鲁氏酵母3-磷酸甘油脱氢酶基因（ZrGPD1）在粉状毕赤酵母中的表达

鲁氏酵母3-磷酸甘油脱氢酶基因（ZrGPD1）在粉状毕赤酵母中的表达 鲁氏酵母3-磷酸甘油脱氢酶基因(ZrGPD1) 在粉状毕赤酵母中的表达 中国生物工程杂志ChinaBioteehnology,2006,26(8):32,36 鲁氏酵母3.磷酸甘油脱氢酶基因(ZrGPD1) 在粉状毕赤酵母中的表达 张洁陈献忠沈微唐雪明诸葛健 (江南大学工业生物技术教育部重点实验室无锡214036) 摘要为探索在野生型粉状毕赤酵母(Pichiafarinosa)中整合表达来源于耐高渗鲁氏酵母 (Zygosacharomycesrouxii)的3.磷酸甘油脱氢酶基因(ZrGPD1)以提高产甘油能力的可行性,应用 PCR方法从P.farinosa的染色体中扩增出乳清苷酸脱羧酶基因(URA3)片段,以此作为同源整合 的靶序列,构建了整合型表达载体pUR-ZG.电击转化粉状毕赤酵母,以抗生素Zeocin为筛选标 记,获得转化子pfa-gu,摇瓶发酵结果表明:以P.farinosa作为对照菌株,发酵72h后,转化子pfa- gu的生物量和甘油含量均高于对照菌株,其中甘油含量达到37g/L,比对照提高了30%.因此, 在P.farinosa中异源表达ZrGPD1能够提高细胞的产甘油能力和对渗透压的调节能力. 关键词甘油3-磷酸甘油脱氢酶耐高渗鲁氏酵母整合表达 中图分类号:Q939.9 甘油是一种重要的轻,化工原料,广泛应用于药物 制造,食品,饲料和化妆品等行业.粉状毕赤酵母(P. farinosa)是发酵法生产甘油中研究比较多的菌种之 一 … ,它具有耐高渗等特性,但是其甘油产率还不能令 人满意. 在Saccharomycescerevisiae中,NAD依赖性的3.磷 酸甘油脱氢酶(GPD)被认为是甘油合成途径的限速 酶,GPD有两个同功酶分别是GPD1和GPD2,其中 GPD1是渗透压诱导型,GPD2是缺氧诱导型.渗透压 调控GPD1基因的表达和mRNA的转录水平,它对甘 油的诱导作用发生在信号转导水平,由HOG途径调 控.耐高渗鲁氏酵母(Z.rouxii)是一种能够在低 水活度环境下正常生长的微生物而一般的酵母则不 能.它常用于传统食品味增(miso)和酱油(soysauce) 的酿造中,对多数真核生物的研究结果显示,耐高渗的 一 个主要机制是它们体内能够合成和积累大量的胞内 相容性物质——主要是甘油,也就是说大部分取决 于甘油合成途径中关键酶基因的表达水平,因此来源 于耐高渗鲁氏酵母的ZrGPD1具有较高活性. 本研究构建了野生型粉状毕赤酵母的整合型表达 收稿日期:2006-03-31修回日期:2006-04-20 通讯作者,电子信箱:jzhuge@sohu.corn 载体pUR-ZG,并且成功地在野生型粉状毕赤酵母中表 达.通过发酵实验初步探索了异源基因的表达对野生 型粉状毕赤酵母甘油的累积和抵抗外界高渗透压环境 的影响. 1 材料 关于××同志的政审材料调查表环保先进个人材料国家普通话测试材料农民专业合作社注销四查四问剖析材料 与方法 1.1材料 1.1.1菌株及质粒P.farinosaCICC1688购自中国 微生物菌种保藏管理中心;z.rouxiiNRRL2547由南非 Prior教授惠赠;大肠杆菌JM109由本实验室保存;毕赤 酵母表达载体pGAPZA购自Invitrogen公司. 1.1.2主要试剂和工具酶质粒小量抽提试剂盒, DNA胶回收试剂盒(上海博大泰克公司);Zecoin抗生 素,pMD18-T,工具酶(TaKaRa公司). 1.2方法 1.2.1引物 设计 领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计 与合成根据GenBank公布的 ZrGPD1基因序列设计一对引物P1:5-CCGGAATTCA TGGCCGCTACTGACAGArI-IAACC-3(EcoRI);P2:5. CCGcTAGAGAcccATc1TrGTAAc_3(XhoI). 另根据粉状毕赤酵母URA3基因序列设计一对引物 P3:5-GGAAGATCTAACTCGGACC1]rrCATCTGT-3( ZII):P4:5.GGAAGATCTGGAAGAGGAGGGTA唧GG. 2006,26(8)张洁等:鲁氏酵母3.磷酸甘油脱氢酶基因(zr1)在粉状毕赤酵母中的表达33 3(8glii).以上引物由上海赛百盛生物技术公司 合成. 1.2.2ZrGPD1,URA3基因的克隆ZrGPD1PCR反 应体系:10×buffer5,P1,P2各1,dNTP(2.5mmo~ L)4txl,模板DNA2,TaqDNA聚合酶1补水至总体 积5O.反应条件:95cI=预变性5min,94cI=变性60s, 52cI=退火90s,72cI=延伸120s,30次循环.URA3PCR 反应体系除引物和模板改变外其他加量与上述反应体 系一致.反应条件:95cI=预变性5min,94cI=变性50s, 54cI=退火120s,72cI=延伸90s,30次循环.胶回收和纯 化PCR产物后分别连接到pMD18-T载体上,由上海华 诺公司测序. 1.2.3整合表达载体的构建将目的基因片段分别 从pMD18-T上酶切消化后串连到整合型表达载体 pGAPZA上.转化大肠杆菌JM109,涂布低盐LB平板 (0.5%NaCI,1%蛋白胨,0.5%酵母膏)zeocin 25txg/'ml筛选,经酶切验证后的重组质粒命名为pUR- ZG(图1),DNA重组操作参见文献[7]. 1.2.4粉状毕赤酵母的转化参照EasySelectTM PichiaExpressionKit的说明稍做改进制备粉状毕赤酵 母的感受态细胞.挑单菌落于YEPD液体培养基中, 3OcI=,200r/min振荡培养过夜,次日按1%的接种量转 入50mlYEPD培养基中同样条件培养至?锄=1.0, 1.3,然后将细胞转移至50ml离心管中8000r/min,4cI= 离心15min,弃上清加等体积的预冷无菌水重悬细胞, 离心弃上清,此操作重复2次.然后加入lOml预冷的 lmo~L山梨醇悬浮细胞,在冰上放置5min后离心收集 细胞溶于lml山梨醇转移至1.5ml离心管冰浴备用. 取8Ol感受态细胞与5,1Og经Van91I单酶切线性 化的载体混匀,然后转移到预冷的0.2cm的电转化杯 中,置冰上5min,在电穿孔仪上用脉冲电流电击一次, 电击条件:电压1500V,电容25,电阻200I~.电击 结束,立即加入lml冰预冷的lmo~L山梨醇,混匀转移 至试管,放置3OcI=温育1h后再加1mlYEPD温育1h. 结束后取200菌液涂布在分别含有150txg/ml, 180txg/ml,200;xg/mlZeocin抗生素的YEPD固体培养 基上,置3OcI=恒温培养3,4d. 1.2.5转化子的PCR鉴定石英砂振荡破壁法提 取转化子染色体DNA.分别以转化子和P.farinosa基 因组DNA为模板,P1,P2为引物PCR扩增. 1.2.6稳定转化子的筛选转化子在没有选择压力 的条件下连续传代培养,每1O代使用高浓度的Zeocin 图1整合载体pUR-ZG的构建 Fig.1ConstructionofrecombinantVectorpUR-ZG (200;xg/m1)检测一次剔除不能生长的菌株,经传5O代 后获得遗传稳定性好的菌株命名为pfa—gu. 1.2.7不同盐浓度对菌体生长的影响培养至相同 OD值的pfa-gu和P.farinosa,按1%接种量分别转接 入含不同浓度NaCI的YEPD液体培养基中,振荡培养 12h,检测细胞生物量. 1.2.8重组菌株pfa-gu以葡萄糖为底物摇瓶发酵产 甘油以P.farinosa作为对照菌株,按5%接种量将 pfa.gu和对照菌分别接入含40ml甘油发酵培养基 (25%葡萄糖,1%玉米浆,0.2%尿素)的500ml三角瓶 中,3OcI=,120r/min往复式振荡培养96h,定时取样,采 用高碘酸氧化法测甘油含量. 2结果 2.1目的片段的扩增与序列测定 分别以P_farinosa和Z.rouxii基因组DNA为模 板,PCR扩增得到的目的片段经0.8%琼脂糖凝胶电泳 分析有0.6kb和1.2kb特异性扩增带与预期的符合 (图2,图3).测序分析结果与公布的序列同源性都在 96%左右. 2.2酵母整合表达载体的构建与鉴定 对目的基因序列酶切图谱分析,发现URA3基因中 含有EcoRI酶切位点,因此需要先把ZrGPD1基因用 EcoRI,I从克隆载体pMD18.T上酶切下来,与经相 同限制酶酶切处理的载体pGAPZA连接.获得重组载 体pGAPZA-ZG后再用BglII酶切,去磷酸化后与经相 同酶切消化的URA3基因连接.经酶切鉴定,重组质粒 切下的片段均与预期相符,表明ZrGPD1和URA3已经 连到表达载体pGAPZA上(图4). 中国生物工程杂志ChinaBiotechnologyVo1.26No.82006 2{)oo lf)oo 750 5()0 图2URA3基因的PCR扩增 Fig.2PCRproductsofURA3gene 1,2:PCRproductsofURA3gene;M:DNAMarkerDL2000 2()()0 lf)f】0 750 5()0 图3ZrGPD1基因的PCR扩增 Fig.3PCRproductofZrGPD1gene 1:PCRproductofZrGPD1gene;M:DNAMarkerDI2000 2{)oo l0()o 750 23l30 9416 6557 436l 2322 图4重组载体pUR-ZG的酶切验证 Fig.4Enzymeanalysisofrecombinantplasmid 1:DNAMarkerDL2000;2:pUR—ZG/II;3:pUR—ZG/EcoRI+ XhoI;4:pGAPZA—ZG/BglII;5:7tDNA/HindIIIMarker 2.3重组菌株pfa-gu的PCR验证 转化子pfa-gu正确地扩增出了1.2kb左右的条带 (图5),2和5泳道是没有整合人质粒的空酵母,未能 扩增出明显的特异性条带.胶回收PCR产物测序,测 序结果表明与表达载体上ZrGPD1的序列完全一致. hn12345 2{)oo lf)oo 75O 图5重组菌株pfa-gu的PCR验证 Fig.5Identificationofpfa?gubyPCR 1:DNAMarkerDL2000;2,5:Pfarinosatransformedwithout pUR—ZG;3.4:PfarinosatransformedwithpUR—ZG 2.4不同盐浓度对重组菌株与野生菌生长影响 在低浓度NaCI中重组菌生长优势不是很明显,当 NaCI浓度达到10%以上,重组菌细胞密度高于野生菌 细胞密度(图6).把培养至对数期的菌液稀释100倍 各取5l点样在含10%和16%NaCI的YEPD平板上, 菌落形态如图7. 507080901()0l20l40l60 NaCl(g/L) []pfa-gu口P.1aHnosa 图6不同盐浓度对菌体生长的影响 Fig.6Thegrowthofpfa-guandfarinosa under憾rentsaltconcentration 2.5重组菌株pfa-gu以葡萄糖为底物发酵产甘油 发酵过程每隔8h取样,对发酵液中的甘油含量, 98765432?O _ffJ 2006,26(8)张洁等:鲁氏酵母3.磷酸甘油脱氢酶基因(zPD1)在粉状毕赤酵母中的表 达35 pfa—gu 图7在不同盐浓度YEPD平板上的菌落 Fig.7pfa-guandfarinosawereplatedon YEPDunderdifferentsaltconcentration 菌体干重进行测定,结果如图8,9. 图8发酵液中甘油的累积 Fig.8Accumulationofextracellularglycerol 图9生长曲线 Fig.9Curvesofcellgrowth 3讨论 日本学者首次从耐高盐鲁氏酵母中克隆了 ZrGPD1基因,与S.cerevisiae一样在Z.rouxii中同样也 存在着GPD1和GPD2这两种同功酶.不同的是 ZrGPD1在胞内是组成型表达的,不受外界渗透压胁迫 的调控J.在S.cerevisiae(GPD1AGPD2A)中异源表 达ZrGPD1,结果使得该突变株的耐渗透压性能和甘油 合成能力均有了提高,其提高后的水平与亲本株基本 一 致u...据我们所知,目前还没有关于在粉状毕赤酵 母中表达该基因的报道.本课题采用毕赤酵母整合型 表达载体pGPAZA,以URA3作为同源整合介导区,在 野生型粉状毕赤酵母中表达了该基因.结果显示重组 菌能在相对较高的盐浓度下正常生长.重组菌和对照 菌,摇瓶发酵72h后测得重组菌发酵液中的甘油含量 是对照菌的1.3倍为37g/L.这表明ZrGPD1基因的表 达对促进野生型粉状毕赤酵母甘油的合成和对抗外界 高渗透压环境有积极作用.重组菌在发酵前期比野生 菌具有更高的生物量,可能是在发酵早期,发酵液中具 有较高的葡萄糖含量,渗透压相对较高,由于重组菌比 野生菌积累了更多的甘油,所以提高了它对高渗环境 的适应能力.另外甘油发酵培养基中葡萄糖的浓度也 影响发酵液中甘油的积累.当葡萄糖浓度较低时,重 组菌与野生菌发酵液中甘油含量接近且处于较低水 平;当葡萄糖浓度为25%时,重组菌的甘油产量有了明 显提高而野生菌的甘油产量并没有太大提高;当糖浓 度在30%以上时,重组菌的甘油产量有一定提高但是 发酵时间延长. 甘油代谢途径中的另外一个相关酶基因GPP,它 也有两个同功酶基因(GPP1和GPP2),能催化3一磷酸 甘油脱磷酸根形成甘油,是甘油合成途径的最后一个 酶促反应.GPP酶活水平过低将使甘油合成的代谢流 不畅通,3.磷酸甘油可进入脂质合成或经FAD+依赖性 3磷酸甘油脱氢酶脱氢成磷酸二羟丙酮,重新进人三羧 酸循环或EMP途径.GPP活性高低也影响着甘油合 成.我们已经克隆了耐高盐鲁氏酵母的ZrGPP1,为以 后在粉状毕赤酵母(已整合ZrGPD1)中整合表达 GPP1,进一步考察对甘油积累的影响打下基础. 参考文献 [1】诸葛健,方慧英.发酵法生产甘油的研究进展.食品与发酵 工业,1994.6(4):65,69 ZhllgeJ,FangHY.FoodandFermentationIndustries,1994,6 (4):65,69 [2]GarthR,Cronwright,JohannM,etalMetaboliccontrol analysisofglycerolsynthesisinSaccharomycescerevisiae. 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FEMSYeastReasearch,2004,4:505—510 ZHANGJieCHENXian?-zhongSHENGWeiTANGXue?-mingZHUGe-jian (TheKeyLaboratoryofIndustriMBiotechnologyMinistryofEducation,ScuthemYangtzeUniversityWuxi214036,China) AbstractToexaminetheeffectsofheterologousexpressionofZrGPD1(encodingglycerol3-phosphate dehydrogenase)clonedfromosmotolerantyeastZygosacharomycesrouxiionglycerolproductioninwildPichia farinosa,theURA3genewasamplifiedfromP.farinosaasthehomologyintegrativeregion.Arecombinant plasmid(pUR— ZG)WasconstructedthentransformedintoP.farinosabyelectroporation.Thetransformantpfa? guwasobtainedbytheselectablemarkerZeocinTM.Primaryresultsshowedthatthebiomassofpfa—guWashigher thanthewildtypeintheflaskandafter72hfermentationtheconcentrationofglycerolofpfa— guWas37g/L enhanced30%incomparisonwiththewildtype.ItisconcludedthatheterologousexpressionofZrGPD1isuseful forincreasingglycerolproductionandtheabilityofosmoregulationinP.farinosa. KeywordsGlycerolGlycerol3-phosphatedehydrogenaseOsmotolerantyeastZygosaccharomycesrouxii Integrativeexpression