天然蛋白的免疫沉淀方法 天然蛋白的免疫沉淀方法
本方法免疫沉淀得到的天然蛋白可用于western免疫印迹或是激酶活性分析
A. 所需溶液和试剂
注意:所有溶液用反渗透去离子水(Reverse Osmosis Deionized water, RODI)或相当纯度的水配制。
1. 20 X 磷酸盐缓冲生理盐水 (PBS): (#9808) 配制1L 1 X PBS时，取50 ml 20 X PBS用950
ml RODI水稀释到1L，混匀。
2. 10 X 细胞裂解液: (#9803) 配制1 L 1 X细胞裂解液时，取100...
天然蛋白的免疫沉淀方法
本方法免疫沉淀得到的天然蛋白可用于western免疫印迹或是激酶活性分析
A. 所需溶液和试剂
注意:所有溶液用反渗透去离子水(Reverse Osmosis Deionized water, RODI)或相当纯度的水配制。
1. 20 X 磷酸盐缓冲生理盐水 (PBS): (#9808) 配制1L 1 X PBS时，取50 ml 20 X PBS用950
ml RODI水稀释到1L，混匀。
2. 10 X 细胞裂解液: (#9803) 配制1 L 1 X细胞裂解液时，取100 ml 细胞裂解液加950 ml RODI
水稀释到1L，混匀。注意:使用前添加1 mM PMSF。
3. 蓝色上样缓冲液(SDS上样缓冲液):(#7722)。 配制新鲜的3 X还原性SDS上样缓冲液，在
3X SDS上样缓冲液中加入十分之一的30X的还原剂(1.25M)。
4. 蛋白A或G琼脂糖微球(用于未标记的一抗):(处理后可以在4?C保存2星期)。按照产品说明
处理。蛋白A用于兔IgG抗体的沉淀，蛋白G用于小鼠IgG抗体的沉淀。
5. 固定有抗生物素蛋白Streptavidin的微球(用于生物素标记的抗体): (#3419) 用前稍加震荡，
每个免疫下拉反应用10 μl。
6. 10X 激酶缓冲液:(#9802) 配制1 ml 1X激酶缓冲液时，取100 μl 10 X激酶缓冲液用900 μl
RODI水稀释到1ml，混匀。
7. ATP (10 mM): (#9804) 配制0.5 ml 200 μM ATP时，取10 μl ATP(10 mM)加入到490
μl 1X 激酶缓冲液中。
B. Preparing Cell Lysates细胞裂解物制备
1. 吸去培养基。加入含调节因子的新鲜培养基，处理所需的时间。
2. 在非变性条件下收集细胞，去掉培养基，用冰PBS清洗一次。
3. 去掉PBS，每个板(10cm)中加0.5 ml冰预冷的1 X细胞裂解液，在冰上孵育5分钟。
4. 将所有细胞刮下，收集到一个离心管中。置于冰上。
5. 冰浴中对样品用超声处理3次，每次5秒钟。
6. 4?C，14000 X g离心10分钟。将上清转移到新的离心管中，即为细胞裂解物。如有需要，样品可
以保存在-80?C。
C. 免疫沉淀
细胞裂解物预处理(对于未标记或生物素标记抗体而言是可选步骤)
1. 取200 μl 1 mg/ml的细胞裂解物，在其中加入10–30 μl 50%的蛋白A或G琼脂糖微球浆(用
于未标记的一抗)或10 μl抗生物素链菌素微球(用于生物素标记的抗体)
2. 4?C孵育30-60分钟。
3. 4?C离心10分钟。将上清转移到新的管中。
4. 根据所用一抗选择下面合适的操作步骤进行实验。
使用未标记一抗
1. 14,000 X g离心1分钟。取200 μl 1mg/ml的细胞裂解物，加入一抗。在4?C转子上孵育过夜。
2. 加入蛋白A或G琼脂糖微球(10-30 μl 50% 微球浆)。4?C转子上孵育1-3个小时。
3. 4?C离心30秒。沉淀用500 μl 1 X细胞裂解液洗五次。每次洗好后都置于冰上。
4. 取沉淀进行Western免疫印迹分析或是激酶活性分析(见下文)。
使用生物素标记的一抗
1. 14,000 X g离心1分钟。取200 μl 1mg/ml的细胞裂解物，加入生物素标记的一抗。在4?C转子
上孵育过夜。
2. 稍加震荡。加入固定化抗生物素链菌素(与微球偶联)(#3419)(10μl)。在4?C转子上孵育2
小时。
3. 4?C离心30秒。沉淀用500 μl 1 X细胞裂解液洗五次。每次洗好后都置于冰上。
4. 取沉淀进行Western免疫印迹分析或是激酶活性分析(见下文)。
使用固定化抗体(与微球偶联)
1. 14,000 X g离心1分钟。取200 μl 1mg/ml的细胞裂解物，加入固定化抗体10 μl。在4?C转子
上孵育过夜。
2. 4?C离心30秒。沉淀用500 μl 1 X细胞裂解液洗五次。每次洗好后都置于冰上。
3. 取沉淀进行Western免疫印迹分析或是激酶活性分析(见下文)。 D. 样品分析
继续下述任一种操作:
Western免疫印迹分析
1. 将沉淀用20 μl 3X SDS上样缓冲液重悬。震荡后离心30秒。
2. 把样品放在95–100?C加热2-5分钟。14,000 X g离心1分钟。
3. 取样15-30 μl加到SDS-PAGE胶(4–20%)上。
4. Western 免疫印迹分析检测(参考 Western Immunoblotting方法)。 注意:对于分子量约为50 kDa的蛋白，我们推荐使用小鼠抗兔IgG(轻链特异)(L57A3)mAb #3677或小鼠抗兔 IgG(构象特异)(L27A9)mAb #3678作为二抗，以减少变性重链产生的遮蔽作用。对于分子量接近25 kDa的蛋白，推荐使用小鼠抗兔IgG(构象特异) (L27A9)mAb #3678。 激酶活性分析
1. 沉淀用500 μl 1X激酶缓冲液清洗2次。置于冰上。
2. 将沉淀用添加有200 μM ATP和底物的40 μl 1X激酶缓冲液重悬沉淀。
3. 30?C孵育30分钟。
4. 加入20 μl 3X SDS上样缓冲液终止反应。震荡后离心30秒。
5. 将含有磷酸化底物的上清转移到新的管中。
6. 把样品放在95–100?C加热2-5分钟。14,000 X g离心1分钟。
7. 取样15-30 μl加到SDS-PAGE胶(4–20%)上。
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