【doc】根癌农杆菌对单子叶植物竹子的细胞转化

【doc】根癌农杆菌对单子叶植物竹子的细胞转化 根癌农杆菌对单子叶植物竹子的细胞转化 繁9卷第3卷 l991年8月 武汉檀物学研究 JOU?一?LOF『盯HANBOTAN[CAL1tSira量CH Voj. 0No. 3 Ag.1991 根癌农杆菌对单子叶植物 竹子的细胞转化 陈霓徐杏阳 (南开大学分子生物学研究所,天津300071) 洪树荣吴立廉王诗云 (中国科学院武汉植物研究所.武汉430074) 摄薹本实验证明:具有重要经济价值的禾本科植物——竹子(皿..可被 癌农杆菌转化.在经有毒性的根癌农杆菌CsBAa.日感染的竹子材料中,分别测到了专 性的胭脂碱和章鱼碱.而对照处理及无毒性的根癌农杆菌VirA—z1lmNTI]~的竹子 材料中,谢不到冠瘿碱. 美麓伺竹子;根癌农杆菌;脑脂碱;章鱼碱;冠瘿碱 引言 根癌农杆菌(r0cer池mtumefaeieas)含有质粒,当它感染双子叶植物 细胞时,质粒DNA的一部分(T—DNA)能转移入植物细胞,整合于植物细胞的染 色体上,且能正常 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 达.T-DNA上含有与生长素及细胞分裂素合成有关的基因,由于 它们的表达引起植物细胞内激素失去平衡而形成冠瘿瘤,T—DNA上另一基因——冠赛 碱合成酶基因在植物细胞中表达时,植物产生相应的表达产物即冠赛碱. 已有许多实验证明.含有质粒的根癌农杆菌能感染多种双子叶植物并诱导肿瘤 形成.其能否对单子叶植物起同样的作用早为各国学者所关注.近两年来,有人报道在 用根癌农杆菌感染的单子叶植物中,测到了与T—DNA表达有关的酶活性"….Anne C.F.Crave等人证明了T—DNA可转到禾本科植物玉米(Zearaa~8)的细胞中. 这初步证明根癌农杆菌可感染一些单子叶植物.对于具有重要经济价值的禾本科植物竹 子,质粒能否引起它的细胞基因组转化,国内外尚未见报道.本实验针对这一问题 而设计,并得到肯定的结果. 本文~1990年6月13日收到. '本文为作者顼士论文工作的一部分. ?现在工作单位;东北林皿大学林学系,唁尔滨1~0040? / 202武汉植物学研究 材料和方法 第9卷 1.材料 (1)菌株供试根癌农杆菌的菌株有C5B'NTI,A?,VirA-it!mx4种.c A.为含有Ti质粒的野生型菌株,感染植物后可使植物细胞的基因组发生转化,从而 分别产生胭脂碱和章鱼碱.NTI菌株由C菌株除去质粒衍生而成.VirA一?mX菌 株与A菌株具有相扁的背景与来源,但其中Vir区7个基因中诱导肿瘤所必需的基 使植物体细胞发生转化. 因之一——VirA基因缺乏…,因此它们不可能 菌种接种于YEB液体培养基中,在25—28?下,于120转/分的摇床上培1养 天. (2)植物材料供试植物材料为武汉植物研究所内春季当年生淡竹(PkyIlosla? ekysglaneaMecI.),竹笋高40一l00厘米. 2.方法 (1)田问整体转化实验在距竹笋顶端l0—20厘米处,在竹节向上1—2厘米的部 位,用皮下注射器接种茵液,并以死菌体,无菌水和YEB液体培养基为对照注射处理, 注射部位外包无菌锡箔纸. (2)组织培养转化试验取株高0.5米左右的竹笋,用70%酒精消毒后,切成1厘 米左右的切段,置于无激素MS圆体培养基上,以无菌滤纸片沾取茵悬液,加到竹笋切 段的上表面伤口处,于26%3下进行暗培养.1天后,将竹笋切段转至含有抗菌素(羧 苄霉素500mg/1,先锋霉素200mg/1)的无激素MS固体培养基上培养,借以杀死菌体, 培养7天左右进行冠瘿碱的测定. (3)冠瘿碱的测定方法将组织研磨后离心,取上清液点样于Whatman2号滤纸, 采用微量纸电泳法测定胭脂碱和章鱼碱,并在3650A下进行观察,照相. 实验结果与讨论 1.田闻整体水平上进行细胞转化试验的结果 从接种后第3天起,即可观察到竹笋接菌处的外形发生改变,到第5天变化巳十分 显着.被根癌农杆菌感染的竹笋当其长成幼竹时,在接菌处节间距离缩短并膨大接种 C;B,A?的竹节,其节间距离较相邻的上面一节的节间距离缩短约一倍,其中以Cn菌 株感染的竹子表现最为突出(见图1t1,3),而正常竹子其上面一节的节间距离, 一 般要比其相邻近下面的一节节间距离稍长(见图1.CK).接种NTI,VirA-211mx 菌液的节间膨大不明显,节间距离仅略有缩短(见图1.2,4). 由图1可见.含有Ti质粒的野生型菌株CA,.可使接茵处竹节的节间距离明显 缩短,而与它们相应的无致病力的NTI,VirA-$11mx菌株及对照处理的竹节,节间距离 基本不缩短.这表明.有致病力的根癌农杆菌C5a'A?菌株可能巳感染了竹子.这与 我们在1985年盆栽试验所得的结果相同. 接茵Cs.,A|l83天后,感染处的外形改变如图2所示. 第3期陈霓等:根癌农杆菌对单子叶植物竹子的缸咆转化203 图1接种农杆菌液对幼竹节阃长度的影响 图中1—4组的右侧分别为接苗cE1.NTI, As?,VirA一!llmx的竹节,左侧为邻近于处理竹节 上面的正常竹节.CK为对照组,右衡为接液体培养 基的竹节.(接死菌体疑无菌水的竹节处理后结果与 cK相同) Fig.1Effectof[noculat~.theAgrobacter— u忧s0nthelegEhsofrGit.gbmhDo in}8 |?1—4g0p9,tberfgbton…rert$peetletYhamho0j0i口tswhfcb日iocul^}td thebBclerjttCE1.NTI,A|?5,VirA.jI】mx,nndtheIert0?……0rm?Ibamboo J.iE日?eBrtbehandlcdo?e日.CKj8-…lro1oP,i口wbiehtbejgh,.?ei8 hoomboo{0intiDoeulatedwiEhdeathbttcleri. (n)(b)(c) 图2接苗CEaA|.e8天后感染处表现的改变 (a)接苗cEI后3天感染处节问缩短,节同膨大的正面现(箭头所示) (h)接菌cs8后3天感染处节间膨大的侧面观(箭头所示的部位) (c)接茁all3天,接菌处竹节节阃缩短与膨胀(箭头所示) rig.2The'PPre?tcbagt8intbeinfeEedPlBcn3}bd,'fEerin…lttEedbttcttri& CEl?adAa?. a.Thef…Eviewof目horteaigndtzpandigbetw…b?mhooj.i口}目f?fnrec— tedplac…?3EhdavBF[triDoeutttEedh?eE…rlc6l'B…o). b.The日deTiofp'?djgbetw?bttmb0oJ0i?,日i?i?reetedPlBce(rrow) O?0thd-Y?fEeinocu1?tedbaeteriumC61. c.Tbesh0rEeDis'adexpndjgbetw…bttmh0oJoln,si?i?feetedplaeea (rr@w)0D3day_f,triDoeul~tedb?leriA3{8. 2.用根癌农杆菌转化竹笋切段的结果 用根癌农杆菌感染组织培养的竹笋切段,培养7天左右,电泳检测竹笋切段中冠瘿 碱的结果如图3. 由图3可见:在用根癌农杆菌Cs,A||日菌株感染的竹笋组织块中,分别测到了相 应的胭脂碱和章鱼碱,而在NTI,VirA一…mx及正常(CK)对照组培块中,没有测到 冠瘿碱. 204武汉植物学研究第口卷 图3经农杆菌转化舌竹笋切段中腰脂碱殛 章鱼碱的电讨=图 图8中官左至右顺序为; co(精氨酸,胭脂碱.章鱼碱的混合寝) cIa(c?a菌感染过的竹笋细胞提取寝) NT](NTI菌感染过的竹笋细胞提取靛) N(胭脂碱) CK(对照_处理的竹笋细胞提取液) 0(章鱼碱) VirA(VirA:ltm惑染过的竹笋细胞提取靛) As?a(A1.1茵感染过的竹笋细胞提取蔽) co(精氰酸.胭脂碱一章鱼碱的倪台液) Fig.8TheeIetrophoret.sraxaofpsliea?doctopi?tinouttigs0f bamboo月prout=frettransformedwitbtheAgrobac~eriums. Ftomlefttorigbt: co.(MiIedaoIutionof?rsinine,uopalindoctopi?e) c?I(Extr?otingoluli0口ofceII.0fhambo0日Pr口ull?tifectediththe hBcIvriumCIa) NT1(Extotigolntio?ofoells0fbambo0=prouti?fettedst,iththe b-oterJumNT1) N(Nopali?e1 CK(EtIr0tlssolutio日ofceI1w0fb-mboo3prout_ilhmtroIh?ndl-d) 0(Octopi?e) VirA(ExtractiDss01Utionofcol1wofbataboo0proutinfected-ithlhe ha~terlumVir^.jltmI) Ajlj(Ext…"g*olutio?ofcells0fbamho0.proutinleotedtitithIbe bacrerium^ala) co(Mjxedool~ti川ofsinine,nopali口eaudoet0Pjn.) 由以上结果可以看出t无论田间整体水平上进行的转化试验,还是组织水平的转化 试验,其结果都表明,具有致病力的根癌农杆菌c.,A...菌株,对单子叶植物淡竹具有 感染能力,并能使竹笋细胞发生基因转化.图3纸电泳的结果表明,致病根癌农杆菌转 化竹细胞后,质粒的T—DNA部分进入竹细胞并在细胞中表达,产生专性的冠瘿碱. 而无致病力的菌NTI,VirA?mx因其不能转化植物细胞,虽经过同样的处理,除了不 能使被接种的幼竹发生明显的形态变化外,细胞提取液中也测不出相应的冠鏖碱. 参考文献 1冯新华,蒋春,揶启垒.科学通报,1887;8:B13—615 2A??CFGT9,G0IasL.Pl口n,M0locularBioIoy,1986;T143—5O 3Book?s3一V??sI.gtereDGMS,Hookyk^日sPl,et41.N口fr,1984;311:763—764 4Her?BI…t?},PctaI.ThPEM丑0J0"rn口l,1984;3039—3049 5Le09Meleher日.DaveVThpsnet?1.Molecq1?rCharsoterinIifMolecuIitBiology 1987:63}一645 60ltenLA0.SplIperocelRA.BiochemBiophysAcfd,1978;15O;538—540 第3期陈霓等;报癌农扦苗对单手叶植物竹子的细胞转化205 THETRANSF0RMATl0NOFMONOCOT.BAMBUSA CELLSWITHA.TUMEFAClENS ChertNi,XuXinyang (Instltute0fMolecularBiology,NankalUniversity,Tianjin300071) HongShurong,WuLilian,WangShiyun (WuhanInstRuteofBotany.AcademiaSinica,Wt~han43007=1) AbstractInthispaper,theevidenceispresentedthatakindof cOlnlnercialbambooinGramineaeplantisSUbjettedtor06cer打l t=mefaciensdirectlytransformation.Strainspeciflenopalineandoetopinehave beendetectedrespectivelyinbambooculturesinfectedbyA.tumefaciensC58 andAI'8strains;while,opinesarenotobservedwhendetectcontroltissuesand thematerialsinoculatedwithNTIstrainsandVirA一2llmxlostthevirulence. KeywordsBamboo}r.6a"er?mt~mefacieas;NopalinetOcto— pineltOpine 第9巷第3期 1991年8月 武汉檀嘲学研究 JOURNALOFWUH^NBOT^NIC^LRESEARCH Vo1.9二No.3 Ag.1g91 一 种新型的植物细胞结晶 陆静梅谢航范淑琴赵毓棠 (东北师范大学生物系,长春13002'4) 提要高山芹Coelopleurumsaxatile(Turcz.)Drude为大型多年生草本植 物,茎租而直立,不分枝,叶三回三出状羽裂与苔藓植物混生于长自山高山冻原带 的 林缘处.其活悼植物细胞内含有特殊类型的结晶,其化学性质属于草酸钙.因为这种结 晶的形状不同于已报道逆的任何一种结晶【】,因此,提出一种新型n句细孢结晶—一羽 毛状结晶. 关键词羽毛状结晶;高山芹 材料和方法 高山芹0ez0pzer"msaxa~ile(Turcz.)Drude采自长自山北坡高山冻原带 海拔2100m的山坡上.实验方法采用徒手切片法和石蜡包埋法.石蜡包埋法所用染料为 番打和亮绿.石蜡包埋法切l{厚度为5m.选择理想材料做成永久封片,然后进行显 微摄影.羽毛状结晶的化学性质鉴定,首先采用l0—30的硝酸,硫酸和盐酸对其进行 化学反应试验,然后用1硝酸银进行测定.两种赛验结果表明羽毛状结晶的化学性质 为草酸钙. 结果 1.茎的横切面和径向切面 在15x10的光学显锻镜下,可见请晰的羽毛状结晶,分布在茎的表皮细胞(图版I;3) 和皮层细胞(图版I:l,2),以及髓射线靠近维管束的细胞中而髓的细胞中未发现有 结晶.在对着维管束的皮层中,含结晶的细胞数量较多.在15×40倍镜下,可见到每个 羽毛状结晶都具南较锋的束端,它们的折光佳较强.多数结晶聚识方式都是从细胞壁的 一 侧开始,向细胞内延伸.有的结晶穿破了细胞壁而裸露在细胞间隙之中,最大的结晶 面积可达55x35/*m. 2.叶片的横切面 在15×l0和15x4O倍的光学显微镜下,均可见到羽毛状结晶存在于叶的上,下表皮 细胞稚叶肉细胞及胞间隙中,在叶肉细胞中,十几个或几十个含羽毛状结晶的细胞往往是 本文于190u年4月24日段_o 本文承蒙郝东敦授各安撤教授热情指导.谨谢惋!