免疫荧光
1)相关试剂:
①固定液:4% PFA(0.2 g多聚甲醛溶解在5 ml PBS液中)
②透膜液:0.5% Triton X-100(Triton X-100溶解在PBS中)
③Washing Buffer:PBS中加入1/103 (V/V)Tween、1/104 (V/V)Triton X-100
④Blocking Buffer:Washing Buffer中加入1/100(W/V)BSA
⑤DABCO:0.4 g三亚乙基二胺,2 ml 0.2 M Tris (pH 7.4),18 ml甘油
⑥PI: 工作浓度10 μg/ml
⑦Hoechst 33258:工作浓度10 μg/ml
2)步骤:
①将各期卵细胞放置在4% PFA中,室温固定30 min;
②将卵移至透膜液中,室温20 min(湿盒中);
③Blocking Buffer室温封闭1 h;
④一抗孵育:羊Hsp27抗体(1:200)、兔Hsp27-ser15抗体(1:200)、羊Hsp27-ser82抗体(1:200)稀释在Blocking Buffer中,置于湿盒中,4 ℃过夜;
⑤Washing Buffer清洗,5 min×3次;
⑥二抗:山羊抗兔IgG/FITC抗体和兔抗山羊IgG/FITC抗体,以1:100稀释于Blocking Buffer中,室温1 h;
⑦Washing Buffer清洗,5 min×3次;
⑧PI染核:室温下5 min;
⑨Washing Buffer清洗,1 min×3次;
⑩在含DABCO的防荧光淬灭剂中封片,激光共聚焦显微镜观察。
培养3 h和8 h,收集卵母细胞通过Annexin V染色检测并观察卵母细胞早期凋亡并计数;
Annexin V 染色(KeyGEN试剂盒)
试剂:碘化丙啶(PI)Annexin V-FITC Binding buffer PBS
实验步骤:
①将收集的卵母细胞用PBS洗2次;
②在500 μl Binding buffer中加入5 μl Annexin V-FITC和5 μl PI,混匀;
③将卵母细胞移入上述混合液中,室温,避光反应5 min~15 min;
④将细胞悬液移到载玻片上,盖上盖玻片,荧光显微镜下观察;
(1)去透明带卵母细胞的培养
ICR小鼠注射PMSG(10 U/只)46 h~48 h后,脱颈椎处死后取新鲜卵巢,体视显微镜下收集GV期卵母细胞,将GV期的卵母细胞移入酸性台氏液(pH 2.5~3.0),体视镜下口吸管反复吹吸去透明带后,立即移入M2培养液中清洗3次,再移入含有病毒上清的M16培养滴中培养,显示的是去透明带卵母细胞体外培养发育成熟的各时期图片。
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