有多样性并用实 验证明了白粉寄生孢属 于多个不同的种。,”.过对来自世界各蝴株白粉寄生孢垂测序, 并用限制性片段长度多态性分析技术分析和证明了这些白粉寄生孢分属于个明 显不同的类群。研究还发现来自不同地域的菌株也可能属于同一类群而相同地域相同 寄主上分离得到的菌株却可能分属不同的类群。年,梁晨对从寄生于不同植物上 的种白耪菌上分离到的个白粉寄生孢菌株进行序列分析,将其划分蔓个类 群。年.袁巧丽田对分离自我国秦岭地区的白粉寄牛孢进行了白粉菌与白粉寄生孢 互作的系统研究,采用白粉寄生孢接种活体黄瓜上的自粉菌,初步明确了自粉寄生孢的 橙染寄生过程。年,赵云福脚对国内个省的白粉寄生孢自然技生情况做了调查, 运用分子标记对不同地区的白粉寄生孢进行了分子指纹分析,证实了有的引物 在某些真菌遗传多态性分析中具有较高的通用性。年李光『”怯对秦岭地区份白 粉病标样进行了分析和比较.通过序列构建系统发育村,分析其遗传类群 .白粉寄生孢的寄主范围 白粉寄生孢作为~类重要的重寄生菌.通常寄生在热带或温带气候区自粉苗科真菌 上,除此以外,很少在其它真菌上发现。自年‘刊报道了咀来,许多国家租地 区均做了相继报道。例如,九在塞尔维亚发现了种白粉病发病植物 种寄生有白粉寄生孢。衄四详细描述了向日葵盯叶片上白粉寄生孢 菌丝在于囊壳阶段的侵入过程。刑【在三叶草白粉菌上分离得到了白粉寄生孢,植物病原真菌及重寄生苗的分离鉴定与侵染性研究 并对其分生孢子形态特征做了描述,同时研究发现分离得到的白粉寄生孢对三叶草白粉 病具有防治效果。等”报道了以色列白粉寄生孢的自然发生情况,首次分 离得到 日。高立强嘲等报道了我国秦岭地区种植物中白粉菌上 寄争的种白粉寄生孢。赵云福等蚓研究并报道了白粉寄生孢在我国个省份的自然发 生状况。练上所述,目前世界各地己报道了超过种的白粉寄生孢,该属真菌能自然寄 生于白粉菌科属个以上的种,范围涉及十字花科、茄科、豆科、旋花科、禾本科等 科属的种植物【”‘.且研究发现双子叶植物上寄生的白粉寄生孢远多于单子叶 植物。地域分布上丰要集中在德国、印度、荷兰、韩国、中国等个国家和地区。 . 白粉寄生孢在生防中的应用 年.首次尝试用分离得到的白粉寄生孢防治三叶草自粉病,发现其 能够抑制自粉苗的生长。此后,随着人们对白粉寄生孢生物学特性的进一步了解.越来 越多的研究者尝试将其作为一种生防资源,运用到植物白粉病的防治工作中去。目前。 关于白粉寄生孢在生物防治中的应用性研究己取得了一定的成果,年,美国 公司成功研制了一种可以防治几种白粉菌的生物杀菌剂“”。。生 物杀菌剂的主要有效成分就是白粉寄生孢,其孢子活性可保持一年之久。这种杀菌剂在 使用时首先将其喷洒在患病植株上.然后在适宜的条件下孢子萌发进入寄主白粉苗细胞 中,在侵染寄主的过程中大量扩增并杀死寄丰细胞。这种杀菌剂的适用范围较广,可以 作用于多种植物,对白粉菌的种属没有选择性,对寄生生活的时 间也没有限制,在作物 生长的整个季节周期都可以使用,但是需要空气湿度达到%时孢子才有生长活力 【“郫】。前产品已经能够大量生产并供给市场需求。另外,近年来新上市的生物 ’ 合成杀菌剂腈菌挫,以及韩国研制的生物杀菌产品‘? 等/“,其中的有效成分都是白粉寄生孢。现有研究表明,用白粉寄生孢作为生防资源 防治植物白粉病具有明显的优点:、菌种筛选简单,分离纯化后可直接测试防治效果, 避免了大量前期工作。、白粉寄牛孢在寄主细胞中的生存状态稳定,避免了因外界环 境影响导致的防治效果降低。、具有较强的抗药性。重寄生菌的寄生范围一般较广, 可防治多种植物病原真菌.符合现代农业要求的环境安全和持续稳定发展要求,所以其 生物制剂具有广阔的市场应用前景忡舯,第一章前言 核盘菌 核盘菌的生物学特性 在整个生育周期中.核盘菌有三个主要形态特征,分别是于囊孢子、菌丝体、菌核。 菌丝生长发育和菌核形成需要的最适温度为,最适相对湿度在%以上。子囊孢子 荫发的最适温度为。核盘菌能侵染绿色植物引起植株的菌核病当环境过冷或过 热不适宣菌核萌发时,菌核暂时作为休眠体埋藏于土壤中,能存活至年以上,当环 境条件适宜且有植物宿丰存在时,菌核逐渐葫发形成菌丝并侵染植株茎部,使植物受侵 部位的细胞和组织坏死,形成水渍状病斑并腐烂,接触到腐烂部位的其它植株也会被感 染,最后在病斑形成部位太多在茎秆处形成黑色菌核以越冬或越夏制。 ..核盘菌的侵染循环 研究发现,核盘菌侵染油菜时主要有两种途径,途径一:每年春季温度适宜时菌核 从土壤中萌发形成菌丝侵染寄主植物.苗丝首先形成中间菌丝体,在油菜花期时侵染油 菜幼苗,在油菜叶柄处形成白色退色斑,待油某成熟,进一步侵染成株。途径二:温度 湿度适宜的条件下.菌核发育形成子囊盘.子囊盘释放子囊孢子,借助气流传播,形成 菌丝体侵入健康植株。如果环境条件不适宜,子囊孢子会在短时 间内保持自身活性待 条件适宣时再次侵染活体植株。核盘菌侵染后在植株的侵染部位会形成浅褐色、水样腐 烂,同时大量菌丝体聚集在一起形成白色棉絮状团状物,覆盖在植物组织上,待成熟后 转变成黑色苗核。成熟的菌核可进入土壤中,停留在土层表面或深层土壤长达年之久, 待环境条件适宜时,菌核将再次萌发形成菌丝或发育成子囊盘释放出大量子囊孢子, 侵染植物组织,进入新一轮侵染循环弦”.如图.。植物病原真菌及重寄生菌的舒离鉴定与侵染性研究 ‰ “%?” 矿 ?叫’目 零 巴 勰喾 三 凄 ?酬:帅《”图卜核盘茸侵染油菜循环过程 州 .标记 .. ?的结构及优点 近年来随着分子生物学实验技术的飞速发展.分子标记盯技术 也逐步呈现多样化趋势。理想的分子标记应具有遗传多态性高、信息完整、在基因组中 含量高且分布均匀、稳定性好、检测手段简捷、成本低等优点‘妊矧。同时,分子标 记技术也逐渐成为检测和鉴定病原菌的快速、可靠手段,使植物病原菌的检测和鉴定发 生了巨大的转变【”删。传统的真菌分类鉴定方法经常是利用真菌各个时期的形态特征、 生理生化特点、抗原构造等进行鉴定,但由于真苗的种类众多、个体多态性明显,因此 传统的分荣学指标常会得出假阳性或假阴性结果.给真菌的分类鉴定带来了一定的难 度,导致形态分类结果与系统进化性分析结果的不一致呻舶】。目前,在真菌的分类学鉴 定中,序列是应用最广泛的一种分子标记,即利用核糖体的序列的保守性 、 作为真菌鉴定的依据。核糖体中的 和基因转录子序列中的序列在第一章前言 真菌种间存在着丰富的变异,在种内不同菌株问又高度保守,所以可作为物种间分类、 鉴定、确定种间系统进化关系的依据.对于研究真菌种类的划分、种内个体差异有重要基因和大亚基基因之间被 意义删。序列位于核糖体小亚基 基因分为和两个部分,如图。在实际研究中,作为分子标记也具有明显 的优点: 易扩增性。区长度相对较短、较易进行扩增。 广泛通用性。可根据其保守区 设计 领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计 应用广泛的通用聪.这一点消除了在研究不 同物种时设计不同引物的麻烦,一些常用的通用引物 总结 初级经济法重点总结下载党员个人总结TXt高中句型全总结.doc高中句型全总结.doc理论力学知识点总结pdf 如表一。 表?用于扩增真菌的几种常用引物 西. 讲竹 努 献 ” 日【物 ‘’。 坠 竺竺竺 坐竺 坐竺 一 柚&&&嘣 ‰? “ ?? “?“ 嘛??. &一 & ?&?? ?小. ” 坠坚坐兰鲨竺竺:::兰 ::』坚生:一一 圈卜核糖体姒重复单元的结构 植物病原真菌及重寄生菌的分离鉴定与侵染性研究 分子标记在植物病原菌检测中的应用 由于序列分析技术具有快速、简便和高特异性等特点,因而己被广泛地应用于 植物病原菌的分类鉴定以及粪群的系统发育研究中。例如,候丽冰【州等利用序列分 析技术对我国松干锈菌进行了鉴定,并与已报道的柱锈菌属的其它种进行了比较。张薇 等【愀苏南丘陵地区的苜蓿菌核病菌株上分离得到三种病原菌,这三种病原菌发病症状 相似、形态学相似且均能够侵染豆科植物造成菌核病,利用通用 引物和对这 三种病原菌 基因区片段进行反应,将其分别鉴定为 , .和.。杨佩文肄应用通用引物和对十字花科蔬菜上分 离到的根瘤病菌进行检测,试验设计合成的日/物能从十字花科根肿病菌全基因组 中扩增到长度的分子片段,该对引物可用于十字花科蔬菜根舯病的分子鉴定和检 测,对十字花科根肿病的早期准确诊断和病菌检测提供了快速、简便的方法。张竞宇等 【根据已知的个种的腥黑粉菌属的序列差异设计引物,可以直接将小麦印度腥 黑穗病菌 与其他相似及相关种进行区分,灵敏度高达个艳子。 .本研究的目的和意义 植物白粉病和油菜苗核病是两种农作物种植中常见且危害严重的真菌病害,目前防 治自粉病的手段主要是使用化学杀菌剂,这样做易使白粉苗产生抗药性,且破坏生态平 衡.增加环境污染,与当前提倡的绿色可持续发展农业要求不相符。白粉寄生孢作为白 粉菌中有生防潜力的重寄生菌,在抑制植物白粉病的发生中起到 了重要作用。但由于来 源不同的白粉寄生孢菌株间存在一定的遗传差异,筛选新的有潜力的生防菌株就显得及 其重要悼”】,因此本研究将从分子层面结合生物学特性上揭示这一现象的本质,为进一 步研究自粉寄生孢菌株间的遗传进化关系、开发具有生防潜力的新菌株、发现拮抗基因、 保护白粉寄生孢资源和控制植物自粉病奠定基础,对于更好地明确白粉寄生孢的种群分 化和自粉寄生孢同寄主植物、白粉菌及生境条件三者之间的相互关系和提供基本理论依 据。而引起油菜蔷核病的病原菌为核盘苗.属子囊菌亚,其分布地区广泛、致病性强, 能侵染十字花科、菊科、豆科、茄科等“科种作物,其中尤以油菜的受害程度较高 ”枷】。核盘菌在侵染植物的过程中.菌核萌发产生菌丝或子囊盘侵染植株,导致植株侵 染部位腐烂【?。目前,我国已发现的菌核病病原菌分类划分尚不明确,准确判定苗核 病的种类和生理小种分化,对菌核病防治和选育抗病品种具有重要的科学意义。本研究兰二童堕童 对周口地区检出的番茄白粉菌和感染了白粉菌的风仙花病株上 分离得到的白粉寄生孢 以及从感染菌核病油菜上分离得到的核盘菌进行显微形态观察和致病性分析并采用真 菌通用引物’’和’’ 对 基因区片段进行反应并探讨其遗传进化关系.预期发现其生物学性 状和分子遗传类群之间的关联性,为进一步的系统进化研究奠定基础第二章周口地区番茄白粉茁均鉴定 第二章周口地区番茄白粉菌的鉴定 前言 白粉病是一种常见的真菌性病害,引起该病的病原菌属于粉孢属真菌,栽培品种对 其具有很强的易感性,近些年,我国温室蔬菜逐渐增;;.由于温室或塑料大棚内温度高、 湿度大、空气不流通等原因,白粉病也在我国部分地区开始传播并发生严重危害.且有 %一%,已经成为无公害蔬菜 逐年加重趋势,一般年份发病在%%,严重地块 的大敌”。但是在我国出现的白粉菌还没有得到准确的分类鉴定和生理小种划分,白粉 菌是专性寄生菌,只能在活体寄毛上生存,所咀极易出现菌种变异,所以,准确预测白 粉菌的种类是检测和防治白粉苗的基础.本实验对周口地区番茄白粉菌进行形态学及分 子生物学鉴定,为进一步的番茄白粉菌系统进化研字.奠定基础四。 .材料和方法 .供试材料 番茄白粉病菌于年目取自周口师范学温室种植的番茄白粉病感染叶片。 . 病菌显微形态鉴定 对感病叶片的苗落大小、形状、颜色进行普通目察,然后对叶片进行处理,经一系 列乙醇脱水、醋酸异戊醇置换、二氧化碳临界点干《汲真空镀膜后,用肌型扫 描电镜进行观察。 病菌分子生物学鉴定 自粉病的提取四 用毛刷轻轻刷取感染叶片上的白粉病菌于无菌水中,加入石英砂研磨破碎病菌细 胞,加入止%抽提液,液氨中速冷立即永浴,反复次在 漩涡振荡器上高速漩涡.然后于水浴,每摇匀一次:加入与 上述反应溶液等体积的酚一氯仿一异戊醇混合溶液,~酚:氯仿: 异戊醇:: .震荡摇匀,/离心:加入上清湛/体积的%抽提液.振植物病原真菌及重寄生菌的分离鉴定与性鞋性研究 荡后加与之等体积氯仿一异戊醇混合溶液,氯仿:异戊醇:,振荡混匀, /离心:取上清液加等体积的异戊醇,轻轻棍匀,放置,/ 离心:弃上清,加预冷的%酒精洗涤沉淀./离心:弃上 清,留沉淀于超净工作台上风干,加适量无菌去离子水溶解,一存放。 ?区扩增及产物检测 扩增?区使用的引物为菌核糖体区段通用引物 ’’和’’.引 物由南京金思瑞生物工程有限公司合成。 反应体系: 灭菌去离子水 吐引物 引物 聚合酶. 模板 反应条件: ? ? ? ? ? 产物的回收、克隆与测序 取扩增产物在%的琼脂糖凝胶上进行电泳,染色后,用凝胶成像系统检测 其扩增结果。将得到的产物经切胶回收试剂盒纯化后构建一载体上,并转 化至 的感受态细胞中.在含有一溴氯哼哚一半乳糖苷、 异丙基一?一硫代半乳糖苷、氨苄青霉素的培养基上进行蓝白斑筛选,挑 取白色菌落提质粒进行验证,将构建成功的阳性菌株送至南京金思瑞公司进行测第二章周口地区番茄白粉菌构鉴定 序。 .序列分析 在的数据库中,搜索并下载同源性高的序列含 ,选取不同 地区的 、、船和西”妒的序列 , 区域用手工方法去除,辟程 进行比对.将这些序列的 序对获得拘序,进行对位排列,用 构建;统进化树,分析其遗传进 化关系。 .结果与分析 .病原菌形态特征 番茄粉病菌主要感染番茄幼嫩叶片和新梢,:窆病初期在叶片上可见散状分布的 白色小圆斑,边缘呈放射状,后病斑逐渐扩大,叶片表面布满一层厚厚的粉层,擦拭白 粉层可见病斑呈圆形或不 规则 编码规则下载淘宝规则下载天猫规则下载麻将竞赛规则pdf麻将竞赛规则pdf 形状,随着病情的加重.整个叶片逐步黄萎、皱缩、卷曲 甚至凋谢。白粉病菌是严格的植物寄生菌,根难在』.工培养基上生长,因此通过 直接观察番茄白粉菌的形态特征.结果如图、?所示.番茄白粉病菌平均长度为 ..分生孢子梗直立,不分枝,中间有隔膜平均长度为 ..,宽度为 宽度为 ?,从植物感染病症和孢子形态结构上进行分析,初步认定该病菌为白耪病 菌。 图.番茄白粉菌孢子扫描电子显徽图 图番茄白粉菌孢子梗扫描电子显微图植物病原真菌及重寄生菌的分离鉴定与侵染性研究区的扩增和测序 用毛刷轻轻刷取感染叶片上的白粉病菌于无菌水中,加入石英砂 研蘑破碎病菌细 胞,利用改良的法提取白粉菌,采用真菌核糖体区通用引物和 对基因区片段进行反应.经个循环后,得蛰左右目的片段,如图 。 图番茄白粉菌序列的结果 /?? 芋列, 在核酸序列数据库中进行搜索,得到一系列同源性较高的 其中目的序列同来自日本番茄上的.和来自美国番茄上的 .扣同源性最高聚为一支,序列同源性达到%,与来自韩国绣 、澳大利 球花上的.、英国景天科植物的 亚的矮牵牛花上的由于寄丰植物不同而另聚为一条分支.说明 了不同物种的白粉苗间的遗传距离较远。分析结果表明.来自周 口地区的番茄白粉苗为 . 。?蕊. 州州衄咖律 平? 幽血眦日鼬 ’?凼?自? 巧“邬 二二帅哪~?哺 ‘:妇?供船; 图核盘菌序列的结果 髓 ? 第二章周口地番茄白粉苗鉴定 . 各地部分已鉴定白粉菌种类 , 经文献查阅,各地区不同植物上自粉菌经鉴定十别为 ,如表所示 州?删, 小柚,?“,“,凸。妒胁四 轰各地部分已鉴定白粉日种类衄 采嶷地 寄主植物 量重苎丝 .旦堂堕登耋 南瓜 单:壳白粉菌 刘秀波【】 黑龙江 挂目&姑自粉础 粱巧兰 南瓜 甘肃省威武地区 ,删 单《壳粉茼 咸丰 瓜类 陕西关中地区 口? 单壳自粉苗 王娟 北京 瓜粪 却口,, 目花白氍,茁 屈振淙 长春 黄瓜 啦健壳粉诗 顾海峰 上海 西甜瓜 ’ 单蹙走向柑 魏尊苗 葫芦科 黑龙江 。腑四?口, 单囊先向粉茼 徐志豪朝 瓜娄 江浙 单建克白粉曲 包海清 瓜类 海南 , ?? 裴冬丽朝 瓜囊壳白粉菌 河南商丘 风仙花 华班丧靳蔺 西班牙 瓜娄 吐口枷 ?囊咒日轴菌 法国 瓜类 , ????????????????????????????????一?。。。’?????。。。。。???????‘。。’?一 小结 近几年,白粉病在国内温室牛产的番茄上普遍传霜,严重影响了番茄的产量和质量 其防治主要靠喷施杀菌剂.造成了严重的环境污染释农药残留。本实验通过显微学对白 分病菌分生孢子及孢子梗的形态、大小进行观察对比,认定在周口地区出现的番茄自粉 病菌为.。通过与中的菌耩序列比较发现同来自日本番茄上 觥 的”憎把和来自美国番茄上的 最高聚为一支,睁列同源性达到%,与来自韩国秀眯花上的.“、 、澳大利亚的矮牵牛花上的 英国景天科植物上的 御腮由于寄主植物不同而另聚为一条分支,说明了不同物种的白粉植物病厦真菌及重寄生菌的分离鉴定与侵染性研究 菌间的遗传距离较远,分析结果表明,来自周口地区的番茄白粉菌为 。第三章白粉寄生孢的分离鉴定及防治效果测定 第三章白粉寄生孢的分离鉴定醍防治效果测定 .前言 以往文献报道白粉寄生孢的分生孢子器和分生孢有多种形态,大多数分生孢子器 浅褐色或暗褐色.菌丝大多不定性、肥大、具隔膜,外观有的呈现球形至梨形,有的呈 棍棒形、洋梨形、柠檬形或长纺锤形,菌丝直径:不等。本试验采集分离白粉寄 生孢的野生菌株,通过对形态特征的比较,分析探讨粉寄生孢的种类组成.为今后筛 选控制白粉病的生防菌株打下基础.壮大白粉寄生孢‘《源库瞰。但仪凭外观的判断还是 不够准确和直观,近些来分子生物学得到了飞速的发月;,分子标 也呈现多样化,理想的分子标记应具有遗传多态性高.信息完整、在基因组中大量且分 布均匀、稳定性好、检测手段简捷、成本低等优点。序列分析技术由于具有这些优 点已成为检测和鉴定病原菌快速、可靠的手段。本实碱采用真菌通用引物对白粉寄生孢 基因区片段进行反应,并分析其遗进化关系陋啪】。尽管世界各地的 研究者对取自干不同地区和不同作物上的白粉病及粉寄生孢做了许多研究工作,但白 粉病的发病状况依然十分严重,随着人们环保意识的增强.对农作物喷洒化学杀菌剂带 来的环境污染引起了人们的高度关注,同时,环保型无公害的牛肪剂和防治技术逐渐受 到人们的青咪。利用自粉寄生孢防治白粉病国外已磐有很多成功的例子,但由于不同种 群和地域间的自粉寄生孢存在一定的遗传差异,以至于在不同的环境中应用白粉寄生孢 来防治白粉病存在一定的局限性。本试验利用分离稠到的自粉寄生孢侵染大叶黄杨白粉 病.观察所分离得到白粉寄生孢的防治效果。 .材料和方法 供试材料 供试白粉寄生孢于年月取自周口市区种值的感染白粉病的风仙 花病株。 . 供试培养基 马铃薯培养基:马铃薯,蔗糖,琼脂。马铃薯去皮.切成块 加水煮沸,然后用纱布过滤,再加糖及琼脂,溶化后补足水至.?灭 植物病原真菌及重奇生苗的分离鉴定与侵染性研究 菌。 . 自粉寄生孢的分离纯化与显微形态鉴定 白糟寄生孢的分离 采集风仙花白粉病病株,经自来水小心冲洗,以免冲掉叶片上的粉孢子,在超净工 作台上,将叶片放入%酒精中消毒左右,然后用无菌水小心冲洗,待晾干后用毛 刷收集叶片表面孢子,溶于无菌水中,用灭菌枪头吸取菌液涂布在含有卡那 霉素的口的培养基上,四周用封口膜封好.倒置培养在?的培养箱中一周后 观察。 白粉寄生孢的纯化 在无菌条件下,将用在固体培养基上已培养好的白粉寄生孢,用已灭过苗的 接种环刮取菌落边缘的菌丝,用划线的方法移植于另一个固体培 养基上,待茁落 长成再用此方法移植数次,直至形成典型的菌落形态。 白糟寄生孢显微形态分析 对固体培养基平板和显微镜下不同时期的菌落和菌丝颜色、形状 和大小进行观 察,拍照并记录。 .白粉寄生孢序列分析 试剂 , ?提取液 ,. %,%一巯基乙醇。 ?酚一氯仿.异戊醇溶液,体积为::。 。 ?/一酸钠溶液. 。 :/ .,/ ?缓冲液, ?电泳缓冲液:×贮备液,.×电泳缓冲液。 ?溴化乙锭:/,.溴化乙锭溶解于水中,混匀后室温避光保 存。 均购自于大连宝牛物工程有限公司。 ?酶、、 所需的引物合成由南京金斯瑞牛物科技有限公司完成。 ?其它试剂:灭菌双蒸水,无水乙醇,%乙醇,异丙醇。第三章白粉 寄生孢的分离鉴定及防?效果测定 仪器 正立显微镜,由温度梯度仪,?型台式高 速离一机,型高压蒸汽灭菌锅,一型《.泳仪,一型全自动数码 凝胶成像系统。 ‘怕粉寄生孢的提取? ?用灭菌环刮取己培养好的菌丝体.放入灭菌开钵中,加入液氮 使其充分研磨 ,, ?再加八.提取液,’? ,%,%巯基乙醇,快速充分珂。磨后,用灭菌枪头吸取至灭 菌离心管中。 ??下离心,吸取上清液,将上清液再次离心。 ?取上清液加入相同体积的氯仿:异戊醇,上下颠倒数次,离心 ?再次用氯仿:异戊醇抽提,取上清液,加入相目体积一?预冷的 异丙醇和 豹,温和上下颠倒,混匀后放入.冰箱中沉淀。 沉淀,用%酒精洗涤 从冰箱中取出后离心,得 次,倒掉酒精,倒置在滤纸上室温晾干。 ?将沉淀溶于中,.。保存备用 “区扩增反应体系 实验使用真菌核糖体区段通用引物’’和 ’’,由南京金月瑞生物工程有限公司台成。 反应体系: 灭菌去离子东 . 盯 引物 引物 此 聚台酶 模板 此植物病原龚菌及重寄生茁的分离鉴定与橙染性研究 反应条件: ? ? ? ? ? 【琼脂糖凝胶电泳 使用微波炉加热分钟,待温度降至室温 ?使用%琼脂糖凝胶.×缓冲液 时加入大约滴./的,摇匀。 ?将电泳槽的制胶内槽玻璃板放于水平位置,并插好梳子,将已摇匀的琼脂糖凝胶 液小心均匀的倒八玻璃板上,避免有气泡生成,待胶凝固垂直取出梳子,将内槽玻璃板 放电泳槽中,添加×缓冲液没过胶板为止。 使用最大刻度为止移液枪在点样板上将样品与溴酚蓝混匀.小 心加入胶板的小槽内,勿损坏点样孔周围的凝胶面,每次要更换新的枪头,以免污染, 注意记下加样的顺序。 ?使用一型电泳仪,设置电压.样品由负极向正极移动.半小时后停止 电泳,取出凝胶。 ?使用.全自动数码凝胶成像系统观察、拍照并保存。 琼脂糖凝胶中片段的回收 本实验采用北京索莱宝科技有限公司生产的产物纯化试剂盒,操作步骤按其 试剂盒使用说明进行。 ?加入比反应产物多倍体积的结合液,使其混匀。 ?将第一步得到的液体加入吸附柱中.并将吸附柱放入收集管内, 室温放置两分钟, 离心.去除收集管中的液体后再放入收集管内。 ?向吸附柱中加入己加过无水乙醇的漂洗液,离心,去除收集管中的 废液后再欢将吸附柱放入收集管内。 ?向吸附柱中加入漂洗液,再次离心.倒掉废液。 ?将离心吸附柱放回收集管中,离心,尽量除去漂洗液,将吸附柱第三章白粉寄生孢的分离鉴定及骑治破粜测定 开盖放置于室温晾备用。 产物克隆与测序 将得到的产物经切胶回收试剂盒纯化后】建一载体上,并转化至 哚一.半乳糖苷、 的感受态细胞由,在含有?一溴一氯. 异丙基?硫代半乳糖苷、氯苄青霉素,的培养基上进行蓝白爵筛选.挑 取白色菌落提质粒进验证,将构建成功的阳一生菌株送至南京金思瑞公司进行测 序。 ?序列分析 利用已测得的供试菌株亭列.在群核酸序列数据庠中运用 工具.从网上搜索与已测得菌株同源生高的相似序列,选取不同地区的 序列用 对上述序列进行匠源性分析,计算遗传距离。 ..病原菌防治效果测定 供试菌株和供试植物 试验用大叶黄杨白粉病作为研究对蒙,本实验‘苣之前对周口地区大叶黄杨白粉菌 区序列也做丁较系统的研究.发现分离自周口地夏大叶黄杨的白粉菌同来自日术的 “喧啪,印』序列相似性较高,达到%,与来自阿根廷的邶御埘序列 有%的同相似性。 供试苗准备 将新长出的大叶黄杨无病叶片作为研究对象.长出?片新叶时,将在温室己纯 化好的白粉菌接种到待试的大叶黄杨叶片上.将塑壮袋套在植林上保湿。 试验方法 在无菌条件下将培养好的白粉寄生孢用无菌水位成孢于悬浮液,将其喷洒在已感病 的大叶黄杨白粉稿稿时上.为方便作对照将另一发病植株上喷洒清水.并将它们分开放 置.以免感染,将塑料袋套在植株上保湿。每天毂接种叶片在显微镜下观察是否有 寄牛情况。后记录白粉病发病情况并在显微镜观察。植物病原真 菌及重奇生苗的分离鍪定与侵染性研究 .结果与分析 ..风仙花白粉病症状 培 啦啦一.曲?岫 白粉病菌主要危害风仙花叶片,如图一,影响叶片光和效能,严重时可蔓延至花 和茎部.该病一般在月份开始发生.最初叶片表面可见零星白色粉状斑点,月以后 病斑扩展连结成片.叶片正反两面均可产生白色粉状霉层.随着病害的发展,初秋时分. 在白粉层中形成黄色小圆点,逐渐变为黑揭色。病叶后期枯黄扭曲甚至枯死早落. ..凤仙花白粉蕾寄生孢的分离 采集风仙花白粉病病株,叶片经%酒精消毒后,用毛刷收集叶片表面孢子.溶于 无菌水中,用灭菌枪头吸取菌液涂布在含有咖”叫卡那霉素的的培养基 上,倒置培养在?的培养箱中培养,后共分高得到株菌.经观察共表现为两种表现 型.命名为为菌株.菌株. ..凤仙花白粉菌寄生孢的特征 在培养基上培养两用后菸可观察到两种表型的菌株,菌株初期菌 丝黄色,后 期在菌丝周围可见生长的黄色孢子,后经显微观察和分于生物学鉴定,菌株不属于白 粉寄生孢属。菌株?初斯菌丝黄色.一周后酶约在苗丝周围可见零散分布的黑色孢于, 两周后观察可见黑色孢予进一步生长,如图,三周时黑色孢子已经几乎覆盖住原有 营丝,如图.。第三章自糖奇申孢的分离鉴定及防:自蕴军嗣定 量艟 教薹植物病砸真菌硬重寄生苗的舒离鉴定与侵染性研究 序列.如图.,该序列提堂登陆号为 图白粉寄生孢电泳结果 图白粉寄生孢序列的结果 ?丁 鼬 胞 ?四 积 计 撕 ?日甜耵亡甜酏 甜 曲 醒扯 矩 叶吐 围?白精寄生孢体核醑序列结构囝 四 目 表在中搜索到与 同源性较高大干蚰~的序到 . % 第二章粉寄生孢的丹离鉴定及防效果测定 ? ?“口“? 州?四 ~ 叩慨%慨‰‰%四‰耋%耋耋‰眦眦耋喜瓤耋薹批龇‰四龇‰‰姚‰蛾‰?面五雨西河再石;画丽蜃谆司甄磊库中运用川;工县.从同上搜索得到一系列 与己洲得菌株同源性高的相似序州.其中与来自德煎批““阳如和来 相似性最高达到%?而 自美围的从向日赘白粉苗上分离的』“““口抓 与来自韩国不同植物上分离得到的白粉寄牛孢也有很,的同源性,进一步说明了分离自 周口地区风仙花白粉病上的白粉寄牛孢为』蜘“凰;年,粱晨’做自粉寄牛孢的.序列分析时.将个菌株鉴定为口种,年.赵云福四初次适用分子,示记对来自我国部分省市和典国、 匈牙利共株白粉寄牛孢进行了分子指纹分析.研究岳果表明这些白粉寄生孢菌株共分 ? 为种,分别为一,』如竹甜,, , , , , 口删。.李光云四对秦岭地不同植物上分离到的林白粉寄 :孢进行.分离鉴定,研究结果表明所分离到的菌株经鉴定为爿“植物箱廉真菌及重奇牛茁的分离鉴定与幔染性研究 第三章白粉寄生抱的分离鉴定及翰治效果测定 球、直或略弯。本研究采集分离得到的白粉寄生孢,培养基培养形态在刚生长时苗 丝黄色,两至三周后在菌丝周围可见生长的黑褐色艳~.牛长较为缓慢。在显微镜下观 察可见菌丝不定形,肥大,具隔膜,顶端形成分生孢‘二器,分生孢于器浅褐色.卵圆形 或长椭圆形,与已报道的基本一致。 快速简便的提取纯净均是分子生物学;验的基础,本实验提取白粉寄生 孢的方法是经过改进后的法,提取过程中改进的部分是加入和巯 基乙醇,这些改进有助于减少因为研磨菌丝时造成的氧化,增强与蛋白质和杂质 分离的效果,使提取的更加纯净。所提经琼脂糖凝胶电泳检测观察基本无降 解、无断裂,电泳检测时可观察较亮的条带,同时,扩增出现目标片段,说明了经 过改进的法适合白粉寄生孢的提取。通过上已知白粉寄生孢序列 比对 发现,该菌株属于小球腔菌属。在的核酸序列数据库中运 用具。从网上搜索得到一系列与已测得菌杉同源性高的相似序列,其中与 来自德国的』“口“胁和来自美国的从『日日葵白粉菌上分离的 相似性最高.达%。进一步说明了分离自周口地区风仙花白粉病上的自 粉寄生孢为日姐加。 据国外研究报道,发病严重时苹果白粉病可导致苹果减产三分之一,黄瓜白 粉病可致黄瓜减产三分之二,在我国由白粉病引发自农作物减产问题也相当普遍和严 峻,发病严重的田地可减产%,而防治自粉病喷洒的化学杀菌剂既不环保费用也偏 高,从而人们开始将眼光投向无公害的生防剂上,和用白粉寄生孢来防治白粉病已经受 到人们的重视。从实验结果可以看出,将培养好的白寄生孢用无菌水做成孢子悬浮液 将其喷洒在已发病的大叶黄杨白粉病病菌上,经过:天左右的时间,白粉菌菌体由无色 渐变成浅黄色或浅褐色。并渐渐萎缩至白粉层消失。显微观察可见白粉寄生孢分生孢子 会葫发成芽管穿透白粉菌菌丝细胞壁,并在其细胞生长并吸取营养用于自身的生长。 说明从周口地区风仙花白粉病病株上分离得到的白柑寄生孢具有防治白粉病的效果。