噬菌蛭弧菌发展现状的综述.doc

噬菌蛭弧菌发展现状的综述.doc 噬菌蛭弧菌研究现状的综述 姓名 单位 摘 要:我们针对噬菌蛭弧菌的噬菌斑鉴别与纯化，菌种保藏方法及研究进展这三个方面进行综述。从中可以了解到我国及其他国家对蛭弧菌的研究现状。 关键词:噬菌蛭弧菌、鉴别、纯化、简易保藏 蛭孤菌(Bdellovibrio)是寄生于某些细菌并能导致其裂解的一类细菌，为细菌的寄生菌，其在自然界分布很广，从自然水域、污水及土壤中均可分离到。由于其能裂解多种细菌以及特殊的生活方式而使之 [1]具有生态学优势，故被认为是自然净化的生物因子之一。 根据GC比例，过氧化物酶、蛋白酶活性，耐药性和寄生性将蛭弧菌分为三种。它们分别是:噬菌蛭弧菌、斯托普蛭弧菌、斯塔尔蛭弧菌。噬菌蛭弧菌的GC比例较高，约为50.4?0.9mol%。过氧化酶呈阳性，对弧菌抑制剂0/129敏感，蛋白酶的活性相对较低，依赖于宿 [2]主繁殖。它在特殊条件下可转化为兼性腐生菌;斯托普蛭弧菌的GC比例(42-43mol%)，过氧化酶呈阴性，对弧菌抑制剂0/129呈抗药性，蛋白酶活性相对较高，宿主仅限于假单胞菌;斯塔尔蛭弧菌的GC比例较低，过氧化酶呈阳性，对弧菌抑菌剂0/129敏感，蛋白酶 [3]活性较高，可兼性寄生性，或可依赖宿主菌而生活。 1(1 噬菌蛭弧菌研究进展(冯晓英，顾玲，庄菱.江苏省卫生防疫站 210009) 近10年来欧、美等国在蛭孤菌(Bdellovibrio,以下简称Bd菌)菌的基 1 础研究方面较为深入，研究重点主要在Bd菌的生物学特性、蛋白合成、DNA组合、溶菌物质等方面。研究发现Bd菌在分子生物学方面具有许多独特性,蛭弧菌不能利用碳水化合物，但分解蛋白质的能力极强，它是利用多肽及氨基酸作为能源和碳源。蛭弧菌生长代谢过程中乙醛酸循环很弱，以不完全的三羧酸循环为主要代谢途径，蛭弧菌蛋白质的含量可达干重的60-65%，DNA含量为5%。蛭弧菌DNA合成的前体物质全部来自宿主细胞，蛭弧菌可直接利用单核苷酸作为前体物质， [5-6]合成其核酸。在Bd菌噬菌作用的机理研究方面，一般认为Bd菌依靠鞭毛快速运动，与宿主菌相遇后Bd菌高速旋转，同时释放一类胞壁质酶，迅速通过宿主菌细胞壁，侵入过程几秒钟便可完成，侵入宿主菌胞壁和膜之间(即所谓周质)，Bd菌失去鞭毛，在宿主菌细胞周质间生长繁殖，分裂成3-4个子代细胞，同时产生某种溶菌酶使宿主菌胞 [7]壁分解，子代游出进入下一繁殖周期，完成一代需要4小时。另有报道当Bd菌穿入宿主菌胞壁时，具有改变宿主菌胞壁成份的功能，如 [7]细胞壁脂多糖(LPS)结构的改变，使其失去毒性。这将为治疗内毒素血症提供一个可研究途径。 国内对Bd菌的研究从60年代中期开始。1966-1969年司稚东教授在上海郊县、崇明岛首次分离到Bd菌，并对沙门氏菌、志贺氏菌、假单胞菌、霍乱弧菌进行噬菌试验获得成功。后又对植物致病菌、水稻白叶枯病菌、白菜软腐病菌进行了Bd菌防治的研究。1980年在司稚东教授领导下的江苏省卫生防疫站弧菌噬菌体专业实验室开展了对Bd菌的系统性研究(包括生物学特性、培养保藏方法、生态学及污水净 2 化)，并证实Bd菌对多种肠道革兰氏阴性菌有噬菌、裂解作用。此项 [8-9]研究对国内开展Bd菌的研究起到重要的推动作用。80年代后期全国各地逐步开展了对Bd菌的研究,北京流研所呼兰、刘秉阳从人类粪便中分离到Bd菌，并用Bd菌防护豚鼠角膜感染获得成功。北京医科大学王秀茹对Bd菌不同水体的分布及对革兰氏阴性菌的净化作用进行了研究。华西医大、贵阳医大及四川、新疆等地对Bd菌生态分布与污水污染关系进行了研究,认为Bd菌与污水中大肠菌群数呈正相关(r = 0.7649,P <0.005),与细菌总数也呈正相关(r= 0.899, P<0.005)，可以用 [10-12]于污水监测指标及水源污染的调查。 近5年来在Bd菌的应用开发方面，国内开展了许多研究。江苏省卫生防疫站弧菌噬菌体专业实验室在用Bd菌防治家禽、家畜肠道细菌性传染病方面做了大量的工作。对雏鸡白痢病、鸡大肠杆菌病的防治现场实验中获得成功。在Bd菌对动物的毒理作用方面也进行了初步的 5研究，用Bd菌8×10 pfu/mL给予小鼠腹腔注射，经对照试验证明对小鼠无毒性反应。用Bd菌对致病菌攻击小鼠保护性试验中揭示Bd菌对 防制病菌攻击，减少死亡率与空白对照组比较有明显差异( P <0.05)[13-15]。1994年农业部文件，将Bd菌列入饲料药物添加剂允许使用的微生物有益菌类中。1995年上海大学生物医药中心邵桂元等人以鲫鱼出血性腹水病病原菌点状产气单胞菌(Aeromonas punctata)为宿主菌，从自然界分离到6株Bd菌均对此病菌有溶菌性。并在实验条件下对病原菌的自然净化作用方面进行了研究，为利用Bd菌控制鱼塘细菌性病害的发生，开展生物防治新技术提供了依据和途径。1997年厦门大学生 3 物系杨淑专等人在厦门沿海分离到Bd菌。Bd菌的数量与海水中弧菌类的数量成正相关。灭菌海水中只加入Bd菌，其数量出现负增长，若同时加入鳗弧菌8927菌株，则Bd菌数量增加并导致宿主菌数减少。以后他们又用Bd菌对25株对虾病原菌和大肠杆菌、枯草杆菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌采用双层琼脂平板法进行噬菌试验，结果 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 明不同Bd菌菌株的寄生范围不同，但所有供试宿主菌都能被某些Bd菌寄生，形成清晰的噬斑。他们的实验为利用Bd菌进行海产品养殖生物防治细菌 [16-17]感染提供了佐证。 Bd菌除寄生其它细菌外，自身还有所对应的噬菌体。Hashimoto等(1970年)从活水中检出和分离到兼性寄生的Bd菌噬菌体，噬菌体为大小60-70 nm之间的六角形，无尾，为单链DNA。Diedrich等1971年在美国肯塔基(Kentucky)的污水中分离到12株Bd菌噬菌体，其中7株具有广泛的宿主范围,包括多种Bd菌株这种能感染Bd菌的噬菌体在Bd菌中繁殖，是超寄生现象(hyperparasitism),有人称为“三位一体”，其3者的关系还有待进一步深入研究。有人设想利用这种生物间“三位一体”的关系进行遗传学研究及生物工程医药的开发造福人类，但至今尚未见有成功的报道。 1(2 噬菌蛭弧菌噬均斑的鉴别与纯化(王秀如，高璥，梁钢，邵立新.北京医科大学，公共卫生学院，卫生微生物组，北京 100083) 噬菌蛭弧菌是一类细菌寄生菌，以吸附和转入宿主菌体内增殖的 [18]方式将宿主菌裂解。希望利用这一生物学特性杀灭致病菌进化环境和水体的设想，曾引起一些环保学者的兴趣。为了对其进行研究，蛭 4 弧菌噬菌斑的辨认与纯化是首先需要解决的问 题 快递公司问题件快递公司问题件货款处理关于圆的周长面积重点题型关于解方程组的题及答案关于南海问题 。但多种捕食类微生物可形成不同类型噬菌斑这一特点国内外未见报道，致使有的研究者在噬菌斑的辨认上易造成混淆。本人利用1/500营养肉汤双层琼脂平板，在宿主菌与被检水样混合倾注的顶层上可观察到大小不等、形态不同的多种噬菌斑。 国内有关文献 报告 软件系统测试报告下载sgs报告如何下载关于路面塌陷情况报告535n,sgs报告怎么下载竣工报告下载 在双层琼脂培养基上蛭弧菌可形成大小不等 [19]的噬菌斑，最大直径可达15mm;中等者5mm;最小为0.5-1.5mm。本文证实了蛭弧菌形成较小的噬菌斑，鉴别方法除依据其形态、大小、扩散速度外，主要依据挖斑压片镜下形态观察，此法简单易行且较准确。至于噬菌斑的大小仅相对而言，如所用软琼脂层中琼脂含量较少，噬菌斑将会明显扩大，因此一般以用含有0.5,琼脂粉的上层实验时噬菌斑的形成较稳定。另外噬菌斑也于蛭弧菌的菌龄有关，它在保存液中的噬菌能力将随保存时间的延长而下降，它被传代时能形成的噬菌斑有时仅有针尖样大小。 [20] 国外分离蛭弧菌多采用微孔滤膜过滤法，用以除去原生动物或其他较大的杂菌，我们曾将水样分别经过1.2μm、0.8μm、0.65μm、0.45μm孔径的醋酸纤维膜过滤，噬菌斑的数量随滤膜孔径的减少而逐级减少，但最终滤液仍有可能与鞭毛虫形成的噬菌斑，分析原因，可能由于肉足虫类能伸缩变形，在经负压轴抽滤时有使其变形滤过的可能。 在水体自净中微生物之间有一个相互演替的过程，有材料认为微生物捕食群体的组成成分，主要包括三类捕食微生物，一类是原生动 5 物，特别是腰鞭毛虫和变形虫;第二类是蛭弧菌属细菌;第三类是专门捕食肠道细菌的捕食菌。这三类微生物捕食活力的大小，依次为原生动物、蛭弧菌、其他捕食菌。随着水体污染程度的改变，这一微生物捕食群体也会随之变化。本次实验中观察到，医院污水细菌数在7910-10cfu/mL，用其水样制成双层平板，出现大小不一、形态多样的 45噬菌斑，其中大斑、中斑占较大比例，河水中细菌数为10-10cfu/mL，小斑占有优势，这一现象是否说明随着水体被污染的程度不同，原生动物与蛭弧菌等捕食微生物在水体中的比例也会发生变化。 因此，如果设想用蛭弧菌净化污水，原生动物与蛭弧菌之间的消长关系，应列为基础实验研究之一。另外。实验证明，单纯依靠蛭弧菌达到净化的目的，是有许多实际问题有待进一步讨论的。 1(3 噬菌蛭弧菌简易保藏方法的研究(秦生巨.司樨东.江苏省卫生防疫站，南京) 噬菌蛭弧菌(Bdettovibrio bacteriovorus以下简称蛭弧菌)保藏方法的研究，最早见于1962年stolp等的报道。20多年来，许多实验室进行了探索。尤其对于蛭弧菌存活的温度及时间，各家的结果很不一致。一般实验室习惯于宿主软琼脂室温保存，每月转种一次的方法。为了探索蛭弧菌有效的更为简便的保存方法，我们对1981年于我国自然水(或泥)体中分离、纯化的蛭弧菌株任择其中12株，在实验室条件下，对蛭弧菌在自来水宿主软琼脂中存活的时间及其数目的变化进行了观察。现将得到的结果报道如下。 蛭弧菌接种在自来水宿主琼脂双层平板中，于25 ?培养40-48小 6 时，取蛭弧菌单噬斑数个，于灭菌自来水液中浸泡4个小时以上，随后吸取0.5-1.0mL的上清液，0.3-0.5mL宿主菌悬液加到8mL的自来水软琼脂中，充分混匀。于25?培育l6-20小时，取出放4?冰箱保藏。每隔l-3日检测一次蛭孤茵的存在情况(噬斑数的形成)。 自来水宿主软琼脂4?保存对蛭弧菌活力的影响。从12株蛭弧菌(Bd32、Bd40、Bd59、Bd64、Bd76、Bd81、Bd83、Bd98、Bdll2、Bdl25、Bdl27、Bd296)在自来水宿主软琼脂中，于4?冰箱保存的时间来看。发现蛭弧菌在自来水宿主双层琼脂平扳上，保存91天后，均可形成噬斑;保存l57和188天，有ll株形成噬菌斑;240天有8株;3l5天有7株;372天有6株;41l天有3株;548天有2株可形成噬斑。以保存9l天形成噬斑的蛭弧菌株数(12株)为l00,，则保存l57和l88天、240、3l5、372、4l1和548天形成噬斑的菌株存活率分别为91.7，66.7，58.3，50.0，25.0和l6.7,。保存600天以上全部菌株均检不出噬菌斑。 另一方面，从保存的自来水宿主软琼脂外观看，发现有部份蛭弧菌株有液化琼脂的现象，如Bd83保存60天以上可见轻微的液化，保存的时间越长，液化的现象越显著，但与蛭弧菌的存活时间无明显关系。引起液化的原因尚不清楚，有待进一步探讨。 在研究蛭弧菌的过程中，对蛭弧菌培养物必须建立良好的保存方 [21]法。目前普遍使用的蛭弧菌保存方法是1963年stolp介绍的，在含有宿主菌细胞的YP(酵母浸膏一蛋白胨)或自来水琼脂中保存，每月转种 [22]培养一次的方法。1968年Burger等发现在YP软琼脂中保存蛭弧菌培 )[23]养物，蛭弧菌的效价很不稳定。Huang等(1969报道，在4?冰箱中 7 保存蛭弧菌培养物，4-8个月蛭弧菌在加有宿主的软琼脂中仍能保持 [24]一定的活力。秦生巨等(1987)报道，蛭孤菌在灭菌自来水中于4 ?冰箱保存180-240天，大部份菌株不丧失活力。MocKBmHHBa等 [25](1979)报道，蛭孤菌在高压灭菌的自来水中，生存时间可述160天以上。本研究结果证明，用自来水宿主软琼脂保存蛭弧菌培养物，至少可保存5个月以上，转种一次也不致影响细菌的生活力。既提高工作效率，又节省物力。因此该法是保存蛭弧菌的一种简便可靠的方法。 参考文献 [1] Diss F F et a1(Appl Microbio1(1985,13,257 [2] 司稚东.秦生巨等.细菌的寄生,噬菌蛭弧菌的研究.中华微生物和免疫学杂志,1982.2.12. 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