雷帕霉素促成骨及与成骨诱导剂和电磁场联合作用研究

雷帕霉素促成骨及与成骨诱导剂和电磁场联合作用研究 雷帕霉素促成骨及与成骨诱导剂和电磁场联合作用研 究 分 类 号学 号 M200975750 学校代码 10487 密 级 硕 士 学 位 论 文 雷帕霉素促成骨及与成骨诱导剂和电磁 场联合作用的研究学位申请人: 易智谦 学 科 专 业 : 外科学 指 导 教 师 : 吴 华 教授 答辩日期: 2012 年 4 月 A Dissertation Submitted in Partial Fulfillment of the Requirements for the Degree of Master of medicine The Osteogenesis Effect of Rapamycin and the Synergism with Osteogenesis inducer and the Electromagnetic FieldCandidate : Zhiqian Yi Major : Orthopeadics Supervisor : Prof. Wu Hua Huazhong University of Science & Technology Wuhan 430030, P. R. ChinaApril, 2012独创性声明 本 人 声 明 所 呈 交 的 学 位 论 文 是 我 个 人 在 导 师 指 导 下 进 行 的 研 究 工 作 及 取得的研究成果。 尽我所知, 除文中已经标明引用的 内容 财务内部控制制度的内容财务内部控制制度的内容人员招聘与配置的内容项目成本控制的内容消防安全演练内容 外, 本 论文 政研论文下载论文大学下载论文大学下载关于长拳的论文浙大论文封面下载 不包含 任何其他个人或集体已经发 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献 的 个 人 和 集 体 , 均 已 在 文 中 以 明 确 方 式 标 明 。 本 人 完 全 意 识 到 本 声 明 的 法 律 结果由本人承担。 学位论文作者签名: 日期: 年 月 日 学 位 论文 版 权使 用 授权 书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、 使用学位论文的规定, 即: 学校有 权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版, 允许论文被查阅和 借阅。 本人授权华中科技大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据 库进行检索,可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 保密?,在年解密后适用本授权书。 本论文属于 不保密?。 (请在以上方框内打“ ?”) 学位论文作者签名:指导教师签名: 日期: 年月日 日期: 年 月 日 目 录 缩 略词 表 1 中 文摘 要 2 Abstract4 前 言 6 材 料和 方法. 8 结果16 讨 论和 结论26 参 考文 献 29 综 述. 31 参 考文 献 41 致 谢44 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 缩略词 表 英文缩略词 英文全称 中文全称EMFelectromagnetic field电磁场 BMP-2 bone morphogenesis protein -2 骨形态发生蛋白-2 Runx2 runt-related transcription factor 2 家禽相关转移因子-2 BSP/IBSP Integrin-binding sialoprotein骨黏蛋白OPNosteopontin 骨 桥蛋白 RAPA rapamycin雷帕霉素 LFEMF low frequency electromagnetic field低频地磁 场 PEMF pulsed electromagnetic field 脉冲电磁场 Sti stimulation刺激 1华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 中文摘要 目的: 研究不同浓 度间 雷帕霉素促成骨 效率及 探讨雷帕霉素与 成骨诱 导剂及电磁场联 合作用的效果 方法: 1 取 60~80g 雄性 SD 大鼠的骨髓间充 质干细胞,分离培养,3 代后接种六孔 板,分为三个时间段研究 7 天,14 天,21 天 :其中每个时间段分两个大组,第一大 组分组为: ?对照组, ?成骨诱导剂组, ?1nM 雷帕霉素组 (后面简称雷组) , ?5nM 雷组, ?10nM 雷组?20nM 雷组, 第二大组分组为 ?对照组, ?成诱组, ?1nM 雷+ 成诱组, ?5nM 雷+ 成诱组 ?10nM 雷+ 成诱组 ?20nM 雷+ 成诱组,分别于 7 日,14 日,21 日提取相应细胞 RNA ,通过 real-time qPCR 检测 RUNX2 ,BSP 及 OPN 基因 的 表 达 量 , 作 图 对 相 应 数 据 进 行 分 析 , 将 第 一 大 组 和 第 二 大 组 联 并 在 一 起 比 较 ; 对雷帕霉素与电磁场联合通用的研究分组为: ?对照组,?5nM 雷帕霉素+ 成诱组, ?电磁场刺激组 (1mT ,15Hz ,4h/d), ?电磁场刺激+ 雷帕霉素组, 分别于 7 日,14 日,21 日提取细胞 RNA 及蛋白, 并行茜素红染色, 用 real-time qPCR ,WB 及钙结节 计数,检测在基因,蛋白质水平及钙结节方面的变化,进行分析。 结果: 雷帕霉素早期即 有明显的促成骨效应, 其早期成骨效应相比较成骨诱导剂为低, 但明显高于对照组,不同浓度间以 5nM 雷帕霉素成骨效果好,在中期单纯不加成骨 诱导剂的 5nM 雷帕霉素促成骨效应已优于成骨诱导剂, 其余浓度雷帕霉素低于成诱, 晚期各浓度雷帕霉素成骨效率均高于成骨诱导剂; 早中晚期雷帕霉素与成骨诱导剂联 合均有较好的协同效应, 其成骨效率均高于单 纯成骨诱导剂和单纯雷帕霉素组; 其成 骨效应随时间推移在不断加强,5nM 雷帕霉素在不同时期, 加或不加成骨诱导剂, 均 高于同 组其他 浓度 的雷 帕霉素 组, ;1mT ,15Hz ,4h?d 正旋波 电磁 场 在早期 无明显促 成骨效应, 而中晚期促 成骨效应非常明显, 电磁场与雷帕霉素联合应用时成骨效率明 显低于单独雷帕霉素诱导组。 结论: (1) 雷帕霉素有 明显促成骨效应, 且随时间推移成骨效应不断加强; (2) 5nM 雷帕霉素成骨效率高于同组其他浓度雷帕霉素组; (3) 成骨诱导剂和雷帕霉素协同促 2华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 成骨, 彼此扩 大成骨 效 率; (4)1mT,15Hz ,4H/d 电磁 场早期 无明显 促成骨 ,而中期 晚期促成骨效果很好; (5) 电磁场部分拮抗雷帕霉素促成骨效应, 减弱雷帕霉素成骨 作用; (6)本实验研究范围内,最佳促成骨条件为 5nM 雷帕霉素+ 成骨诱 导剂; 关键字:雷帕霉素,成骨 效应, 成骨诱导剂,电磁场, 协同 3华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 The Osteogenesis Effect of Rapamycin and the Synergism with Osteogenesis inducers and the Electromagnetic Field Abstract Objective: To study about the osteogenesis effect of different concentration of Rapamycin and the synergism with osteogenesic inducers and the Electromagnetic Field Methods: We isolate the bone marrow mesenchymal stem cells from 4-week-old Sprague ?Dawley rats (male,60~80g ) and culture them. The bone marrow mesenchymal stem cells from passage three are transplant into the plates.1 We divide the stem cells into groups about:Control group, osteogenesis inducers group, 1nM Rapamycin group, 5nM Rapamycin group, 10nM Rapamycin group, 20 nM Rapamycin group and relative concentration group add with osteogenesis inducers. After 7days, 14 days and 21 days of stimulation, we extract the RNA from relative groups and explore the expression of the RUNX2, BSP, OPN. Then we make plotting and analyse the data; 2divide the cells into four groups: control group, 5nM Rapamycin group, Electromagnetic field group, the Rapamycin+EMF group, we extract the proteins and the RNA and use the alizarin red to stain the calcium disposition about 7d, 14d, 21d stimulation respectively. Then we use WB and RT qPCR and alizarin to detect the resultResults: Rapamycin has a promoting osteogenesis effect which is appreciably lower than the osteogenesis inducers in the early period but much higher than the control group. The 5nM Rapamycin has a best effect than other groups in different concentration; 5nM Rapamycin has a much better effect than the osteogenesis inducers in the extended period while other groups are apparently lower than the Osteogenesis induces; all groups which contains Rapamycin have better osteogenesis effect than the osteogenesis inducers group in the late period and Rapamycin has a very profoundly promoting synergism effect with osteogenesis inducers during all periods, and the osteogenesis effect is greatly enhanced 4华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 with stimulating time, 5nM Rapamycin has a much more strong effect than other groups in all period; 1mT, 15Hz, 4h/d EMF does not show a distinct osteogenesis effect in the early period, on the contrary, the EMF does show a strong effect in the middle and late period, the synergism group of Rayamycin and EMF has a much lower effect than the EMF and Rapamycin groupConclusions:1Rapamycin has a profounding promoting effect of osteogenesis and the effect is strengthened with stimulation time, 25nM Rapamycin group is much more effective than other Rapamycin groups, 3 Rapamycin has a very profoundly promoting synergism effect with osteogenesis inducers during all periods , 4)1mT,15Hz,4h/d EMF does not have an obvious osteogenesis effect in the early stimulating period, but is very effective in the middle and late period, 5EMF has an antergic effect with the rapamycin on osteogenesis effect Key words: Rapamycin, osteogenesis effect, osteogenesis inducers, the EMF, synergism 5华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 前 言[1 ,2] 雷 帕 霉 素 ( ( 西罗莫 司、Sirolimus 、Rapamycin ) ) 是 mtor 通 路的特异性阻 滞剂,为新型大环内酯 的抗排斥药物,1975 年科学家在号称世界最 神秘的岛屿- 智利 的复活节岛的土壤中将其提取。 世界上目前公 认为最新的强效的免疫相关抑制剂, 在 临床上用于自身免疫性疾病的治疗和器官移植的抗排斥反应等等。 现行临床广泛使用 的环孢素的免疫抑制活性相对于雷帕霉素要弱 数十倍, 雷帕霉素的毒 性很低, 用量极 小(平均每人 一天只 用 2mg ) ,在发达 国家 医院里常与环孢 素合用 ,与它有协同免 疫 加强 抑制作用。[3] 同时 雷帕霉素是无神经毒性的, 而且对 肾的毒性最低的新型免疫抑 制剂。 美国已在全球八 十多个移植中心进行近一千三百例的移植肾试验, 副作用极小, 而且效果很显著。 Nature 杂志同样报道雷 帕霉素是目前发现的唯一可以有效延长哺乳动物寿命的药物 。 科学家在新的研究中, 将二十个月的小鼠 (大致是人类的六十岁) 的食物里面加入少 量雷帕霉素作为添加物, 能让雄性鼠的生命平 均延长百分之九左右, 雌鼠生命延百分 之十三。哈佛 大学医学院里面 Paul 人体及动物衰老机理实验室的 DAVID 教授认为, 这是一项非常激动人心的发现,因为他说明了 RAPAMYCIN 同样 可以在哺乳动物上 延长寿命。这项发现和研究必然为未来药物的研究翻开了崭新的一页 [4] 近 期 研 究 Kyu-Won Lee 等 发 现 雷 帕 霉 素 有 一 定 的 促 成 骨 效 应 , 但 并 未 具 体 研 究 其 成 骨 效 应 如 定 量 考 虑 效 应 及 不 同 浓 度 雷 帕 霉 素 的 促 成 骨 效 应 。 [5] 自 二 十 世 纪 七 十 年 代 初 期 , 著 名 矫 形 外 科 专 家 bassett 用 低 频 电 磁 场 作 为 一 种 非 侵 入 式 治 疗 骨 不 连 取 及 骨 延 迟 愈 合 取 得 成 功 后 , 很 多 研 究 者 在 临 床 和 基 础 实 验 室 里 分 析 试 验 , 研 究 低 频 电 磁 场 在 分 子 , 细 胞 , 组 织 形 态 以 及 临 床 观 察 方 面 作 用 机 制 。 据 报 道 ,BASSETT 研 究 , 自 从 1981 年 来 , 全 世 界 范 围 内 电 磁 场 对 一 千 余 例 骨 折 不 愈 合 的 治 愈 率 为 87% , 并 且 美 国 FDA 认 证 了 电 磁 场 在 骨 折 不 愈 合 间 的 作 用 , 该 仪 器 基 于 骨 折 对 机 械 应 力 发 生 反 应 的 wolff 定 理 , 旨 在 缺 乏 正 常 力 负 荷 下 刺 激 以 达 到 促 骨 折 愈 合 , 用 诱 发 电 流 代 替 内 生 性 电 流 的 非 侵 入 性 手 段 , 6华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 而 具 体 生 物 机 制 处 于 不 甚 明 朗 状 态 , [6]Patterson 研 究 电 磁 场 可 以 激 活 AKT-mTOR 通 路 , 短 期 电 磁 场 刺 激 既 可 以 激 活 mtor 通 路 , 导 致 了 磷 酸 化 mtor , 即 p-mtor 增 多 。 本 论 文 旨 在 研 究: 1 单 纯 的 雷 帕 霉 素 促 成 骨 效 应 及 其 与 成 骨 诱 导 剂 协 同 促 成 骨 效 应 。 2 不 同 浓 度 间 雷 帕 霉 素 及 成 骨 诱 导 剂 促 成 骨 效 应 的 比 较 。 3 雷 帕 霉 素 与 电 磁 场 的 协 同 效 应 。7华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 材 料和 方法 一 材料 1. 实 验动 物 均取自同济 医学院实验动物中心,清洁级 SD 大鼠,雄性, 60~80g 。 2 电 磁 场发生 器 :由武 汉市海军工程大学制备,是用直径 30cmHelmholtz 线圈,能连 续可调的产生 0 75Hz 磁感应强度为 1mT 正弦波电磁场, 磁场的强度频率均由示波器 ~ 来检测。在线圈中心 7cm 的球形区域,电磁场的生物刺激一致性超过 90% 。 3 主要试剂: 胎 牛 血 清 (Gibco 公 司 ) ,DMEM F12 培 养 基 (Hyclone 公 司 ) , TRIZOLInvitrogen 公司 , 胰蛋白酶 (Amersco 公司) , 茜素红 (北 京华迈科生物技术 有限责任公司) , 逆转录试剂盒 (中国 transgene 公司) ,SYBO Green 荧光定量试剂盒 中国 transgene 公 司 ) , 青 链 霉 素 混 合 液 (Solarbio 公 司 ) , 兔 抗 大 鼠 RUNX2 抗体 (NOVUS ) , 雷 帕 霉 素 Rapamycin 购 于 上 海 碧 云 天 公 司 , 兔 抗 大 鼠 BMP-2 抗体 (NOVUS 公司) ,羊抗 兔 HRP 标记二抗(Cell Signaling Technology 公司) ,RIPA 细 胞裂解液 (上海碧云天生物技术公司) , 凝胶制备试剂盒 (武汉 Boster),ECL 发光液 (thermo ) ,地塞米松磷酸钠, β 磷酸甘油钠及抗坏血酸购于武汉大风公司 4 仪器 :高速离心机 Heal Force IQ5 荧光定量 PCR 仪, Bio-rad PCR 仪, eppendorf Mastercycler 蛋白核酸检测仪, eppendorf biophotometer 相差倒置显微镜, Nikon 5 引物 引物均有 invitrogen 公 司合成,引物序列如下 1)GAPDH ,上游序 列 ?5-GACAACTTTGGCATCGTGGA-3,下游序 列 ?5-ATGCAGGGATGATGTTCTGG-3;2)骨 桥蛋白,上游序列 5- CAAGGACCAACTACAACCA -3,下游序列 5-GGAGACAGGAGGCAAGG- 3;3) RUNX2 ,上游序列 ?5-CAAGTGGCCAGGTTCAACGA-3,下游序列 ?5-TGTGAAGACCGTTATGGTCAAAGTG-3 ;4)骨唾液酸蛋白,上游序列 8华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 ?5-AGAAAGAGCAGCACGGTTGAG-3,下 游序列 ?5-TCATAGCCATGCCCCTTGTAG-3 二. 实 验方 法 1.骨髓间充质干细胞的提取及培养方法 [7] 按照国家实验动物使 用准则,将 SD 大鼠颈 椎脱臼法处死,浸泡在 75% 酒精里 15 分钟后, 用剪刀剪开大鼠腿部皮肤, 逐层将双下肢皮肤与肌肉完全分离, 沿大鼠髋臼 处用无菌剪刀将大鼠和双腿分离, 分离的双腿放置于预冷 PBS 里浸泡, 换小剪刀逐步 分离肌肉筋膜, 将骨头与之分离, 剔除干净后分离胫骨及股骨, 换无菌剪刀剪除股骨 及胫骨两端,用 5ml 注射器吸取含 10% 胎牛血清及链霉素- 青霉素抗生素的培养基反 复冲洗股骨及胫骨髓腔, 待髓腔颜色变淡, 冲洗充分后, 用无菌滴管在培养基里反复 6 吹吸,计数、离心、调整细胞浓度到 5?10 个/ml ,接种于两支 50ml 无菌培养瓶里 , 0 置于 5%CO 、37 C 、 饱和湿度的细胞培养箱中培养。 三天后首次换液, 以后每三天换 2 液一次, 约十天后细胞铺满 80%-90% 瓶底时, 先用 PBS 洗两次, 再用消化液 (为 0.25% 胰酶+0.02%EDTA+无菌 PBS ) 消化以后按照 1:2 传代培养, 并于相差倒置显微镜下观 察细胞生长状态。 2.接种,分组,特殊培养基的配制,刺激, 5 用生长状态较好的第三代骨髓间充质干细胞, 按照 1?10 个/ 孔接种细 胞于六孔板细胞 培养皿中。接种后第二天将将所有培养皿编号,按照完全随机化原则进行分组 1) 研究不同浓度雷帕霉素促成骨效应及与成骨诱导剂联合效应研究的分组如下: 按 7 天,14 天,21 天刺激,共分三大组,且七天,14 天,21 天刺激分组完全 相同 每大组又分为两小组, 其中第一小组又分六组为: 1 ) 为 单 纯 培 养 基 组 ( 对 照 组 ) 2)为 成 骨 诱 导 剂 组 ( 成 骨 诱 导 剂 )3)为 1nM 雷 帕 霉 素 组 (1nM 雷 帕 霉 素 ) 4)为 5nM 雷 帕 霉 素 组 (5nM 雷 帕 霉 素 ) 5)为 10nM 雷 帕 霉 素 组 (10nM 雷 帕 霉 素 ) 9华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 6)为 20nM 雷 帕 霉 素 组 (20nM 雷 帕 霉 素 ) 第 二 小 组 分 组 为 1 ) 为 单 纯 培 养 基 组 ( 对 照 组 ) 2)为 成 骨 诱 导 剂 组 ( 成 骨 诱 导 剂 )3)为 1nM 雷 帕 霉 素+ 成 骨 诱 导 剂 组 (1nM 雷 帕 霉 素+ 成 骨 诱 导 剂 ) 4)为 5nM 雷 帕 霉 素 组 (5nM 雷 帕 霉 素+ 成 骨 诱 导 剂 ) 5)为 10nM 雷 帕 霉 素 组 (10nM 雷 帕 霉 素+ 成 骨 诱 导 剂 ) 6)为 20nM 雷 帕 霉 素 组 (20nM 雷 帕 霉 素+ 成 骨 诱 导 剂 ) 其 中 成 骨 诱 导 剂 的 配 方 为 ,,地塞米松 磷酸钠,5.16ug β 磷酸甘油钠 0.216g 抗坏血酸 0.005g DMEM 培 养 基 100ml配 置 是 先 用 量 筒 去 适 量 培 养 基 , 然 后 等 比 例 去 相 应 量 的 地塞米 松磷酸钠, β 磷酸 甘油钠及抗坏血酸加入培养基中, 搅拌子搅拌, 待溶液清亮提示溶解完全后, 将培养 基用滤器过滤, 锡纸避光保存; 雷帕霉素购于上海碧云天公司, 为油性液状, 可直接 溶于培养基中, 雷帕霉素培养基配制完全后, 同样需避光低温保存, 换液时六孔板每 孔添加 2ml 培养基,每两天换一次液。2雷 帕 霉 素 和 磁 场 协 同 效 应 的 研 究 分 组 如 下 : 1 对 照 组(2 ) 雷 帕 霉 素 组(3)电磁场刺激组 (4)电磁场+ 雷帕霉素刺激组 其中雷帕霉素组培养基中雷帕霉素浓度为 5nM ,并含有成骨诱导剂(配方如前所示) 电磁场刺激强度为 1mT ,频率 15Hz ,放置于线圈中心,刺激 4h 每天 3. 细胞总的 RNA 提取,逆转录及 REAL-TIME qPCR 步骤: 细胞总 RNA 提取 10华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 刺激时间满后,吸干培养液,用预冷 PBS 清 洗三次,后吸干 PBS, 加入冰的 Trizol , 每孔加入 1ml Trizol,用 1ml 枪反复吹吸, 待 浑浊 Trizol 变清亮后, 移入 1.5ml 离心管 中,放置冰上,做上标记。 每离心管加入 200ul 氯仿后,剧烈震荡 30 秒,室温放置 20 分钟。 高速离心,12000 转每分钟,4 摄氏度,离心 15 分钟。 离心结束后, 取出离心管, 可见分层明显, 上层无色清亮, 下层淡红色, 吸取无色上 清 400ul 移入新的 1.5ml 离心管中,置于冰上,做好标记,加入 500ul 异丙醇,剧烈 混匀,冰上静置 10 分钟,然后高速离心,4 度,12000 转,10 分钟。 离心完后, 丢弃上清液, 用预冷的冰乙醇 (75% 乙醇+25%DEPC 水) 浸泡于离心管中, 轻弹数次,再次高速离心,4 度,9000 转,6 分钟。 离心完后, 弃上清液, 离心管里残留有少量液体, 快速风干, 但不完全干燥, 再根据 离心管里沉淀的量,选择适量的灭菌去离子水加入离心管中。 打开蛋白质核酸检 测仪, 预热, 用灭菌去离子水清洗后干燥, 将提取的 RNA 用 DEPC 水稀释若干倍数后用蛋白质核酸检测仪检测稀释后 RNA 浓度, 并计算稀释前 RNA 浓 度。 逆转录 取 RNA 总量 4ug , 加无 菌 DEPC 水补足总量到 8ul , 取逆转录试剂盒 2*TS 试剂 10ul , 1*TS 1ul, random primer 1ul, 瞬时离心,逆转录条件 0 PCR 仪上 25 C,10 分钟 0 42 C ,30 分钟 ; 0 85 C ,5 分钟 ; 在瞬时离心后,放置于-20 度冰箱保存将样品放置于 8 联 管中 , 每 管 中 加 入逆 转 录完 的 cDNA 1ul ,相应的引物 1ul , 2*SYBO GREEN 10ul ,灭菌 DEPC 水 8ul , 瞬时离心,每个样品设置 3 个副孔, 11华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 1 )95 度预变性 1 分钟, 2 )95 度变性 15 秒, 60 度退火,45 个循环; 3 )95 预变性 1 分钟; 4 )55 度退火 1 分钟, 5 )55 度 10 秒钟,81 循环, 将所得数据用 SPSS13.0 版进行统计处理并分析,看是否比较具有统计学差异。 4. 细胞蛋白提取,western-blot 检测 刺激完毕后,用预冷 PBS 冲 洗 细 胞 , 冲 洗 三 次 后 , 每 孔 加 入 100ulRIPA 裂解 液及 1ulPMSF, 用细胞刮反复刮除细胞, 用 1.5ml 离心管收集刮除的裂解液, 置于冰块上半 小时, 让其充分裂解。 半小时后, 将离心管置入高速离心机内,12000 转每分,4 度, 22 分钟离心。 离心结束后,收集离心管内上清液,做好标记。 蛋白浓度的测量: 取 BCA 试剂盒,按 A 液与 B 液 50:1 的比例 混匀,将 BCA 液与蛋白混合,同时加入 少量水稀释蛋白浓度,同时多出的一管设置空白对照,37 度 BCA 孵 育半小时,用蛋 白 质 核 酸 检 测 仪 检 测 蛋 白 浓 度 , 用 标 准 曲 线 调 整 蛋 白 浓 度 后 , 加 入 5*loading buffer 后, 将蛋白放入 100 度水浴锅里水浴 5~10 分钟, 水浴结束后蛋白放置-20 度冰箱保存。 1 制胶和加样 先将玻璃片洗好,用去离子水冲洗,晾干后,用夹子将玻片夹紧,开始制胶。 按需要检测的蛋白分子量大小,配制相应浓度的胶。7.5% 10%15% 2×Sep. buffer4ml 4ml4ml 30% Gel.sol2.0ml 2.7ml 4ml ddH2O 1.9ml 1.2ml 0 TEMED 8ul8ul8ul 10%APS 80ul80ul 80ul 12华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 SDS 80ul80ul 80ul 制好分离胶后,上面用水封,以促使分离胶更好凝固及塑型。 观察分离胶与水面, 当出现明显折线的时候, 再等待五分钟, 倒掉分离胶上的水, 用 新滤纸吸干,配制好相应浓度的浓缩胶,将已洗好 晾干的梳子插进浓缩胶里面,当 观察到浓缩胶与分离胶间的折线又一次出现的时候, 等待 5 分钟, 将玻片放入电泳槽 里, 槽里上电泳液, 从 内槽开始加 , 漫出内槽, 当外槽电泳液接近电泳槽高度二分之 一的时候,停止添加电泳液。 拔掉梳子,按正确顺序添加 marker 和蛋白。 2 电泳 电泳缓冲液的配制 Tris 3.03g 甘氨酸 18.77g SDS 1g 蒸馏水至 1000ml 当 marker 和蛋白加入 完毕后, 接通电泳仪电源, 将电线连好, 红线对红极, 黑线对黑 机,一般电泳的条件是 80v 跑 30min 后 120v 跑 1hour20min 。 3 转膜 5*转膜液配制 TRIS 碱 15g 甘氨酸 72g 蒸馏水至1000ml 4 度保存 使用时 5*转膜液 100ml 甲醇 100ml 去离子水300ml 稀释后使用 当电泳结束前二十分钟, 应开始准备转膜所需材料, 配制好转膜液, 当待转蛋白分子 13华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 量大于 150kd 的时候, 应加入 0.1%SDS , 准备 好新的裁剪好的滤纸, 小翘板, 转膜夹, 裁剪好的 0.45um 的 PVDF 膜。电泳结束后 ,取出玻片,放置于浸泡着转膜液的盘子 中, 用小翘板沿着玻片边缘慢慢撬起, 当胶与玻片完全分离是, 小心裁剪分离胶, 截 取适当大小的胶, 放置于三层滤纸和海绵上, 胶贴近附近, 将之前准备好的 PVDF 膜 放置于甲醇中活化 1~2 分钟后, 置于转膜液中, 贴于胶上, 去除胶和 PVDF 膜间气泡 及各滤纸间的气泡,PVDF 膜上再盖三层滤 纸及一层海绵,转膜夹夹紧,开始转膜。 一般条件是 200mA 20kd 大小的分子转膜时间为 1h30min , 每增加 10kd 分子量, 转膜 时间增加 10min 。 4 封闭 转膜期间配制好封闭液,用 5% 脱脂奶粉加上 TBST 混匀而成。转膜结束后,将膜取 出,放置于 EP 手套修剪好的小塑料带中,用热封口器封掉三面,留下最后加入封闭 液,然后用热封口器将剩下的最后一面封闭完。 5 孵育一抗 常温 1~2 小时封闭,封闭结束后,将 PVDF 膜 取出,一角接触干净滤纸,微微吸干。 用封闭液, 如 BSA 或 non-fat milk 按比例稀释一抗, 混匀后将 PVDF 膜放入一抗, 步 骤同封闭。 一抗孵育好后,放置摇床上,4 度过夜,一般孵育 16~18 小时。 6 洗膜 孵育结束后, 将一抗回收, 把 PVDF 膜放入新 配置的 TBST 里洗, 每 次洗 5 分钟, 洗 完后换新的 TBST, 一共洗 5 次。 7 孵育二抗 洗完后,配制二 抗,一般用 BSA 或 non-fat milk 按 1:5000 的比例稀释 HRP 相应抗 一抗的抗体,室温孵育 2 小时或 37 度摇床 1 小时。 二抗孵育结束后同样将 PVDF 放入 TBST 中洗膜, 一般也是每次洗 5 分钟, 洗完后换 新的 TBST,一共洗 5~6 次,洗膜的程度直接决定了曝光时背景的深浅。 8 曝光 洗膜结束后曝光。 14华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 用超敏 ECL 显影,将 ECL 试剂,显影液,定 影液,清水,胶片,移液器,枪头盒, 干净滤纸,保鲜膜准备好,放入暗室中。先将 ECL 里的 A 液,B 液按等比例稀释混 匀, 将显影液, 定影液配制好后倒入小盆里。 从 TBST 中取出 PVDF 膜, 用滤纸吸干, 放置于两层保鲜膜间,将混好好的 A 液 B 液均匀的涂抹在 PVDF 膜的表面,将膜边 缘的 ECL 吸干,盖上 保鲜膜,关上暗室红灯。观察曝光情况,如果荧光很亮,将胶 片剪好适当大小,放置于 PVDF 膜上曝光 10 秒~2 分钟,如荧光很暗或看不清楚,可 将 PVDF 膜, 胶片放入 压盒中曝光数小时, 胶片同时放置多层。 曝光后, 先将胶片放 入显影液中,如显影液清亮,一般示曝光效果好,如显影液浑浊,则需更换显 影液。 放入清亮显影液中后, 摇晃胶片, 如胶片显色, 出现明显条带, 则将 胶片移动清水中 清洗数下,再放入定影液中,胶片放入显影 液中时间必须控制好,否者易曝光过度, 定影结束后, 将胶片从定影液中取出, 同样放入清水中清洗数次, 将显影液, 定影液, 胶片回收,ECL 盖好, 将胶片取出自然风干。 根据胶片上相应蛋白曝光条带的灰度值与 β-actin 或 GAPDH 等内参的灰度值相除, 即 可比较不同分组间蛋白表达量的多少。 5. 茜素红染色,钙结节计数 将样品取出, 用移液器吸干待测细胞的培养基, 用预冷的 PBS 清洗, 沿着六孔板边缘 加入缓慢加入, 轻微震荡后吸出 PBS , 一共洗三次。 提前将 4% 多聚 甲醛放入室温中, 融化,将融化好的 4% 多聚甲醛沿六孔板边缘缓慢加入六孔板中, 固定约 15~20 分钟 后,吸出 4% 多聚甲醛,用双蒸水洗一遍后,用 4% 的茜素红 PH 值为 8.3(为 0.1M Tris-HCL 配置 ) 移入 六孔板中, 室温染色 30 分钟后, 移出茜素红 , 再用双蒸水清 洗 两次,每样品随机选取 10 个 40 倍视野照相,所得图片用 Image-Pro Plus 分析图像软 件进行分析。 15华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 结果 1 间 充 质 干 细 胞 的 体 外 分 体 培 养 图一如 上 左 图 所 示 元 代 间 充 质 干 细 胞 , 呈 长 梭 形 , 细 长 杆 状 。 右 图 为 三 代 间 充 质 干 细 胞 , 可 见 细 胞 形 态 向 多 角 型 变 化 , 细 胞 变 短 边 粗 。 2 雷 帕 霉 素 刺 激 七 日 后 成 骨 的 real-time Pcr 指 标 图 。 图二 可以发 现在 七日 药物 五成 骨组中 , 第 二组 明显 高于 其他组 , 即 成骨 诱导 剂七 日成骨 的效 果要 好 于 雷帕霉素及单纯培养基组,而在雷帕霉素组与组之前比较,20nM 雷帕霉素早期成骨效果要好 于 其他浓 度的 雷帕 霉素 组差 异具有 统计 学意 义(P0.05)。 说明:图 2 和图 3 中第一 组及第二组完全一致 ,均 为单纯培养基组及成 骨诱 导组,但第三组到 第六组中图一为单纯 培养 基只添加雷帕霉素 , 而图 二的第三组到第六组 为单 纯培养基加上成骨诱 导剂和加上雷帕霉素, 为 更好阐述, 故特此说明, 图四和图五, 图六和图 七 也均为此; 此外所有 16华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 比较之前,均先经 SPSS 软件分析,有统计学 差异 (p0.05 )才拿来比较 , 下面不一一标示。 3 雷 帕 霉 素+ 成 骨 诱 导 组 七 日 成 骨 示 意 图图三 如 上 图 中 所 示 :RUNX2 和 OPN 基 因 中 , 第 四 组 5Nm 雷 帕 霉 素+ 成 骨 诱 导 剂 +DMEM 组 成 骨 效 果 要 好 于 其 他 五 组 4 雷帕霉素刺激十四日成骨示意图: 第一组为单纯培养基组(DMEM 组), 第二 组为 成骨诱 导剂组(成骨诱导剂+DMEM ); 第三组为 1nM 雷帕霉素组(1nM 雷 帕 霉 素+DMEM ); 第 四 组 为 5nM 雷 帕 霉 素 组 (5nM 雷 帕 霉 素+DMEM ); 第五 组为 10nM 雷 帕 霉 素 组 (10nM 雷 帕 霉 素+DMEM ); 第 六 组 为 20nM 雷 帕 霉 素 组 (20nM 雷 帕 霉 素+DMEM ) 图四 如 上 图 所 示 , 单 纯 雷 帕 霉 素 组 5nM 组 促 成 骨 效 果 好 于 其 余 五 组 17华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 5. 雷 帕 霉 素+ 成 骨 诱 导 剂 14 日 成 骨 示 意 图 第一组为单纯培养基组 (DMEM 组 ) , 第 二 组 为 成 骨 诱 导 剂 组 ( 成 骨 诱 导 剂+DMEM), 第三组为 1nM 雷 帕 霉 素 组 (1nM 雷帕霉素+成骨诱导剂+DMEM ) , 第 四 组 为 5nM 雷帕霉 素组(5nM 雷帕霉素+成骨诱导剂+DMEM ) , 第 五 组 为 10nM 雷帕霉素组(10nM 雷帕霉 素+ 成 骨 诱 导 剂+DMEM ) , 第 六 组 为 20nM 雷 帕 霉 素 组 (20nM 雷 帕 霉 素+ 成 骨 诱 导 剂 +DMEM ) 图五如 上 图 所 示 , 第 四 组 5nM 雷 帕 霉 素+ 成 骨 诱 导 组 促 成 骨 效 果 明 显 高 于 其 余 五 组 6. 雷 帕 霉 素 21 日 刺 激 促 成 骨 组 第 一 组 为 单 纯 培 养 基 组 (DMEM 组) 第 二 组 为 成 骨 诱 导 剂 组 ( 成 骨 诱 导 剂+DMEM )第 三 组 为 1nM 雷 帕 霉 素 组 (1nM 雷 帕 霉 素+ 成 骨 诱 导 剂+DMEM ) 第 四 组 为 5nM 雷 帕 霉 素 组 (5nM 雷 帕 霉 素+ 成 骨 诱 导 剂+DMEM ) 第 五 组 为 10nM 雷 帕 霉 素 组 (10nM 雷 帕 霉 素+ 成 骨 诱 导 剂+DMEM ) 第 六 组 为 20nM 雷 帕 霉 素 组 (20nM 雷 帕 霉 素+ 成 骨 诱 导 剂+DMEM ) 图六 18华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文如 上 图 示 本 六 组 中 , 单 纯 雷 帕 霉 素 促 成 骨 组 ,5nM 雷 帕 霉 素 RUNX2 和 OPN 基 因 的 表 达 量 最 大 , 而 单 纯 成 骨 诱 导 组 IBSP 基 因 表 达 灵 高 于 其 余 五 组 ,5nM 雷帕 霉素 IBSP 基 因 表 达 量 优 于 其 余 四 组 7. 雷 帕 霉 素+ 成 骨 诱 导 剂 21 日 促 成 骨 诱 导 示 意 图 分 组 同 图 三 及 图 五 图七 如 上 图 示 5nM 雷 帕 霉 素+ 成 骨 诱 导 剂 组 21 刺 激 后 , 促 成 骨 效 果 明 显 优 于 其 余 五 组 8. 由 于 图 一 , 图 二 中 组 一 和 组 二 完 全 一 致 , 故 综 合 图 1 ,2 得 七 日 促 成 骨 综 合 示 19华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 意图图八 第 一 至 第 六 组 和 图 一 完 全 一 致 , 第 七 至 第 十 组 分 别 为 1nM 雷 帕 霉 素+ 成 骨 诱 导 剂+DMEM ,5nM 雷 帕 霉 素+ 成 骨 诱 导 剂+DMEM ,10nM 雷 帕 霉 素+ 成 骨 诱 导 剂 +DMEM ,20nM 雷 帕 霉 素+ 成 骨 诱 导 剂+DMEM 上 图 示 七 日 成 骨 组 中 ,5nM 雷 帕 霉 素+ 成 骨 诱 导 剂 组 早 期 成 骨 指 标 RUNX2 表 达 量 最 高 , 其 余 BSP 和 OPN 组 中 , 成 骨 诱 导 剂 刺 激 的 间 充 质 干 细 胞 表 达 量 最 高 。 9. 十 四 日 综 合 成 骨 组 图九 上图 OPN 和 BSP 里 雷 帕 霉 素 组 成 骨 指 标 均 低 于 雷 帕 霉 素 + 成 骨 诱 导 剂 , 在 20华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 RUNX2 里面 5nM 雷 帕 霉 素 基 因 表 达 量 最 高 10. 二 十 一 日 综 合 成 骨 图 分 组 同 图 8 ,图 9 图十 如上图 所 示 ,OPN 和 BSP 基 因 ,5nM 雷 帕 霉 素+ 成 骨 诱 导 表 达 量 最 高 , 明 显 高 于 其 他 九 组 11. 雷 帕 霉 素 与 电 磁 场 联 合 刺 激 七 日: 七 日 刺 激, 分 组 如 下: 第一组 单 纯 对 照 组;第二组 雷 帕 霉 素 刺 激 组; 第 三 组 磁 场 刺 激 组; 第 四 组 磁 场 刺 激+ 雷 帕 霉 素 组 图十一 如 上 图 所 示 , 七 日 刺 激 后 早 期 RUNX2 中 , 单 纯 磁 场 刺 激 相 对 于 对 照 组 有 一 定 的 抑 制 作 用 , 单 纯 雷 帕 霉 素 刺 激 组 早 期 即 能 明 显 促 进 成 骨 , 雷 帕 霉 素 对 磁 场 成 骨 有 提 升 作 用 , 而 磁 场 对 雷 帕 霉 素 成 骨 有 抑 制 作 用 12. 雷 帕 霉 素 与 电 磁 场 联 合 刺 激 14 天 , 分 组 如 下 21华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 第 一 组 单 纯 对 照 组; 第 二 组 雷 帕 霉 素 刺 激 组; 第 三 组 磁 场 刺 激 组; 第 四 组 磁场 刺激+ 雷 帕 霉 素 组 图十二 14 days rapamycin and EMF STIMULATION 对照组 雷 帕霉素组 2.0 磁场刺激 组 雷 帕霉素+磁场刺激 组 1.5 1.0 .5 0.0 RUNX2 BSP OPN如 上 图 所 示 , 早 中 期 成 骨 指 标 RUNX2 和 BSP 中 , 单 纯 磁 场 刺 激 和 单 纯 雷 帕 霉 素 刺 激 , 均 有 较 好 的 成 骨 效 果 , 而 二 者 联 合 应 用 却 拮 抗 各 自 成 骨 效 应 。 13. 雷 帕 霉 素 与 电 磁 场 联 合 刺 激 21 天 图十三 如 上 图 所 示 , 经 21 天 雷 帕 霉 素+ 电 磁 场 刺 激 后 , 早 中 晚 期 成 骨 指 标 均 明 显 上 升 , 其 中 晚 期 成 骨 指 标 opn 中 , 雷 帕 霉 素 促 成 骨 效 应 被 电 磁 场 拮 抗 , 但 电 磁 场 促 成