人乙醛脱氢酶2基因在毕赤酵母中的高效
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人乙醛脱氢酶2基因在毕赤酵母中的高效表达 人乙醛脱氢酶2基因在毕赤酵母中的高效表达
乙醛脱氢酶(Aldehyde dehydrogenase，ALDH)是人体乙醇代谢的关键酶之一，人体内乙醇由乙醇脱氢酶(Alcohol dehydrogenase，ADH)氧化为乙醛，乙醛在ALDH的作用下氧化为乙酸，并进一步生成乙酰辅酶A进入其他代谢途径。多数中国人体内ADH含量和酶活较高，而ALDH酶活低得多。醉酒和很多酒精性疾病都与ALDH的缺乏有关。本课题的主要研究内容是利用毕赤酵母高效表达人乙醛脱氢酶2(Aldehydedehydrogenase2，ALDH2)，以用于酒精解毒或其他研究。本实验室已构建的含有密码子优化的人ALDH2的质粒
pPIC9K-07ALDH2的基础上，去除信号肽α-factor得到质粒pPIC9K-ALDH2-delsign，然后用电转导的方法将该质粒电转化到毕赤酵母Pichia pastoris SMD1168中，构建得到基因
工程
路基工程安全技术交底工程项目施工成本控制工程量增项单年度零星工程技术标正投影法基本原理
菌株P. pastorisSMD1168(pPIC9K-ALDH2-delsign)。并利用该菌株进行了摇瓶和发酵罐表达。摇瓶表达的诱导条件为28?，pH
7.0，初始OD600=15，诱导72h，每24h补加甲醇
1.2%。48h时每mL发酵液中ALDH酶活为0.315U。发酵罐表达采用5L发酵罐。采用如下工艺:甘油生长阶段pH
5.5，温度30?，通气量3L/min，溶氧(Dissolved oxygen，DO)30%，转速与DO关联;甘油流加阶段，以25mL/h的速度流加500mL50%甘油，此过程中pH
5.5，温度30?，通气量3L/min，DO为30%，转速300-1050r/min。DO与转速关联;碳源饥饿1h，pH
5.5，温度30?，通气量3L/min，DO不控制，转速800r/min;甲醇流加阶段，pH
7.0，温度25?，通气量4L/min，DO20%，甲醇流速与DO关联，转速800r/min。在上述条件下发酵得到如下结论:在甘油生长阶段在第1
8.9h时基础盐培养基中甘油消耗完，酵母生物量达到
4.26g/L(OD600=1
4.17);甘油流加阶段结束时酵母生物量达到9
6.19g/L (OD600=319.18);诱导阶段生物量变化不大，70h时达到
最大120.42g/L (OD600=399.58)，之后进入衰亡期，生物量逐渐下
降。发酵总共进行了100h，8
5.9h时发酵液中乙醛脱氢酶活性最高，每mL发酵液中人ALDH2的
表达量为19
3.88mg/L，酶活为0.944U，比活为
4.87U/mg。 摘要4-6ABSTRACT6-10第1章 文献综述10-26
1.1 酒在人体内的代谢过程10-11
1.2 酒精对人体的伤害11-13
1.
2.1 对消化系统的影响12
1.
2.2 对呼吸系统的影响12-13
1.
2.3 对神经系统的影响13
1.
2.4 对心脑血管的影响13
1.
2.5 对泌尿系统的影响13
1.3 解酒研究进展13-24
1.
3.1 天然植物解酒研究14
1.
3.2 西医解酒研究14-16
1.
3.3 生物酶解酒研究16-24
1.4 本课题的研究内容与意义24-26第2章 实验材料与方法26-42
2.1 实验材料26-31
2.
1.1 菌株和质粒26
2.
1.2 培养基26-29
2.
1.3 主要试剂29-30
2.
1.4 主要仪器和设备30-31
2.2 实验方法31-42
2.
2.1 表达载体的构建31-32
2.
2.2 工程菌株的构建32-34
2.
2.3 摇瓶发酵34
2.
2.4 发酵罐发酵34-35
2.
2.5 细胞破碎35-36
2.
2.6 酶活测定36-37
2.
2.7 细胞干重的测定37-38
2.
2.8 蛋白含量的测定38-39
2.
2.9 甘油、甲醇含量测定39-42第3章 结果与讨论42-56
3.1 重组毕赤酵母的构建42-45
3.2 样品处理预实验结果45-47
3.3 摇瓶发酵47-48
3.4 发酵罐发酵48-52
3.5 讨论52-56第4章 结论与建议56-58
4.1 结论56
4.2 后续实验的建议56-58
参考文献
58-64攻读硕士期间已发表的论文64-66致谢66
浙公网安备 33021202002483