原子力显微镜工作原理及其应用

原子力显微镜工作原理及其应用 原子力显微镜的工作原理及应 摘 要 本文简述原子力显微镜的工作原理,对比说明敲击模式的优越性,指出其适用范围,并简介原子力显微镜在电化学、植物、生物及微生物等领域的应用。 关键词 原子力显微镜 卷积 假象 病毒学 植物 生物 微生物 矿物加工 材料科学中及冶金 与电子显微镜相比,原子力显微镜有很多方面的优势:如样品准备简单,样品导电与否都能适合该仪器;操作环境不受限制,即可以在真空,也可以在大气中进行;并且可以对所测区域的面粗糙度值进行统计等等。自上世纪80年代第一台原子力显微镜问世至今,分辨率和稳定性得到极大提高,在生物、电化学、微生物学、植物学等领域得到越来越广泛的应用。 一，原理 1， 敲击模式和接触模式的基本原理 对于原子力显微镜,通用的工作模式有接触(AFM)和敲击式(tapping AFM)。在敲击模式中,一种恒定的驱使力使探针悬臂以一定的频率振动。当针尖刚接触样品时,悬臂振幅会减少到某一数值。在扫描过程中,反馈回路维持悬臂振幅在这一数值恒定,亦即作用在样品上的力恒定,通过记录压电陶瓷管的移动得到样品表面形貌图。对于接触模式,由于探针和样品间的相互作用力会引起微悬臂发生形变,也就是说微悬臂的形变作为样品和针尖相互作 用力的直接度量。同上述轻敲式,反馈系统保持针尖—样品作用力恒定从而得到表面形貌图。AFM检测的是微悬臂的偏移量,而此偏移量取决于样品与探针之间的相互作用力,其相互作用力主要是针尖最后一个原子和样品表面附近最后一个原子之间的作用力,这种作用力可以测量出来,并且表示出样品的物理特性,例如:分子间的相互作用、表面的疏水性、表面的变化和机制方面的特性。 原子力显微镜是用微小探针“摸索”样品表面来获得信息，所以测得的图像是样品最表面的形貌,而没有深度信息。扫描过程中,探针在选定区域沿着样品表面逐行扫描(见图1)。 2 敲击模式的优越性 与敲击模式相比,接触模式的分辨率相对要高一些,但敲击模式有其突出的优点。它在一定程度上减小样品对针尖的粘滞现象,因为针尖与样品表面接触时,利用其振幅来克服针尖-样品间的粘附力。并且由于敲击模式作用力是垂直的,表面材料受横向摩擦力和剪切力的影响都比较小,减小扫描过程中针尖对样品的损坏。所 以对于较软以及粘性较大的样品,尽量选用敲击模式。 敲击模式下,可以同时采集高度信息和相位信息,在得到形貌图的同时,通过相检测系统可以同时得到相图。同一般检测系统一样,相检测用悬臂反射或振幅变化来采集形貌图,与此同时,通过监测相位差的变化来获得样品表面相分布和性质信息。 二(原子力显微镜的适用范围 由于扫描过程是如图1所示逐行扫描的,每行的扫描时间非常短。如果样品的高低起伏比较大,致使有部分样品表面探测不到而不能真实反应形貌。所以通常要求样品表面平整度较好,又由于所测的是微观区域,至少要求局部较为平整。例如一般来说样品脆断面起伏都较大,不太容易得到较好的图像,有时甚至会损坏探针。 原子力显微镜的应用范围十分广泛,其适用于生物、高分子、陶瓷、金属材料、矿物、皮革等固体材料等的显微结构和纳米结构的观测,以及粉末、微球颗粒形状、尺寸及粒径分布的观测等 三，原子力显微镜的应用 1， 原子力显微镜在生物医学研究中的应用 AFM自发明以来一直受到生物学家和生物物理学家的关注,已广泛应用于结构生物学、分子生物学、细胞生物学以及医学研究等各个领域。如研究生物大分子超微结构和动态结构、细胞膜结构和力学性质、病毒感染等细胞生物学过程、药物与细胞和组织的相互作用、牙体侵蚀过程等。近年来,原子力显微镜在生物分 子相互作用力的检测和研究方面也有很大发展。 如蛋白质的成像，AFM在表征蛋白质的结构、构象及功能组装研究中起着越来越重要的作用。AFM用于各种可溶性蛋白质、膜蛋白等成像的报道很多,例如,利用水孔蛋白AqpZ的二维晶体AFM图像(图2)对单个蛋白质分子的结构域进行分析,可得到与蛋白质原子结构具有很好相关性的自由能能垒图 图2 (A) AqpZ蛋白二维晶体的高分辨AFM图像, 圆圈表示单个蛋白分子; (B)单个蛋白分子 的图像; (C)计算得到的自由能图谱 2， AFM在病毒学研究中的应用 以往对病毒形态结构的研究主要依赖电子显微镜和X-射线衍射技术,比如病毒二十面体结构和螺旋对称结构的发现,病毒衣壳子粒和壳蛋白亚单位的分布等。近年来,低温电镜对病毒内部结构的分析更加深入,并尽可能向生理状态下的观察靠 拢。然而,电镜技术制样复杂,X-线衍射技术需要病毒以晶体或其它高度有序的方式才能分析。AFM的扫描范围是20nm-150μm,横 向和纵向分辨率分别可达2nm-3nm和0.5nm,适合于对病毒进行形态结构和功能分析。AFM用于病毒研究的优势不仅在于制样简单,对病毒结构影响小,更重要的是可以在生理条件下,动态观察病毒的形态或生物学行为。 单纯疱疹病毒是一种有包膜的病毒,大小约100nm。Kuznetzsou等将病毒吸附在云母片上,由于脂蛋白膜的影响,病毒壳蛋白的亚结构分辨不清;用去污剂处理后再观察,可以清楚地见到壳蛋白的结构,甚至衣壳子粒中央的孔也可见到。 3, 原子力显微镜在植物学研究中的应用 AFM在植物学研究中的应用虽然仅局限在几个方面,但表现出了独特的优势。植物叶片是感受外界环境变化的敏感器官,以往的研究多是从宏观角度出发。而电镜的样品处理过程在一定程度上破坏了叶片表面的真实形态,AFM的出现使接近活体状态的研究成为可能。对大果越橘的观察展示了叶面生境的异质性,和新叶相比,老叶皱缩,表面粗糙度增加(Michener et al.,1996)。定量分析叶表面疏水结构时,观察到天南星科植物海芋叶表面具有很多凸起(Wagneretal.,2003)。Perkins等(2005)在研究月桂樱桃叶表面机械及化学属性时,测量了叶表面的粗糙部分的平均粗糙度为5.6 nm,平滑部分的粗糙度为1.4 nm。AFM还可以用来做动态分析。Benitez等(2004)最早利用AFM对角质的化学合成作了辅助分析,然后结合红外光谱(FT-IR)描述了角质的分子特征(Benitez et al.,2004)。AFM将与其它显微技术及生物技术有机 地结合起来,其应用前景会更为广阔,并在植物学研中发挥更大的作用。 4， 原子力显微镜在微生物学领域的应用 通常在微生物的形态观察过程中采用接触模式较为广泛,轻敲式则用于液体环境中微生物的观察以及生物大分子的研究方面。观察到的图像都可达到原子级的高分辨率,可观察活的细胞及其某些特性。因此, AFM在微生物学研究过程中极具优越性。 观察活细胞可以用光学显微镜,但是放大率和分辨率都受到限制;放大率和分辨率高的电子显微镜要求严格的制样和观察条件,并且不能用来观察活细胞。AFM可以用于微生物细胞的多种条件下的观察。自AFM发明以来,许多人用来观察过各种类型的革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和病毒形态,取得了用其它显微镜观察不到的结果。Bolshakova等观察到大肠杆菌在液体培养条件下的活体三维图像。此外还可以观察到乳酸乳球菌的分裂图和奇异变形杆菌的迁徙生长。由于在生理条件下利用AFM观察到的图像更加逼真地反映出微生物的形态特征,所以AFM在微生物的形态观察方面优越于其它显微镜。利用AFM不仅可以高分辨率地观察活体微生物的形态特征,还可以观察细胞表层亚分子结构。 5， 原子力显微镜及其在矿物加工中的应用 在矿物加工领域中,用AFM研究矿物在空气中或液体中的表面性质,研究样品表面之间的范德华氏引力、双电层静电斥力、水化力及疏水力等己取得了很有意义的结果。众所周知,在气泡与颗 粒相互作用,矿物表面润湿,悬浮液分散、膜稳定性中,颗粒之间的力起着重要的作用。另外在大气环境下得到非导体氟化锂等离子晶体的原子级分辨率图像。AFM还成功的用于观察吸附在基底上的有机分子、生物样品以及观察电化学、电沉积和电腐蚀;利用AFM还可测量样品表面的纳米级力学性质。 6， 在材料科学中及冶金中应用 在材料科学中,无论无机材料或有机材料,在研究中都有要研究文献,材料是晶态还是非晶态、分子或原子的存在状态中间化物及各种相的变化,以便找出结构与性质之间的规律。在这些研究中AFM可以使研究者,从分子或原子水平直接观察晶体或非晶体的形貌、缺陷、空位能、聚集能及各种力的相互作用。这些对掌握结构与性能之间的关系有非常重要的作用。当今纳米材料是材料领域关注的课题,而AFM对纳米材料微观的研究中,也是分析测视工具。在冶金科学中,矿物组成、冶炼过程中熔体及溶液中各种分子、原子、离子配合物的变化认识,尤其是生物冶金过程的微观变化认识AFM起着重要作用。 四， 结语 由于AFM独特的成像方式，使得它在科学研究工作中，如金属、半导体材料、微电子、物理、化学、生物，纳米材料、生命科学等众多科学领域中得到迅速的发展和应用。但对生物样品的观测还处在比较初级阶段的水平上。但近年来，国内外研究表明:原子力显微镜在生物医学研究中的应用具有很大潜力。如果我们 将细胞学、免疫学、生物化学、分子生物学、生物物理学等与原子力显微技术有机地结合起来，将AFM和其他仪器设备(如透射电子显微镜、激光共聚焦显微镜、生物质谱、核磁共振、X晶体衍射等)结合起来，相互补充、取长补短，一定会获得很好的研究结果。当然AFM也还有许多问题尚未解决。如生物软样品分辨率的提高、生物标本的固定、功能化探针的制备等。尽管如此，可以相信，随着AFM技术的逐渐成熟，它将对生命科学的发展做出重大的贡献。 原子力显微镜原理与应用技术，刘岁林 田云飞 参考文献:,1, 陈 红 吉晓江(四川大学分析测试中心 成都 610064) ,2,原子力显微镜在生物医学研究中的应用 师晓丽,余军平,江雅新,方晓红*(中国科学院化学研究所,北京100080) ,3,原子力显微镜在病毒学研究中的应用，赵铁强1,2,国立秋2,梁瑛娟3,董申2(1，哈尔滨医科大学 第一临床医学院,哈尔滨 150001;2，哈尔滨工业大学 精密工程研究所 哈尔滨150001;3，中国疾病预防控制中心 病毒病预防控制所,北京 100052) ,4,原子力显微镜在植物学研究中的应用，祖元刚*,张宇亮,刘志国,王延兵,梁慧丽,刘红梅 东北林业大学森林植物生态学教育部重点实验室,哈尔滨150040 ,5,原子力显微镜在微生物学领域的应用，*石万良 谢志雄** 沈 萍(武汉大学生命科学学院 武汉 430072) ,6,原子力显微镜及其在矿物加工中的应用 刘新星,胡岳华(中南工业大学矿物工程系,湖南长沙410083) ,7,原子力显微镜及其应用 马荣骏(长沙矿冶研究院,湖南长沙410012) ,8,原子力显微镜发展近况及其应用，张德添 何昆 张飒 杨怡 周涛 张学敏 赵晓光 薛燕(医学科学院国家生物医学分析中心北京100850) 原子力显微镜的工作原理及应用 东北大学化学学院 2007级 1233407048 胡秀娟