与乳酸菌具有共生作用酵母菌培养基的优化

与乳酸菌具有共生作用酵母菌培养基的优化 摘要:以对乳酸菌 (LC5) 有促进作用的酵母菌 (YE4) 为研究对象，OD 值和活菌数为测定指标，筛选合适的培养基。通过对 5 种酵母菌常用培养基的初筛及二次筛选，确定在 YPD 培养基中 YE4 生长良好。以 YPD 培养基作为基础培养基，进一步利用单因素试验和正交试 0.4%，胰蛋验的 设计 领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计 方法对其进行优化，得出改良 YPD 培养基的最佳成分是大豆蛋白胨为 白胨为 0.4%，酵母浸提粉为 0.4%，蔗糖为 1.2%，蒸馏水为 100 mL。改良 YPD 培养基活菌计数测得的活菌数可达到 5.01×108CFU/mL，比 YPD 基础培养基高一个数量级;OD 值是 YPD 基础培养基的 1.06 倍。 关键词:酵母菌;培养基;优化 Optimization Medium of Yeast YE4 Having Symbiotic Function with Lactic Acid Bacteria LC5 Abstract:Yeast (YE4) is taken as research object，which can promote the role of lactic acid bacteria (LC5)，and OD 600 and viable count are as determination of indicators to filter suitable medium of YE4. By selecting from 5 mediums which the YE4 usually used，the result shows that the YE4 grows very well in YPD medium. So YPD is selected as the base medium， by using single factor experiment and orthogonal test design method to optimize it，and the best ingredients of the modified YPD are that:soy peptone 0.4%，tryptone 0.4%，yeast extract powder 0.4%，sucrose 1.2% and distilled water 100 mL. The viable count of YE4 with modified YPD can reach 5.01×10 8 CFU/mL，which is more than basis medium one order of magnitude，also，the OD value is 1.06 times than the basis YPD medium. Key words:yeast (YE4);medium;optimization 酵母菌是一种单细胞真核微生物 [1] ，是子囊菌、 担子菌等单细胞真菌的通称。多数酵母可以分离于 富含糖类的环境中，比如一些水果 (葡萄、苹果、 桃等) 或者植物分泌物 (如植物的叶子) [2] 。比细 菌的单细胞个体要大得多，一般为 1~5 μm 或 5~ 20 μm。酵母菌无鞭毛，不能游动。酵母菌的生殖 方式分为无性繁殖和有性繁殖两大类，其在有氧和 无氧的环境中都能生长，即酵母菌是兼性厌氧菌。 在有氧的情况下，它把糖分解成 CO 2 和水，且生长 较快;在缺氧的情况下，酵母菌把糖分解成酒精和 CO 2 。在现代工业中除了用于酿酒外，还用于甘油、 食用酵母、有机酸、酶制剂、石油脱蜡，以及饲料 等的生产 [3] 。酵母菌一般还能利用无机氮源或尿 素来合成蛋白质，已经成为目前最重要的单细胞蛋 白来源 [4] 。 在传统发酵乳制品中，乳酸菌与酵母菌作为益 生菌对产品的发酵过程发挥着主导作用。因此，乳 酸菌与酵母菌作为对人体有益的微生物，它们有着 相似的生长条件和营养需求，即共生基础。例如， 它们都能很好地利用糖来进行糖发酵。有研究 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 明 酵母泥中的大分子物质通过乙醇提取后，添加在合 成培养基上，可以缩短乳酸菌的迟滞期，增加乳酸 菌的数量，原因可能是酵母大分子物质能诱导乳酸 菌中氨基肽酶的合成，使氨基酸及小分子缩氨酸含 量增加，从而促进乳酸菌的生长;另外酒精发酵或 酵母自溶产生的吡喃甘露糖可以吸收中链脂肪酸， 解除其对乳酸菌的毒害作用，还可能增加乳酸菌的 α- 葡萄糖苷酶、β- 葡萄糖苷酶、N - 乙酰基 β- 表 1 L 9 (3 4 )正交试验因素与水平设计 葡萄糖脱水酶及肽酶的活性，使培养基的营养丰富， 间接地促进乳酸菌的生长 [5] 。 Gobbetti M 等人 [6] 在 MRS 培养基中，通过添加 4 种 不同碳源 (麦芽糖、蔗糖、葡萄糖、果糖) 来研究 2 株酵母菌与 2 株乳酸菌之间的相互作用。结果显 示，在添加了蔗糖的 MRS 培养基中双菌培养的乳酸 菌活菌数明显高于单菌培养的活菌数，笔者通过蔗 糖分解的动力学曲线分析其原因是酵母菌可以将蔗 糖分解为葡萄糖和果糖，为乳酸菌提供稳定的碳源。 此外，有些酿酒酵母的生理特性 (蛋白酶活性、 大分子物质生成) 及自溶量等，都可能对乳酸菌的 - 乳酸发酵起促进作用，因此添加酵 生长及苹果酸 母提取物对乳酸菌的生长和代谢活性有一定的促进 作用 [7] ，但关于这方面研究的资料很少。 刘敏敏等人 [8] 对内蒙古锡盟地区酸马奶中分离 出的 8 株乳酸菌和 7 株酵母菌，进行潜在共生菌的 筛选。在各自培养基中交互添加代谢物作为试验 组，以各自培养基中添加等量生理盐水作为对照， 分析比较稳定期的浊度值，结果发现乳酸菌 LC5 和 酵母菌 YE4 在脱脂乳培养基中共同培养和 2 者在各 自培养基中交互添加代谢物培养，都表明其具有相 互促进作用。 基于刘敏敏等人的试验，本试验对 5 种酵母菌 常用培养基进行初筛及二次筛选，确定 1 种作为基 础培养基。对该基础培养基进行优化，使培养基的 营养条件更有利于酵母菌 YE4 的生长，为进一步研 究对乳酸菌具有促生作用的酵母菌代谢产物的分离 纯化奠定基础。 1 材料与方法 1.1 试验材料 1.1.1 菌种 酵母菌 YE4 是从内蒙古锡盟地区酸马奶中分离 而来、且与酸马奶中的 1 株乳酸菌有明显促进作用的 酵母菌，由内蒙古农业大学“内蒙古传统发酵乳制品 中乳酸菌和酵母菌互生机理的研究”课题组提供。 1.1.2 培养基 YPD 培养基 [9] 、豆芽汁培养基 [10] 、麦氏培养基 [11] 、 LB 培养基 [12] 、马铃薯培养基 [13] 。 1.1.3 试验仪器 SKP-01 型电热恒温培养箱，湖北省黄合恒丰医 疗器械有限公司产品;PL303 型电子天平，塞多利斯 科学仪器 (北京) 产品;2004 (C) T6 型新悦可见 分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司产品; SK-1 型快速混匀器，常州国华电器有限公司产品; HIRAYAMA 型立式高压蒸汽灭菌锅，华粤企业集团 有限公司产品;BCN-1360 型微生物洁净工作台，哈 尔滨市东联电子技术开发有限公司北京分公司产品。 1.2 试验方法 1.2.1 菌种的活化 将 YE4 酵母菌冻干粉用接菌环接到 YPD 液体培 养基中，30 ?恒温培养 30 h，活化 2 代后以 3%接 种量分别接种于相应的培养基中，30 ?培养 30 h 后 测定菌体生长情况。 1.2.2 基础培养基筛选 (1) 基础培养基的初筛。以活菌计数、OD 值以 及 pH 值为测定指标，对马铃薯、豆芽汁、YPD、LB与麦氏 5 种常用的酵母菌培养基进行筛选，选出 3 种生长情况较好的培养基进行二次筛选。 (2) 基础培养基的二次筛选。对初筛得出的 3 种培养基进行二次筛选，测定指标同上，确定 1 种 作为基础培养基。 1.2.3 基础培养基的优化 (1) 基础培养基主要成分的单因素试验。在其 他成分不变的情况下，分别采用各种不同的碳源、 氮源及生长因子取代基础培养基中相应成分，配制 培养基，接种培养，依据 OD 值确定碳源、氮源及生 长因子的成分，接种量为 3%，30 ?培养 30 h，以 YPD 基础培养基为对照。 (2) 基础培养基主要成分使用量的单因素试验。 在单因素试验对 YPD 基础培养基的碳源、氮源以及 生长因子成分确定的基础上，对培养基中各种营养 成分的使用量进行确定，当改变某一种成分使用量 时培养基中其他成分的使用量均不改变。培养条件 同上。 (3) 基础培养基主要营养因素的正交试验。在 单因素试验的基础上，以最佳使用量为基准，上下 波动一定范围为选择依据，对基础培养基的成分进 行 L 9 (3 4 )正交试验设计，对其营养成分进行优化。 L 9 (3 4 )正交试验因素与水平设计见表 1。 1.2.4 改良 YPD 培养基与 YPD 培养基对比试验 在确定了改良 YPD 培养基的配方后，将改良 YPD 与 YPD 通过 OD 值、活菌数和 pH 值指标进行 对比，评价改良 YPD 培养基的改良效果。 1.2.5 测定指标 (1) OD 值。发酵培养液直接用可见光分光光度 计测定，其在波长 600 nm 处的光密度 (OD 600 )。 (2) 活菌计数。采用倍比稀释法，每样做 3 个 稀释度，每个稀释度做 2 个重复，酵母菌在 30 ?温 箱培养 30 h。取菌落数为 30~300 个的平板计数，取 大豆蛋白胨 + 胰蛋白胨 B 酵母粉 C 蔗糖 水平 A 1 2 3 0.4+0.4 0.5+0.5 0.6+0.6 0.4 0.5 0.6 0.8 1.0 1.2 /% ? 6?2013 年第 10 期 平均值，结果用每 1 mL 发酵液的菌落数表示。 (3) pH 值。采用 Sartorivts PB-10 pH 计测定， 记录数据。 2 结果与分析 2.1 基础培养基的筛选 2.1.1 基础培养基的初筛 以活菌数和 OD 值为测定指标，对马铃薯、豆芽 汁、YPD、LB 与麦氏 5 种常用的酵母菌培养基进行 筛选。 不同培养基中酵母菌 YE4 的 OD 值、pH 值和活 菌数见表 2。 由表 2 可知，比较 5 种培养基的活菌数，YPD 最高，其活菌数为 3.68×10 7 CFU/mL，其次为马铃 薯培养基;活菌数最低的是豆芽汁培养基，活菌数 只有 6.43×10 6 CFU/mL;对数值比 YPD 低 0.75。对 于 5 种培养基的 OD 值，YPD 培养基明显优于其他 培养基，为 1.756?0.009。考虑到 pH 值对培养基的 影响，豆芽汁培养基的 pH 值最低为 3.31，可见该培 养基中的酸度太高，反而会抑制酵母菌的生长，使 得其活菌数较少。考虑到本试验以提高培养基中的 活菌数和 OD 值为目的，因此选择马铃薯、YPD 及 LB 培养基进行二次筛选，以确定是酵母菌 YE4 生长 的最近培养基。 2.1.2 基础培养基的二次筛选 继续用初步筛选出的 YPD、马铃薯、LB 3 种培 3 代后进行活菌计数。 养基培养酵母菌，活化 不同培养基中酵母菌 YE4 的 OD 值、pH 值和活 菌数见表 3。 由表 3 可知，比较 3 种培养基的活菌数，YPD 的最高，其活菌数为 4.38×10 7 CFU/mL，其次为马铃 薯培养基;活菌数最低的是 LB 培养基，活菌数只有 2.11×10 7 CFU/mL;比 YPD 低 2.27×10 7 CFU/mL。对 于 3 种培养基的 OD 值，YPD 培养基明显优于其他培 养基，为 1.796?0.005，且 pH 值接近与酵母菌生长 的最佳 pH 值。因此，选择 YPD 为酵母菌 YE4 生长 的基础培养基，并对其营养成分进行进一步的优化。 2.2 基础培养基中主要营养成分的单因素试验 2.2.1 碳源 以 YPD 基础培养基为对照，不改变其他系统的 成分和用量，用乳糖等糖类作为碳源代替葡萄糖。 接种量为 3%，30 ?培养 30 h，测定菌体的 OD 值。 碳源对酵母菌 YE4 菌体 OD 值的影响见图 1。 从图 1 可以看出，用葡萄糖及乳糖、乳糖、蔗 糖和麦芽糖 4 种碳源与 YPD 基础培养基中的葡萄糖 进行对比时，当蔗糖作为碳源时菌体密度显著高于 另外 3 种碳源，OD 值高达 1.932，比单糖葡萄糖的 OD 值高 0.108。因此，选择蔗糖作为最佳碳源。 2.2.2 氮源 以 YPD 基础培养基为对照，不改变其他系统的 成分和用量，只改变氮源中蛋白胨的成分，以胰蛋 白胨等蛋白胨类产品代替蛋白胨。培养条件同上。 氮源对酵母菌 YE4 菌体 OD 值的影响见图 2。 由图 2 可以看出，酵母菌 YE4 对大豆蛋白胨和胰 蛋白胨的利用需求显著高于对其他组的利用，OD 值 达到 1.823，是 YPD 基础培养基的 1.10 倍。胰蛋白 胨是一种动物蛋白胨，是以新鲜牛肉和牛骨经胰酶 消化，浓缩干燥而成，含有丰富的氮源、氨基酸等; 大豆蛋白胨是一种植物蛋白胨，其营养丰富，主要 成分为低分子肽和氨基酸，有利于酵母菌的生长、 繁殖。因此，选用大豆蛋白胨和胰蛋白胨作为培养 基的主要氮源。 2.2.3 生长因子 以 YPD 基础培养基为对照，不改变其他系统的 成分和用量，以牛肉膏等生长因子代替酵母浸提粉。 图 2 氮源对酵母菌 YE4 菌体 OD 值的影响 表 2 不同培养基中酵母菌 YE4 的 OD 值、pH 值和活菌数 培养基 OD 值 pH 值 活菌数 /CFU?mL -1 马铃薯 豆芽汁 YPD LB 麦氏 1.645?0.015 0.967?0.011 1.756?0.009 1.643?0.007 0.603?0.013 3.63 3.31 4.96 3.92 5.41 1.81×10 7 6.43×10 6 3.68×10 7 1.65×10 7 6.87×10 6 表 3 不同培养基中酵母菌 YE4 的 OD 值、pH 值和活菌数 培养基类型 OD 值 pH 值 活菌数 /CFU?mL -1 马铃薯 YPD LB 1.695?0.009 1.796?0.005 1.655?0.008 4.27 4.83 3.28 2.44×10 7 4.38×10 7 2.11×10 7 YE4 菌体 OD 值的影响 图 1 碳源对酵母菌 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0 O D 值 葡萄糖 + 乳糖 处理 乳糖蔗糖蔗糖 对照组 2.0 1.6 1.2 0.8 0.4 0 O D 值 处理 大豆蛋白胨 胰蛋白胨 大豆蛋白胨 +对照组 胰蛋白胨 王美霞，等:与乳酸菌具有共生作用酵母菌培养基的优化 ? 7?农产品加工(学刊) 2013 年第 10 期 培养条件同上。 生长因子对 YE4 菌体 OD 值的影响见图 3。 生长因子主要是调节微生物代谢活动的，是微 生物不可缺少的微量有机元素，包括各种氨基酸、 嘌呤、嘧啶、维生素等。由图 3 可知，酵母菌对基 础培养基中酵母浸提粉的利用高于其他组，OD 值高 达 1.902。因此，采用基础培养基中的酵母浸提粉作 为生长因子更有利于菌体生长。 2.3 基础培养基中成分使用量的单因素试验 在单因素试验对 YPD 基础培养基的碳源、氮源 以及生长因子成分确定的基础上，以 YPD 基础培养 基为对照，在其他条件不变的情况下依次改变基础 培养基中碳源、氮源及生长因子的使用量。接种量 为 3%，30 ?培养 30 h，测定各种成分在其不同使 用量下菌体的 OD 值。 YPD 培养基成分不同使用量培养 30 h 后酵母菌 YE4 的 OD 值见表 4。 由表 4 可知，使用单因素试验的设计方法对培 养基成分使用量的确定时，以 OD 值为测定指标，基 础 YPD 培养中各种成分的最佳使用量选择结果如 下:大豆蛋白胨为 0.5%，胰蛋白胨为 0.5%，且二者 的比例为 1?1，蔗糖为 1.0%，酵母粉为 0.5%。 2.4 基础培养基优化正交试验 在单因素试验研究的基础上，选取大豆蛋白胨 和胰蛋白胨、蔗糖、酵母浸提粉为培养基的 3 个因 素，以 OD 值为测定指标进行 L 9 (3 4 )正交试验分析。 以 OD 值为测定指标的正交试验结果与分析见 表 5，方差分析见表 6。 由表 5 可以看出，蔗糖、大豆蛋白胨和胰蛋白 胨及酵母浸提粉是酵母菌生长所需的主要营养成分， 按其对菌体影响的次序为 C (蔗糖) >A (大豆蛋白 胨 + 胰蛋白胨) >B (酵母浸提粉)，且 C 作为碳源对 培养基具有显著影响 (p<0.05)，而 A 和 B 则差异不 显著 (p>0.05)。比较 3 个因素不同水平下的组合， 发现 A 2 B 2 C 3 组合下菌体 YE4 的 OD 值最高为 1.970， 但正交试验结果显示最优组合应为 A 1 B 1 C 3 。上述正 交试验中没有此最优组合，因此需追加试验确定最 优组合酵母菌 YE4 的 OD 值，并将最优组合和正交 试验的最大值 A 2 B 2 C 3 进行比较。结果追加试验表明， 最优组合 A 1 B 1 C 3 的酵母菌 YE4 OD 值为 2.113? 0.021，比 A 2 B 2 C 3 组合 OD 值高 0.143，符合正交试 验结果。因此，可以确定改良酵母菌 YPD 培养基的 最佳组合为 A 1 B 1 C 3 ，即大豆蛋白胨为 0.4%，胰蛋白 胨为 0.4%，酵母浸提粉为 0.4%，蔗糖为 1.2%，蒸馏 水为 100 mL。在改良过程中发现，酵母菌 YE4 对蔗 糖的利用远高于对其他单糖或单、双糖的利用，这 与 Gobbetti M 等人 [6] 的研究结果相符。 2.5 改良 YPD 培养基对比试验 通过单因素、正交试验的一系列优化，确定了 改良后 YPD 培养基的组成和用量。将改良 YPD 与 YPD 培养基进行对比试验。 对比试验结果见表 7。 结果表明，改良 YPD 培养基的 OD 值是 YPD 基 础培养基的 1.06 倍;活菌计数测得的活菌数可达到 5.01×10 8 CFU/mL，比 YPD 基础培养基高 1 个数量 图 3 生长因子对 YE4 菌体 OD 值的影响 2.0 1.6 1.2 0.8 0.4 0 O D 值 处理 牛肉膏 麦芽粉 豆芽汁对照组 表 4 YPD 培养基成分不同使用量培养 30 h 后 酵母菌 YE4 的 OD 值 大豆蛋白胨 + 胰蛋白胨 /% OD 值 蔗糖 /% OD 值 酵母 浸提粉 /% OD 值 0.2+0.2 0.3+0.3 0.4+0.4 0.5+0.5 0.6+0.6 1.327?0.012 1.416?0.072 1.526?0.032 1.734?0.017 1.330?0.007 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.229?0.013 1.378?0.010 1.576?0.009 1.823?0.014 1.698?0.016 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 1.301?0.008 1.411?0.011 1.580?0.018 1.807?0.009 1.714?0.019 表 5 以 OD 值为测定指标的正交试验结果与分析 试验号 A B pH 值 OD 值 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 1 1 2 2 2 3 3 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 4.865 4.805 4.765 4.795 4.795 4.955 4.805 4.960 4.870 1.811?0.011 1.884?0.015 1.951?0.009 1.916?0.013 1.970?0.007 1.737?0.009 1.902?0.014 1.718?0.011 1.913?0.016 K 1 K 2 K 3 5.655 5.623 5.533 5.629 5.572 5.601 R 0.038 0.019 C 1 2 3 2 3 1 3 1 2 5.266 5.713 5.823 0.186 表 6 方差分析 因素 偏差平方和 自由度 F 比 F 临界值 显著性 A B C 误差 0.002 0.058 0.005 0 2 2 2 2 2 58 5 19 19 19 * ? 8?2013 年第 10 期 级。因此，YPD 培养基的改良效果是明显的。 3 结论 (1) 对 5 种酵母菌培养基的初筛，发现 YPD 培 养基更加适合酵母菌 YE4 的生长，其活菌数可达到 3.68×10 7 CFU/mL，其次为马铃薯，再次为 LB 培养 基，因此选择马铃薯、YPD 及 LB 培养基进行二次筛 选，结果选择 YPD 为酵母菌 YE4 生长的基础培 养基。 (2) 在单因素试验的基础上，以最佳使用量为基 准，上下波动一定范围为选择依据，对基础培养基进 行正交试验设计，结果显示培养基中营养成分的最佳 组合为大豆蛋白胨 0.4%，胰蛋白胨 0.4%，酵母浸提 粉 0.4%，蔗糖 1.2%，蒸馏水 100 mL。 (3) 对改良的 YPD 培养基和基础培养基进行对 比，改良 YPD 培养基的 OD 值是 YPD 基础培养基的 1.06 倍;活菌计数测得的活菌数比 YPD 基础培养基 高 1 个数量级。因此，选择改良 YPD 培养基为酵母 菌的最佳生长培养基。 参考文献: 白晓婷. 酵母类产品在饲料中的研究与应用 [J] . 中国饲 料，2005 (2):8-10. 孙万儒. 酵母菌 [J] . 生物学通报，2007 (11):5-7. 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